摘 要：根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)（GB 4789.10—2016）》第二法開(kāi)展水產(chǎn)品（凍魷魚(yú)）檢驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在Baird-Parker平板上選取的4個(gè)可疑菌落以革蘭氏陽(yáng)性桿菌菌落居多，此情況容易造成在后續(xù)鑒定過(guò)程中挑取的非金葡菌落概率增加，從而影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。故挑取血平板上由Baird-Parker平板典型菌落劃線接種培養(yǎng)得到的典型及可疑金葡菌落再次進(jìn)行確認(rèn)及鑒定，并根據(jù)鑒定結(jié)果分析探討影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，以提高實(shí)驗(yàn)室對(duì)金葡的檢測(cè)能力。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法；水產(chǎn)品；鑒定結(jié)果；影響因素

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1674-7909（2024）9-155-3

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.09.036

0 引言

金黃色葡萄球菌是生活中最常見(jiàn)的病原菌之一，為革蘭氏陽(yáng)性球菌，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，能產(chǎn)生血漿凝固酶［1-3］。人若食用了感染金黃色葡萄球菌的水產(chǎn)品，會(huì)出現(xiàn)起頭暈、惡心、腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀［4］。為確保水產(chǎn)品食用安全性，在根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)（GB 4789.10—2016）》［5］第二法開(kāi)展水產(chǎn)品（凍魷魚(yú)）檢驗(yàn)時(shí)，檢測(cè)人員需對(duì)檢測(cè)結(jié)果做出正確判斷，對(duì)檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的可能影響鑒定結(jié)果的因素進(jìn)行分析和討論，并采取可行性對(duì)策，提升相應(yīng)檢測(cè)水平。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

生理鹽水，批號(hào)：20230811（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Baird-Parker瓊脂，批號(hào)：20230927（青島海博生物技術(shù)有限公司）；血瓊脂平板：豆粉瓊脂，批號(hào)：20230912（青島海博生物技術(shù)有限公司）；脫纖維羊血，批號(hào)：20240221（青島海博生物技術(shù)有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào)：20230819（青島海博生物技術(shù)有限公司）；革蘭氏染色試劑盒，批號(hào)：20230701（青島海博生物技術(shù)有限公司）；凍干兔血漿，批號(hào)：20240117（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

1.2 菌株信息

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、表皮葡萄球菌［CMC（B）26069］，均采購(gòu)于上海魯徽科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)材料

水產(chǎn)品為凍魷魚(yú)，其來(lái)源為檢樣。

1.4 儀器設(shè)備

電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］，高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），生物安全柜（LIFESCIENCES GROUP），生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.5 檢驗(yàn)方法

1.5.1 樣品稀釋

稱取25 g魷魚(yú)加入含225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打均質(zhì)90 s，制成1∶10（體積比）的樣品勻液。再用1 mL無(wú)菌吸管吸取1∶10樣品勻液沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中，振搖試管，混勻，制成1∶100（體積比）樣品勻液，按上述操作，依法制備10倍系列稀釋比樣品勻液。

1.5.2 樣品接種

選擇1∶100、1∶1 000、1∶10 000（體積比）的樣品勻液，每組試驗(yàn)分別吸取1 mL樣液，按0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量接種于3塊B-P平板上（用L形無(wú)菌涂布棒涂布平板，涂布時(shí)避免觸及平板邊緣）。涂布后的平板靜置于36 ℃培養(yǎng)箱40 min，待樣品勻液被吸收后，倒置平板，培養(yǎng)48 h。

金黃色葡萄球菌在B-P平板上呈圓形濕潤(rùn)凸起，顏色為灰黑色或黑色且有光澤，菌落直徑為2～3 mm，常有淺色或非白色邊緣，周?chē)@以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰帶，用接種針接觸菌落時(shí)會(huì)有黃油樣黏稠感。

1.5.3 菌落計(jì)數(shù)與確認(rèn)

選擇呈現(xiàn)典型金黃色葡萄球菌特征且同一稀釋度菌落數(shù)合計(jì)在20～200 CFU的平板，從中選取12個(gè)可疑或典型菌落，分別進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)及血平板劃線，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2 鑒定結(jié)果

如表1所示，經(jīng)菌落計(jì)數(shù)器觀察，在3個(gè)稀釋度中，符合菌落計(jì)數(shù)要求的為10-2稀釋度。

2.1 革蘭氏染色

從Baird-Parker平板上挑取4個(gè)可疑菌落經(jīng)革蘭氏染色鑒定，僅可疑菌落1為典型金黃色葡萄球菌菌落，如表2所示。

2.2 血漿凝固酶試驗(yàn)

