摘要：本研究選取59份來源不同的苜蓿種質(zhì)種子為試材，分析不同種質(zhì)問種子表型性狀的遺傳變異，基于數(shù)字圖像系統(tǒng)得出并分析其種子長(zhǎng)、種子寬、長(zhǎng)寬比、種子周長(zhǎng)、種子形狀系數(shù)、百粒重和種子厚共7個(gè)種子形態(tài)指標(biāo)，進(jìn)而結(jié)合種子形態(tài)指標(biāo)評(píng)估不同種質(zhì)種子表型性狀的基因型方差分量、表型方差分量、基因型方差系數(shù)、表型方差系數(shù)、廣義遺傳力和遺傳增益。結(jié)果表明，59份苜蓿種質(zhì)問的種子表型性狀均存在極顯著差異（P＜0．01），表型性狀的變異系數(shù)在1. 87% - 35. 18%之間。各種子表型性狀中，百粒重的表型方差系數(shù)（PCV）、基因型方差系數(shù)（GCV）值均最大，百粒重和種子厚的廣義遺傳力（H2b）分別位于第一和第二位。各表型性狀之間存在顯著相關(guān)性（P＜0.05）。通過聚類熱圖分析看出，當(dāng)歐式距離為50時(shí)，59份苜蓿種質(zhì)可分成三大類群。結(jié)合遺傳力和遺傳增益對(duì)59份苜蓿種質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，綜合性狀優(yōu)良種質(zhì)的編號(hào)分別為712（WL712）、440（WLA40HQ）、5（維多利亞）、28、801（巨能801）、525（WL525HQ）和21（無棣苜蓿）。綜上，59份苜蓿種質(zhì)種子具有豐富的遺傳多樣性。本研究結(jié)果可為苜蓿種質(zhì)種子性狀改良、選種育種提供一定理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：苜蓿；種子性狀；表型變異；遺傳力；綜合評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S541.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）10-0034-09

苜蓿（Medicago sativa L．）是全球廣泛栽培的豆科牧草，在我國(guó)主要分布于西北五省及西藏、內(nèi)蒙古等地區(qū)，西南貴州海拔1 000 -1 800m的地區(qū)也有少量分布。紫花苜蓿、黃花苜蓿和雜交苜蓿等是幾種常見的苜蓿屬植物。紫花苜蓿（M. sativa）是多年生豆科牧草，具有分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等眾多優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”和“綠色黃金”。黃花苜蓿（M.falcata）是紫花苜蓿的近緣野生種，具有抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)高等特點(diǎn)，廣泛種植于自然條件較惡劣的地區(qū)。雜交苜蓿又名雜花苜蓿，是由紫花苜蓿、膠質(zhì)苜蓿（M. glutinosa）和黃花苜蓿雜交產(chǎn)生的復(fù)合體，該物種攜帶有大量的遺傳變異基因，兼具親本的許多優(yōu)良性狀，是研究遺傳多樣性的優(yōu)良植物。苜蓿種子表型性狀多樣性是種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的重要組成部分，但以往對(duì)其的研究相對(duì)較少。

植物種子表型性狀作為重要的經(jīng)濟(jì)性狀，是物種遺傳多樣性的重要基礎(chǔ)，而種子形態(tài)對(duì)生產(chǎn)中的產(chǎn)量獲得起到重要作用。種子性狀包括大小、質(zhì)量等，在植物野生種源開發(fā)、選種育種等方面有廣泛的研究?jī)r(jià)值。種子與植物其他器官相比，具有形態(tài)更穩(wěn)定、易收集、儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，此外，種子大小與幼苗發(fā)芽特性、生長(zhǎng)速度、存活率以及植物發(fā)育過程密切相關(guān)，對(duì)種群更新和其環(huán)境適應(yīng)性都有重要意義。李鴻雁等研究表明，不同生態(tài)型扁蓿豆種子性狀之間存在顯著差異，具有豐富的遺傳多樣性。陸忠杰等通過分析75份箭筈豌豆（Vicia sativa L．）種子形態(tài)遺傳多樣性，篩選出4個(gè)對(duì)遺傳改良具有重要意義的特殊種質(zhì)。由此看出，對(duì)種子表型遺傳變異進(jìn)行分析顯得尤為重要，關(guān)于種子形態(tài)研究已日益受到研究者的重視。WinFOLIA 2014是一種專門用于分析植物葉片和種子表型的數(shù)字圖像分析系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的人工測(cè)量法相比，該系統(tǒng)配置光學(xué)掃描儀，能夠產(chǎn)生沒有誤差的高分辨率數(shù)字圖像，進(jìn)而更加精確地自動(dòng)檢測(cè)并分析植物種子的多項(xiàng)表型性狀指標(biāo)。Dong等利用該系統(tǒng)研究了537份箭箐豌豆種質(zhì)種子的表型性狀，表明種質(zhì)問的種子表型性狀存在顯著差異：楊正禹等以132份胡枝子屬種質(zhì)種子為材料，基于數(shù)字圖像評(píng)估了胡枝子種子形態(tài)特征和基因型存在的顯著關(guān)聯(lián)性。

