摘 要：目的：建立氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定石斑魚中丁香酚殘留量的方法，并對丁香酚在石斑魚內(nèi)的消解規(guī)律進(jìn)行研究。方法：樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，DB-5毛細(xì)管柱分離，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，外標(biāo)法定量。結(jié)果：丁香酚在10～200 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)大于0.999 0；檢出限和定量限分別為5 μg·kg-1和10 μg·kg-1；添加濃度為10～100 μg·kg-1時，平均加標(biāo)回收率在99.3%～111.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.12%～7.54%。結(jié)論：本方法前處理操作簡單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，適用于石斑魚中丁香酚殘留量的檢測。丁香酚在石斑魚中前3 d消除較快，隨著時間的推移，消除速率趨于平緩。

關(guān)鍵詞：石斑魚；檢測方法；消除規(guī)律

Study on the Detection Method and Elimination Pattern of Residual Eugenol in Grouper

WANG Anwei1， WU Lili2， LIU Tianmi1*， LIN Yi1， LAI Changsheng1

（1.Testing Center of Aquatic Product Quality Safety of Hainan Province， Haikou 570206， China; 2.Hainan Technician College Food Department， Haikou 570206， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of eugenol residues in grouper by gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry and to study the digestion law of eugenol in grouper. Method： The samples were extracted with ethyl acetate and separated on a DB-5 capillary column. The samples were quantified by external standard method in multiple reaction monitoring mode. Result： Eugenol had good linear relationship in the concentration range of 10～200 ng·mL-1， with a linear coefficient greater than 0.999 0. The limits of detection and quantification were 5 μg·kg-1 and 10 μg·kg-1， respectively. When the concentration was 10～

100 μg·kg-1， the average spike recovery was 99.3%～111.4%， and the relative standard deviation was 1.12%～

7.54%. Conclusion： This method has simple pretreatment operation， high sensitivity and good reproducibility， and is suitable for the detection of eugenol residues in grouper. Eugenol was eliminated rapidly in grouper within the first

3 days， and the elimination rate tended to be slow over time.

Keywords： grouper; detection method; elimination pattern

丁香酚作為一種麻醉劑，對淡水魚、海蝦等鮮活水產(chǎn)品具有非常好的麻醉效果，常應(yīng)用于水產(chǎn)品收買、貯存和運送環(huán)節(jié)[1-5]。但長期食用含丁香酚的水產(chǎn)品可能對人體健康構(gòu)成潛在的風(fēng)險，因此美國已將其列入第3類致癌物[6]。

目前，測定水產(chǎn)品中丁香酚殘留量的方法有高效液相色譜法（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）[7-9]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）[10-11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）[12-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18]等。本研究旨在開發(fā)一種以渦旋振蕩提取結(jié)合低溫高速離心的凈化方式，通過樣品前處理、色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立一種檢測石斑魚中丁香酚殘留量的GC-MS/MS檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用石斑魚，均購自?？谑修r(nóng)貿(mào)市場；乙酸乙酯（色譜純），德國默克公司；有機相針式濾器（尼龍，0.22 μm），上海安譜實驗科技股份有限公司；丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1），天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000D氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫公司；AutoVAP S60全自動高通量透明可視化多樣品自動濃縮儀，美國ATR公司；RechBio-GLF三維研磨離心冷凍一體機，上海瑞茋生物科技有限公司；DL-6000B離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

對石斑魚進(jìn)行去鱗后，取其肌肉或可食用部分進(jìn)行均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.002 g）均質(zhì)后的樣品，置于50 mL離心管中。加入3 mL乙酸乙酯，渦旋混合10 min，以6 000 r·min-1冷凍離心10 min，取上清液1 mL經(jīng)0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

取1 mg·mL-1的丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙酸乙酯稀釋成濃度為1 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別量取濃度為1 000 ng·mL-1的丁香酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 μL、20 μL、40 μL、100 μL、200 μL于1 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度線，得到所需系列標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），高純He（≥99.999%）；流速：1.0 mL·mL-1；進(jìn)樣體積：2 μL；不分流模式進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；柱溫箱溫度：80 ℃；升溫過程：80 ℃停留2 min，以40 ℃·min-1上升到250 ℃，保留5.75 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；輔助加熱：280℃；隔墊吹掃流量：3.0 mL·mL-1；分流口吹掃流量：10 mL·mL-1；溶劑延遲：3.75 min；增益因子：1.0；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）?；衔锉O(jiān)測參數(shù)見表1。

