摘要：鵝痛風(fēng)是雛鵝常見的代謝性疾病，常因?yàn)椴≡w感染，中毒，營(yíng)養(yǎng)攝入等因素導(dǎo)致鵝體內(nèi)尿酸（Uric acid，UA）代謝障礙，引發(fā)病鵝內(nèi)臟和關(guān)節(jié)處大量尿酸鹽蓄積，導(dǎo)致雛鵝死亡。為了能夠快速診斷鵝痛風(fēng)，減少養(yǎng)鵝業(yè)的損失，本研究通過(guò)建立高鈣高蛋白的雛鵝痛風(fēng)模型，制備尿酸干化學(xué)試紙條檢測(cè)雛鵝尿酸水平，并進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，飼喂高鈣高蛋白飼料的雛鵝在7日齡時(shí)，血液尿酸含量顯著升高（Plt;0.05），但仍處于正常水平（UA≤200 μmol/L）；14日齡時(shí)，飼喂高鈣高蛋白飼料的雛鵝血液尿酸含量遠(yuǎn)高于正常水平（UA≥400 μmol/L）。本研究制備的鵝痛風(fēng)尿酸快速檢測(cè)試紙可通過(guò)與血液中尿酸反應(yīng)，區(qū)分血液尿酸含量，達(dá)到快速診斷的效果。

關(guān)鍵詞：鵝痛風(fēng)；尿酸；檢測(cè)試紙

鵝痛風(fēng)癥（Gosling gout），是以內(nèi)臟和關(guān)節(jié)尿酸鹽沉積為特征的代謝性疾病。鵝痛風(fēng)的發(fā)病原因復(fù)雜，多由日糧中高鈣高蛋白的攝入、日糧霉變、長(zhǎng)期服用磺胺類藥物等非傳染因素引起。近年來(lái)，雛鵝痛風(fēng)癥的臨床高死亡率使之成為嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。2017 年以來(lái)，雛鵝痛風(fēng)癥迅速傳遍全國(guó)主要產(chǎn)鵝區(qū)。該病主要侵害 21 日齡以內(nèi)的雛鵝，各品種的鵝均易感染，鵝群感染率高達(dá) 80%～90%，若不及時(shí)治療，死亡率可達(dá) 20%～70%，給我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前尚無(wú)有效的方式用于預(yù)防，預(yù)防該病關(guān)鍵是飼養(yǎng)管理。鵝痛風(fēng)癥的病因較復(fù)雜，凡能引起腎小管損傷和嘌呤代謝障礙的因素均可能引起痛風(fēng)的發(fā)生，但導(dǎo)致鵝痛風(fēng)發(fā)生的主要機(jī)理是由于尿酸鹽過(guò)多沉積導(dǎo)致的[2]。本研究通過(guò)制備尿酸干化學(xué)法試紙條，通過(guò)檢測(cè)雛鵝血清尿酸（Uric acid，UA），快速確定雛鵝尿酸水平，對(duì)鵝痛風(fēng)進(jìn)行早期診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只0日齡雛鵝購(gòu)自平頂山市湛河區(qū)祥鵬養(yǎng)殖中心。

2）試驗(yàn)耗材：尿酸標(biāo)準(zhǔn)液，辣根過(guò)氧化物酶（HRP），4-氨基安替吡啉（4-APP），抗壞血酸氧化酶（200 U/mg），過(guò)氧化物酶（230 U/mg），尿酸氧化酶（10 U/mg），N-乙基-N-（2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽（TOOS）。

1.2 雛鵝痛風(fēng)模型的建立

1）動(dòng)物分組與飼養(yǎng)。試驗(yàn)將30只0日齡雛鵝隨機(jī)分為兩組，每組15只。其中對(duì)照組（Con）雛鵝飼喂日常飼料，模型組（Mod）雛鵝飼喂高鈣高蛋白飼料（見表1），所有雛鵝自由采食飲水。在持續(xù)飼養(yǎng)14 d，期間記錄雛鵝體重、日采食量、料肉比等生長(zhǎng)指標(biāo)。于7 d和14 d時(shí)對(duì)雛鵝進(jìn)行抽血分離血清用于尿酸檢測(cè)。在14 d對(duì)雛鵝進(jìn)行病理解剖。在試驗(yàn)過(guò)程中記錄雛鵝死亡數(shù)目，若有雛鵝死亡，立即除去死亡雛鵝的體重和采食量，以免對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