本研究以59份苜蓿種質(zhì)種子為材料，基于數(shù)字圖像對(duì)種子形態(tài)特征進(jìn)行多樣性分析，并評(píng)估分析59份苜蓿種質(zhì)種子表型性狀的方差分量、遺傳力和遺傳增益，繼而對(duì)59份苜蓿種質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)西南喀斯特山區(qū)選擇優(yōu)良基因型苜蓿種子用于生產(chǎn)和苜蓿種質(zhì)遺傳改良研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試59份苜蓿種質(zhì)種子，48份為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所國(guó)家牧草種質(zhì)中期庫提供，剩余11份（1、2、3、4、5、343、366、440、525、712和801）為貴州眾志恒生態(tài)科技有限公司和北京正道種業(yè)科技有限公司提供（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

本研究于2022年7月對(duì)54份紫花苜蓿種質(zhì)種子、3份雜交苜蓿種質(zhì)種子和2份黃花苜蓿種質(zhì)種子進(jìn)行分析，共測(cè)定7個(gè)種子性狀指標(biāo)，分別為種子長(zhǎng)（seed length）、種子寬（seed width）、長(zhǎng)寬比（width to length ratio）、種子周長(zhǎng)（perimeter）、種子形狀系數(shù)（forrn coe伍cient）、百粒重（100 -seed weight）和種子厚（seed thickness）。除種子百粒重為100粒種子重量外，其余性狀均為每份種質(zhì)測(cè)量90粒種子，重復(fù)3次。掃描期間實(shí)驗(yàn)室保持20℃和20%的相對(duì)濕度，以避免種子形態(tài)發(fā)生顯著變化。

使用光學(xué)平板掃描儀（V800 PHOTO，Epson，日本）對(duì)每份種質(zhì)種子進(jìn)行掃描，獲得種子圖像，圖像分辨率為300 dpi，像素為1 024×1 024。之后使用數(shù)字圖像分析系統(tǒng)（WinFOLIA 2014，加拿大）對(duì)種子圖像進(jìn)行分析，得到種子長(zhǎng)、種子寬、長(zhǎng)寬比、種子周長(zhǎng)、種子形狀系數(shù)。使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺（AIRAI SR44，精度0.01 mm，中國(guó)）測(cè)量種子厚。電子天平（Mettler Toledo-MS204S，精度0.000 0 g，瑞士）稱量種子百粒重。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用Origin Pr0 2021軟件（OriginLab，美國(guó)）作圖，并使用Genstat 22nd軟件（VSN International，英國(guó)）進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，并對(duì)種子性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，基于單因素方差分析（One - WayANOVA）的最小顯著性檢驗(yàn)（LSD）法得到性狀平均值（Mean）。基于均值利用OriginPro 2021軟件的模式聚類分析，通過控制數(shù)據(jù)質(zhì)量以圖像方式直觀展示本研究中59份種質(zhì)種子表型數(shù)量性狀的差異變化情況，選用基于平方歐氏距離的最長(zhǎng)距離法對(duì)59份種質(zhì)種子表型性狀指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。為了消除量綱對(duì)聚類關(guān)系的影響，種質(zhì)種子性狀數(shù)據(jù)通過。值標(biāo)準(zhǔn)化后再進(jìn)行聚類，其中，。值標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算公式如下：

x*=x- -x/σ。（1）

式中，x*為z值標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值，x為原數(shù)值，-x為樣本均值，σ為樣本標(biāo)準(zhǔn)差。

在GenStat 22nd軟件中使用基于殘差最大似然（residual maximum likelihood，REML）的混合線性模型進(jìn)行方差分量分析，得到基因型方差分量（δ2g）和實(shí)驗(yàn)誤差方差分量（δ2e）。表型方差系數(shù)（PCV）和基因型方差系數(shù)（GCV）通過從各自的方差分量得出的值計(jì)算。根據(jù)Johnson等的研究，表型方差分量（δ2p）、廣義遺傳力（H2b）、PCV和GCV的計(jì)算方式如下：