1.5 石斑魚中丁香酚消解規(guī)律研究

對石斑魚空白樣品進(jìn)行低濃度（20 μg·kg-1）、中濃度（50 μg·kg-1）、高濃度（100 μg·kg-1）加標(biāo)，每個濃度平行加標(biāo)6次；分別在5 ℃和-18 ℃狀態(tài)下放置0 d、1 d、3 d、6 d、10 d、16 d進(jìn)行測定，取6個平行數(shù)據(jù)的平均值，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

分別用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷4種有機溶劑進(jìn)行提取，對其應(yīng)用效果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，用正己烷提取時，回收率較低；用甲醇和乙腈提取時，石斑魚肉樣品易結(jié)塊，提取液雜質(zhì)較多不利于后期凈化，基線較高，色譜峰有拖尾，回收率起伏較大；用乙酸乙酯提取時，峰形比較理想，無雜質(zhì)峰干擾，回收率好。因此，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。提取液經(jīng)300 mg/3 mL的固相萃取柱（C18）凈化后，峰形與用乙酸乙酯提取相比并沒有得到顯著改善，且用外標(biāo)法定量時回收率顯著降低。故經(jīng)綜合考慮，用乙酸乙酯提取后直接上機進(jìn)行檢測。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將濃度為100 ng·mL-1的丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液自動進(jìn)樣，分別在選擇離子監(jiān)測和多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行質(zhì)譜掃描。結(jié)果顯示，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下丁香酚信號較強，故選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式。分別設(shè)定母離子的碰撞能為5 eV、10 eV、15 eV、30 eV、40 eV進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示離子對的碰撞能在10 eV時信號最優(yōu)，故離子對的碰撞能設(shè)定為10 eV。

2.3 方法檢出限、定量限及線性范圍

采用儀器自帶的數(shù)據(jù)處理軟件對采集的丁香酚質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、色譜圖及總離子流圖，見圖1、圖2、圖3。在10～200 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性方程為y=184.171 295x-55.745 702（r2＝0.999 9），線性符合要求；按照3倍信噪比、10倍信噪比濃度計算得到檢出限和定量限分別為5 μg·kg-1和10 μg·kg-1。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價

本研究采用提取后基質(zhì)匹配添加法評價基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）。結(jié)果顯示，ME值為99.8%，表明選用的樣品制備條件滿足水產(chǎn)品丁香酚殘留檢測的需要，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性影響比較小，定量過程不需要基質(zhì)加標(biāo)工作曲線進(jìn)行校正。

2.5 回收率與精密度

根據(jù)本研究實驗方法，對空白石斑魚基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，測定丁香酚添加濃度為10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個水平做6次重復(fù)試驗，外標(biāo)法計算，結(jié)果見表2。回收率為99.3%～111.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%～7.54%，說明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.6 實際樣品測定

本研究從海南省海口市、瓊海市、萬寧市的農(nóng)貿(mào)市場和石斑魚收購點抽取石斑魚100份，采用本方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，有29份石斑魚樣品檢出丁香酚成分，檢出率為29%，含量在11.2～3 520.7 μg·kg-1。

3 石斑魚中丁香酚消解規(guī)律

如圖4所示，在5 ℃環(huán)境下，低、中、高濃度在第3天的回收率分別為62.0%、36.1%、43.0%；在20 μg·kg-1時，第6天檢測值低于檢出限；在50 μg·kg-1時，第10天檢測值低于檢出限；在100 μg·kg-1時，第16天檢測值回收率為30%。在-18 ℃環(huán)境狀態(tài)下，低、中、高濃度在第3天的回收率分別為62.0%、59.6%、56.5%；在20 μg·kg-1時，第10天檢測值低于檢出限；在50 μg·kg-1時，第16天檢測回收率為33.5%；在100 μg·kg-1時，第16天檢測值回收率為37.3%。

綜上，不同濃度、不同溫度狀態(tài)下石斑魚中丁香酚回收率隨著時間的延長逐漸降低，降低速率也逐漸趨于緩慢；回收率在5 ℃環(huán)境狀態(tài)下降低幅度比在-18 ℃環(huán)境狀態(tài)下大。由此可見，丁香酚消解速率隨溫度的降低而減慢。同一溫度下，在前3 d內(nèi)丁香酚消解的速度很快，隨著時間的推移，消解的速率變緩。

4 結(jié)論

本研究建立了一種石斑魚中丁香酚殘留量的檢測方法，該方法前處理簡單、快速，準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限較低，基本滿足對石斑魚中丁香酚殘留量的快速檢測。丁香酚在石斑魚中殘留量隨著時間推移，其含量急劇下降，在5 ℃環(huán)境狀態(tài)下回收率降低速率比在-18 ℃環(huán)境狀態(tài)下更快，3 d后下降速率趨于平緩，在添加濃度為100 μg·kg-1時，16 d后依然能檢出丁香酚。

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