選取6個(gè)典型金黃色葡萄球菌菌落（與可疑菌落1類似的菌落），將其中5個(gè)菌落分別接種至5 mL BHI中，1個(gè)菌落劃線接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面，同時(shí)挑取表皮葡萄球菌［CMCC（B）26069］與金黃色葡萄球菌（ATCC25923）菌落接種至5 mL BHI中作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，在36 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約20 h，吸取BHI培養(yǎng)物0.8 mL加入凍干兔血漿中，輕微搖晃至完全溶解，放置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，其間每隔0.5 h觀察一次，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

2.3 血平板劃線試驗(yàn)

選取2個(gè)與可疑菌落1類似的菌落，劃線接種于血平板，于36 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，結(jié)果如表4所示。菌落呈黃色濕潤(rùn)圓形，光滑凸起，周?chē)型该魅苎Α?/p>

3 分析與討論

3.1 菌落的選取及標(biāo)記

因從Baird-Parker平板上選取的4個(gè)可疑菌落為1個(gè)革蘭氏陽(yáng)性球菌菌落，2個(gè)革蘭氏陽(yáng)性桿菌菌落，1個(gè)革蘭氏陽(yáng)性桿菌加陽(yáng)性球菌菌落。故在經(jīng)驗(yàn)不足或難以肉眼確認(rèn)典型金黃色葡萄球菌菌落時(shí)，建議在觀察Baird-Parker平板的同時(shí)，將同一類型菌落做好編號(hào)（條件允許情況下，至少確認(rèn)4個(gè)同一類型菌落），方便在革蘭氏染色鑒定后，選取標(biāo)記的菌落進(jìn)行血平板及營(yíng)養(yǎng)瓊脂小斜面劃線和血漿凝固酶試驗(yàn)。

3.2 血漿凝固酶試驗(yàn)注意事項(xiàng)

血漿凝固酶試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：在陰性和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果均成立的情況下，樣品倒置后出現(xiàn)凝固或凝固體積大于原體積的一半時(shí)，即判為陽(yáng)性。若結(jié)果可疑，則從NA斜面上挑取菌落至5 mL BHI中，于36 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，重復(fù)試驗(yàn)。根據(jù)表3，可確認(rèn)此樣品血漿凝固試驗(yàn)酶結(jié)果為陰性。

金黃色葡萄球菌凝集后會(huì)發(fā)生自溶現(xiàn)象，故每0.5 h觀察一次，且觀察過(guò)程中需要注意不能劇烈搖晃瓶身（因此操作會(huì)導(dǎo)致凝塊被振碎，影響結(jié)果的判斷）；致病性金黃色葡萄球菌絕大多數(shù)為血漿凝固酶陽(yáng)性，故我國(guó)食品微生物檢測(cè)以血漿凝固酶陽(yáng)性作為金黃色葡萄球菌的主要判定標(biāo)準(zhǔn)，以革蘭氏染色和溶血試驗(yàn)結(jié)果作為輔助判定標(biāo)準(zhǔn)［6-7］。

3.3 血平板結(jié)果確認(rèn)

從表4可知，樣品在血平板上呈現(xiàn)明顯金黃色葡萄球菌菌落特征，因Baird-Parker平板上挑取的可疑菌落的革蘭氏陽(yáng)性桿菌檢出率較高，為進(jìn)一步確認(rèn)檢驗(yàn)結(jié)果，從血平板上挑取10個(gè)典型菌落再次分別進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，革蘭氏染色鏡檢的5個(gè)菌落均為革蘭氏陽(yáng)性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)的5個(gè)菌落均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，且陰、陽(yáng)性對(duì)照成立。

3.4 總結(jié)

從此次試驗(yàn)來(lái)看，樣品中的金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的分離效果欠佳，在排除培養(yǎng)基配制不當(dāng)?shù)纫蛩氐那闆r下，考慮可能是Baird-Parker培養(yǎng)基開(kāi)封時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致其金黃色葡萄球菌菌落促生長(zhǎng)能力降低或抑制非葡萄球菌的能力降低，繼而影響了分離效果。為避免此類情況的發(fā)生，建議實(shí)驗(yàn)室往后在開(kāi)展金黃色葡萄球菌第二法檢驗(yàn)劃線Baird-Parker培養(yǎng)基試驗(yàn)的同時(shí)，增設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，以確認(rèn)培養(yǎng)基的有效性。若陽(yáng)性對(duì)照的金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，分離度高，則可排除培養(yǎng)基的問(wèn)題，考慮為樣品的偶然性事件。

參考文獻(xiàn)：

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［5］中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)：GB 4789.10—2016［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

［6］時(shí)威，盧勉飛，蔡芷荷，等.凍干兔血漿在金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究［J］.食品與發(fā)酵科技，2012，48（6）：44-47.

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（欄目編輯：李 菡）

作者簡(jiǎn)介：許志瑛（1991—），女，本科，助理工程師，研究方向：食品檢驗(yàn)檢測(cè)。