表型方差分量（8：）計(jì)算公式[19]：

δ2p=δ2g+δ2e/r。（2）

式中，r為重復(fù)次數(shù)。

廣義遺傳力（H2b）計(jì)算公式：

H2b（%）=δ2g/δ2p×100。（3）

表型方差系數(shù)（PCV）計(jì)算公式：

PCV（%）=根號(hào)下δ2p/Mean×100。（4）

式中，Mean代表種子某一表型性狀的平均值。

基因型方差系數(shù)（GCV）計(jì)算公式：

GCV（%）=根號(hào)下δ2g/Mean×100。（5）

式中，Mean代表種子某一表型性狀的平均值。

采用布雷金多性狀綜合評(píng)價(jià)法對(duì)種子表型性狀進(jìn)行綜合評(píng)定，公式為：

式中，ai=Xij／Xjmax，Xij代表種子某一性狀的平均值，Xjmax代表種子某一性狀的最優(yōu)值。

遺傳增益ΔG計(jì)算公式：

ΔG（%）=H2b×S/Mea×100。（7）

式中，s為選擇差，為種質(zhì)種子性狀的平均值與選擇群體性狀平均值的差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 59份苜蓿種質(zhì)種子表型性狀多樣性分析

59份苜蓿種質(zhì)種子表型性狀的分析結(jié)果（表2）表明，各種質(zhì)問的種子表型性狀均存在極顯著差異（P＜0.01）。除種子形狀系數(shù)、百粒重和種子厚外，其余種子表型性狀的變異系數(shù)（CV）均大于10%，種子長(zhǎng)寬比的最大，為35. 18%，百粒重的最小，為1 .87%。

2.2 59份苜蓿種質(zhì)種子表型性狀相關(guān)遺傳變異系數(shù)和廣義遺傳力評(píng)估

對(duì)59份苜蓿種質(zhì)種子的基因型方差分量（δ2g）、表型方差分量（δ2p）、實(shí)驗(yàn)誤差方差分量（δ2e）、表型方差系數(shù)（PCV）、基因型方差系數(shù)（GCV）和廣義遺傳力（H2b）的分析結(jié)果（表3）表明，PCV和GCV值分別在4.18% - 27. 66%和1.11% - 27.30%之間，各種子表型性狀中百粒重的PCV和GCV均最大。所有性狀中百粒重的H2b值最大，達(dá)99.87%；種子厚次之，為67.84%；種子長(zhǎng)寬比的H2b值最小，為7.17%。

2.3 59份苜蓿種質(zhì)種子表型性狀的聚類分析

通過聚類熱圖分析看出，當(dāng)歐式距離為50時(shí)，59份苜蓿種質(zhì)可分成三大類群（圖1）。其中，第1類群包括5份種質(zhì)，編號(hào)為712、525、440、343和28，結(jié)合熱圖可以看出，該類群種質(zhì)除種子長(zhǎng)外，其余種子性狀值（種子周長(zhǎng)、種子寬、長(zhǎng)寬比、百粒重、種子厚和形狀系數(shù)）均大于其它類群，表明該類群種質(zhì)主要特點(diǎn)為種子形態(tài)大、種子重量較重，綜合性狀好。第Ⅱ類群包含20份種質(zhì)，該類群種質(zhì)種子長(zhǎng)和種子周長(zhǎng)值較大，但種子寬和形狀系數(shù)均較小，表明該類群種質(zhì)種子形態(tài)整體呈狹長(zhǎng)特征，種子重量較輕。第Ⅲ類群包含34份種質(zhì)，除編號(hào)為1、3這2份種質(zhì)外，該類群其它種質(zhì)的種子性狀值整體均低于I、Ⅱ類群，表明該類群種子較小、種子重量輕，綜合性狀較差。