2）尿酸檢測(cè)。使用南京建成生物尿酸測(cè)試盒（UA Test Kit），利用尿酸在堿性狀態(tài)下還原磷鎢酸生成鎢藍(lán)、尿囊素和二氧化碳，藍(lán)色深淺與尿酸濃度成正比例，通過(guò)紫外光分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 690 nm、1 cm 光徑、空白管調(diào)零，測(cè)定吸光度值計(jì)算尿酸含量。UA濃度（μmol/L）=（測(cè)定樣品 OD 值-空白 OD 值）*校準(zhǔn)樣品濃度（297.4 μmol/L）/（校準(zhǔn)樣品測(cè)定 OD 值-空白 OD 值）

1.3 鵝尿酸快速檢測(cè)制備與驗(yàn)證

利用尿酸在 O2 和尿酸氧化酶的催化下，生成尿囊素和 H2O2 以及CO2[4]，所產(chǎn)生的 H2O2 與 4-APP 和 TOOS 在 HRP 的催化下生成紅色醌亞胺化合物，其生成量與樣品中 UA 的濃度成正比。利用標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行標(biāo)定，可制作鵝尿酸快速檢測(cè)試紙。

1）反應(yīng)試劑配制。尿酸標(biāo)準(zhǔn)液配制：制備200、400、600、800和1 000 μmol/L尿酸標(biāo)準(zhǔn)。

試劑A：取過(guò)氧化物酶（250 U/mg）0.8 mg，4-氨基安替吡啉（4-APP）6mg，抗壞血酸氧化酶0.4 mg，使用Tris-Hcl 緩沖液調(diào)節(jié)pH值到7.6定容到100 mL，使過(guò)氧化物酶gt;1800U/L，4-APP終濃度為0.3 mmol/L，抗壞血酸酶≥800 U/L。

試劑B：取尿酸氧化酶（10 U/mg）6 mg，N-乙基-N-（2-羥基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺鈉鹽（TOOS）41 mg使用Tris-Hcl緩沖液調(diào)節(jié)pH到8.5定容到100 mL使尿酸氧化酶濃度 ≥600 U/L，且TOOS濃度為1.4 mmol/L[5]。

2）尿酸檢測(cè)試紙反應(yīng)層制備。將雜交定量吸附濾紙?jiān)谠噭〢與試劑B比例為1∶1的尿酸干化學(xué)法試紙條浸漬液中充分浸漬 1 min 后取出，放入一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于 4 ℃ 冰箱里避光干燥 48 h。重復(fù)浸漬、干燥程序兩次，再將其固定在卡紙上[3]。

3）尿酸檢測(cè)試紙條比色卡制作。向制備好的尿酸試紙上分別滴加0、200、400、600、800和1 000 μmol/L的尿酸標(biāo)準(zhǔn)液，反應(yīng)2 h，對(duì)比試紙條顏色，制作試紙條比色卡。

4）尿酸檢測(cè)試紙條效果檢測(cè)。使用制備好的尿酸檢測(cè)試紙條對(duì)14日齡雛鵝血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)3次，反應(yīng)2 h后，與制作好的比色卡進(jìn)行顏色對(duì)比，并對(duì)每個(gè)樣品血尿酸含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)。結(jié)果以處理平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，P＜0.05判定為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 雛鵝生長(zhǎng)指標(biāo)

對(duì)兩組雛鵝生長(zhǎng)性能進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)7日齡時(shí)，模型組雛鵝體重和平均日增重較對(duì)照組顯著增加（Plt;0.05），而平均日采食量和料重比差異不顯著（Pgt;0.05）；14日齡時(shí)，模型組雛鵝的平均體重，平均日增重，平均采食量均顯著低于對(duì)照組（Plt;0.05），料重比差異不明顯（Pgt;0.05），模型組雛鵝死亡3只，存活率為80%。

2.2 雛鵝臨床檢查

試驗(yàn)第7天，Con組和Mod組鵝較為正常，食欲較好。試驗(yàn)第9天，Mod組鵝出現(xiàn)精神沉郁，食欲不佳，排便較稀，并伴有白色尿酸鹽等癥狀。試驗(yàn)第11天，Mod組出現(xiàn)死亡，共死亡3只，剖解結(jié)果發(fā)現(xiàn)，死亡原因是內(nèi)臟型痛風(fēng)。