2.4 59份苜蓿種質(zhì)種子表型性狀的主成分分析及表型性狀的相關(guān)性

對(duì)59份種質(zhì)的7個(gè)性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果（圖2）顯示，主成分1貢獻(xiàn)率為37.70%，主成分2貢獻(xiàn)率為30. 40%，累計(jì)達(dá)68. 10%。由圖3可見，種子周長(zhǎng)與種子厚、種子寬、種子長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.001，方向向量間角度＜90°），而與長(zhǎng)寬比、百粒重呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。種子長(zhǎng)與長(zhǎng)寬比呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001，方向向量間角度＞90°），與種子形狀系數(shù)也呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與種子厚呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。種子寬分別與長(zhǎng)寬比、種子厚和種子形狀系數(shù)呈極顯著或顯著正相關(guān)。種子長(zhǎng)寬比與種子形狀系數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。在相關(guān)顯著的性狀中，種子寬和長(zhǎng)寬比的正相關(guān)系數(shù)最大，為0. 82，而種子長(zhǎng)與長(zhǎng)寬比的負(fù)相關(guān)系數(shù)最小，為-0.59。

2.5 59份苜蓿種質(zhì)種子遺傳增益分析及綜合評(píng)價(jià)

按5%的人選率評(píng)估各苜蓿種質(zhì)種子表型性狀的遺傳增益（表4），種子周長(zhǎng)遺傳增益入選的3份種質(zhì)編號(hào)為712、5和28，種子長(zhǎng)遺傳增益人選的3份種質(zhì)編號(hào)為2、5和801，種子寬遺傳增益人選的3份種質(zhì)編號(hào)為712、440和525，長(zhǎng)寬比遺傳增益人選的3份種質(zhì)編號(hào)為712、440和47，種子形狀系數(shù)遺傳增益人選的3份種質(zhì)編號(hào)為801、712和1，百粒重遺傳增益人選的3份種質(zhì)編號(hào)為801、21和5，種子厚遺傳增益人選的3份種質(zhì)編號(hào)為43、801和5。人選種質(zhì)種子性狀遺傳增益最高的種質(zhì)為編號(hào)801的百粒重，達(dá)48.63%，而最低的為編號(hào)1的種子形狀系數(shù)，為0.25%。

采用布雷金多性狀綜合評(píng)價(jià)法，以種子長(zhǎng)、種子寬、長(zhǎng)寬比、種子周長(zhǎng)、種子形狀系數(shù)、百粒重和種子厚這7個(gè)性狀為指標(biāo)對(duì)各種質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，所得Qi值是多性狀綜合評(píng)價(jià)得分，其數(shù)值越大表示整體表現(xiàn)越好，結(jié)果（表5）顯示，編號(hào)712的Qi值最大，為2.381。利用Qi值，按照10%的人選率對(duì)種質(zhì)進(jìn)行選擇，編號(hào)為712、440、5、28、801、525的苜蓿種質(zhì)人選，表明這6份種質(zhì)的種子表型性狀整體表現(xiàn)優(yōu)良。

3 討論與結(jié)論

遺傳和變異是植物育種研究的重要內(nèi)容，而遺傳變異的來源、特點(diǎn)和規(guī)律是進(jìn)行種質(zhì)改良和下一步育種的重要基礎(chǔ)。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，種子大小與種子萌發(fā)時(shí)間有顯著相關(guān)性；李娘輝研究表明，大粒種子能提高出苗速度、出苗率，花芽分化增多，最終促使作物高產(chǎn)。因此種子形態(tài)性狀信息可以為品種選育提供重要信息依據(jù)。本研究結(jié)果表明，來自我國(guó)部分地區(qū)和美國(guó)、前蘇聯(lián)、意大利等國(guó)家的59份苜蓿種質(zhì)的種子性狀均存在極顯著差異（P＜0.01），顯示這些種質(zhì)問差異較大且種質(zhì)內(nèi)存有潛在可用的遺傳變異。不同來源的不同地理環(huán)境使得種子性狀變異差異明顯，可進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)良種質(zhì)種子的選擇。

不同種質(zhì)問存在的遺傳多樣性是選擇優(yōu)良基因型進(jìn)行種質(zhì)改良和育種的重要基礎(chǔ)，較高的廣義遺傳力（H2b）是作物種質(zhì)改良及表型性狀育種過程中參考的重要指標(biāo)。遺傳力指親本的某一性狀遺傳給子代能力的大小，能夠反映群體中根據(jù)表型值的優(yōu)劣選擇基因型值的可靠程度。本研究中，種子百粒重的H2b明顯高于其它種子表型性狀（＞90%），這表明相較其它種子表型性狀，種子百粒重遺傳性穩(wěn)定，受外界環(huán)境影響較小，在繁育過程中能夠穩(wěn)定遺傳優(yōu)良性狀。因此，百粒重可作為種質(zhì)改良及品種選育的重要參考性狀。

種子表型性狀多為連鎖遺傳，因此在種子表型多樣性研究中，性狀之間的相關(guān)性分析十分重要。本試驗(yàn)相關(guān)性分析結(jié)果表明，種子百粒重除與種子周長(zhǎng)顯著相關(guān)外，與其它性狀的相關(guān)性均較低，表明苜蓿種子百粒重與種子大小、種子形狀可能為獨(dú)立遺傳，種子重量受種子大小和形態(tài)影響小。除百粒重外，其它種子表型性狀兩兩之間多呈顯著相關(guān)關(guān)系，表明種子生長(zhǎng)發(fā)育過程中各性狀關(guān)聯(lián)緊密，用多指標(biāo)測(cè)定評(píng)價(jià)種子表型性狀具有重要意義。

本研究中，通過聚類熱圖分析可將59份不同來源的苜蓿種質(zhì)劃分為三大類。其中，第1類群種質(zhì)的種子形態(tài)大、重量重、綜合性狀好，該類群種質(zhì)除編號(hào)28的種質(zhì)外全部為國(guó)外引進(jìn)的育成品種，而28號(hào)野生種質(zhì)種子較大，后期育種中可以優(yōu)先考慮應(yīng)用。可見，通過引進(jìn)國(guó)外優(yōu)良苜蓿品種并選取其優(yōu)良基因，是獲得優(yōu)質(zhì)種源、縮短育種周期的重要途徑。第Ⅱ類群種質(zhì)的種子形態(tài)整體呈狹長(zhǎng)特征、形態(tài)較大，但除編號(hào)801的種質(zhì)外其余種質(zhì)種子重量較輕。第Ⅲ類群種質(zhì)的種子較小、重量輕、綜合性狀差。大粒種子對(duì)提高幼苗抗性和作物產(chǎn)量具有十分重要的意義，在特定生長(zhǎng)環(huán)境中植物種子大小對(duì)其幼苗的建植和存活具有顯著影響，較大的種子在幼苗階段能夠忍受外部環(huán)境改變引起的多種脅迫。在中國(guó)西南亞熱帶喀斯特山區(qū)，土壤石漠化程度較重，特殊的石灰?guī)r地質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致該地區(qū)牧草在生長(zhǎng)早期易遭受酸鋁、鈣鹽等非生物脅迫，因此，該地區(qū)應(yīng)盡可能地選育有利于牧草幼苗建植和存活的大粒種子苜蓿。

遺傳增益的大小受遺傳力的影響，而遺傳力和遺傳增益是衡量作物性狀變異特點(diǎn)及子代性狀受遺傳控制程度的指標(biāo)。李肇鋒通過評(píng)估26份風(fēng)藤種質(zhì)種子表型性狀的遺傳增益，表明采用表型和遺傳增益相結(jié)合方法進(jìn)行風(fēng)藤遺傳改良選擇成效顯著，并篩選出一批性狀優(yōu)良的種子。本研究通過評(píng)估不同苜蓿種質(zhì)種子表型性狀的遺傳增益及對(duì)種子性狀進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，初步選出6個(gè)種子表型性狀較好的種質(zhì)，其編號(hào)分別為712、440、5、28、801和525。此外，21號(hào)種質(zhì)種子百粒重的遺傳增益明顯高于其它種質(zhì)，也可專用于后期種質(zhì)種子重量的遺傳改良。

本研究基于表型性狀評(píng)估了59份苜蓿種質(zhì)種子的表型變異和遺傳變異參數(shù)。參試59份苜蓿種質(zhì)種子表型性狀遺傳變異較大，7個(gè)表型數(shù)量性狀間具有廣泛的顯著相關(guān)性，各種質(zhì)種子的表型性狀多樣性較豐富。通過聚類熱圖分析看出，當(dāng)歐式距離為50時(shí)，59份苜蓿種質(zhì)可分成三大類群。結(jié)合遺傳力和遺傳增益進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，編號(hào)為712（WL712）、440（WIA40HQ）、5（維多利亞）、28、801（巨能801）、525（WL525HQ）、21（無棣苜蓿）的這7份種質(zhì)種子的綜合性狀較好。本研究結(jié)果可為苜蓿種質(zhì)種子性狀改良、選種育種提供一定參考。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32260340，32060391）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐[2021]一般155，黔科合平臺(tái)人才 [2021]5636號(hào)）；貴州省教育廳科技拔尖人才項(xiàng)目（黔教技[ 2022）076號(hào)）