2.3 雛鵝血清尿酸檢測(cè)結(jié)果

如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組雛鵝 7 日齡和14日齡時(shí)，尿酸含量均顯著升高（Plt;0.05），其中7日齡時(shí)，兩組雛鵝血尿酸均低于400 μmol/L，且雛鵝并未表現(xiàn)出鵝痛風(fēng)癥狀；而在14日齡時(shí)，模型組雛鵝血尿酸濃度高于400 μmol/L，且雛鵝出現(xiàn)明顯痛風(fēng)癥狀。

2.4 尿酸檢測(cè)試紙條反應(yīng)效果

使用不同濃度尿酸標(biāo)準(zhǔn)液與試紙條反應(yīng)，隨著尿酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度的增加，尿酸干化學(xué)法試紙條反應(yīng)后的顏色更深，且顏色呈現(xiàn)梯度變化（圖3）。

2.5 尿酸試紙條檢測(cè)鵝尿酸結(jié)果

使用尿酸試紙條檢測(cè)每只雛鵝血尿酸，并統(tǒng)計(jì)為表3。結(jié)果顯示，對(duì)照組雛鵝血尿酸含量主要集中在0～400 μmol/L之間，其中血尿酸濃度在0～200 μmol/L之間樣本共12只，占80.00%；血尿酸濃度在200～400 μmol/L之間樣本共3只，占20%。而模型組雛鵝血尿酸含量在400～800 μmol/L之間，其中血尿酸濃度在400～600 μmol/L之間的樣本共10只，占83.33%；血尿酸濃度在600～800 μmol/L的樣本共2只，占16.67%，與尿酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果基本相符。

3 討論

本研究通過(guò)高鈣高蛋白飼料飼喂雛鵝制作雛鵝痛風(fēng)模型。在飼養(yǎng)過(guò)程中，雛鵝前7日體重增長(zhǎng)速度較快，而到11日齡時(shí)體重增長(zhǎng)顯著減緩，雛鵝精神沉郁，且剖檢發(fā)現(xiàn)有明顯的尿酸鹽沉積。鵝痛風(fēng)癥可根據(jù)尿酸鹽沉積部位不同劃分為內(nèi)臟型痛風(fēng)、關(guān)節(jié)型痛風(fēng)和混合型痛風(fēng)三種類型，其中內(nèi)臟型痛風(fēng)，主要見于1～15 d雛鵝，多呈群體急性發(fā)作，臨床典型癥狀表現(xiàn)為厭食、體溫升高、排白色稀糞，泄殖腔周圍黏附白色或黃色的尿酸鹽結(jié)晶，受持續(xù)感染的雛鵝因腎臟功能損傷，致使多臟器逐漸衰竭而死，這與本試驗(yàn)中模型組雛鵝癥狀一致。

根據(jù)14日齡的尿酸檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鈣高蛋白模型組雛鵝血清種尿酸水平均高于400 μmol/L，而對(duì)照組的雛鵝血清尿酸水平均低于400 μmol/L。正常生理狀態(tài)下，禽類血清尿酸水平在1.5～3.0 mg/dL的范圍之間（約為100～200 μmol/L）。而當(dāng)血尿酸超過(guò)6.4 mg/dL（約400 μmol/L）時(shí)，體內(nèi)易發(fā)生尿酸鹽沉積，引發(fā)痛風(fēng)[6]。在一例使用高蛋白日糧誘導(dǎo)雛鵝痛風(fēng)的研究中，飼喂含24%粗蛋白的雛鵝出現(xiàn)相似的鵝痛風(fēng)癥狀，在10日齡時(shí)模型組并未表現(xiàn)出異常癥狀，而到14日齡時(shí)，其鵝痛風(fēng)模型組血尿酸含量為600～1 000 μmol/L[7]，證明在高蛋白誘導(dǎo)的鵝痛風(fēng)模型中，尿酸鹽沉積主要發(fā)生在10～14日齡時(shí)期，同時(shí)血尿酸含量高于400 μmol/L。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)使用終點(diǎn)平衡尿酸氧化酶法制作的尿酸干化學(xué)法試紙，具有成本低廉，檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。本研究制備的尿酸干化學(xué)法試紙可用于鵝痛風(fēng)的初步診斷，當(dāng)雛鵝血清尿酸含量檢測(cè)超過(guò)比色卡400 μmol/L時(shí)，可判定為患有鵝痛風(fēng)?？杉涌炫R床診斷雛鵝痛風(fēng)，減少養(yǎng)鵝業(yè)的損失。

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