摘要：以花椒籽蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究4個(gè)因素（料液比、pH值、提取溫度和提取時(shí)間）對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響。通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳和氨基酸分析，探究花椒籽蛋白的組成。結(jié)果表明，花椒籽蛋白的最佳提取工藝條件為料液比1∶35（g/mL）、pH值9.0、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間3.5 h，在該條件下花椒籽蛋白提取率可達(dá)46.54%?；ń纷训鞍子?個(gè)主要亞基組成：54，31，25，18，10，9 kDa，其中31 kDa的蛋白質(zhì)含量最豐富?；ń纷训鞍装被岱N類(lèi)齊全，其中Glu含量最高，達(dá)到16.37 g/100 g。此外，花椒籽蛋白中必需氨基酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量較高，分別為36.88，34.75，24.65 g/100 g。由此可知，花椒籽蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源，同時(shí)可能具備抗氧化功能。

關(guān)鍵詞：花椒籽蛋白；提取率；單因素試驗(yàn)；響應(yīng)面法；氨基酸組成

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)：1000-9973（2024）09-0101-08

Optimization of Preparation Process of Zanthoxylum bungeanum

Seed Protein and Its Composition Analysis

DONG Si-yu， SUN Xin， LI Ying-qiu*

（College of Food Science and Engineering， Qilu University of Technology

（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250353， China）

Abstract： With Zanthoxylum bungeanum seed protein extraction rate as the evaluation index， single factor test and response surface test are used to investigate the effects of solid-liquid ratio， pH value， extraction temperature and extraction time on Zanthoxylum bungeanum seed protein extraction rate. The composition of Zanthoxylum bungeanum seed protein is explored by SDS-PAGE gel electrophoresis and amino acid analysis. The results show that the optimal extraction process conditions are solid-liquid ratio of 1∶35 （g/mL）， pH value of 9.0， extraction temperature of 45 ℃ and extraction time of 3.5 h. The extraction rate of Zanthoxylum bungeanum seed protein under these conditions could reach 46.54%. Zanthoxylum bungeanum seed protein consists of six major subunits， namely 54， 31， 25， 18， 10， 9 kDa， among which， the content of 31 kDa protein is the most abundant. Zanthoxylum bungeanum seed protein has a complete variety of amino acids， among which， the content of Glu is the hightest of 16.37 g/100 g. In addition， the content of essential amino acids， hydrophobic amino acids and acidic amino acids in Zanthoxylum bungeanum seed protein is higher， which is 36.88， 34.75， 24.65 g/100 g respectively. In conclusion， Zanthoxylum bungeanum seed protein is a kind of high-quality protein resource with high nutritional value and it may have antioxidant function.

Key words： Zanthoxylum bungeanum seed protein; extraction rate; single factor test; response surface method; amino acid composition

收稿日期：2024-03-20

基金項(xiàng)目：山東省與重慶市科技合作項(xiàng)目（2021LYXZ018）；齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）科教產(chǎn)融合試點(diǎn)工程重大創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2022JBZ01-08）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020CXGC010604）

作者簡(jiǎn)介：董思雨（1999—），女，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：李迎秋（1972—），女，教授，博士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

花椒籽（Zanthoxylum bungeanum seed）呈黑色，有光澤，是花椒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，占花椒質(zhì)量的3/5，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，但實(shí)際利用率較低[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，脫脂的花椒籽種仁中含有60%以上的蛋白質(zhì)[3]，這些蛋白質(zhì)具有多種生物活性，因此深入研究花椒籽蛋白對(duì)豐富植物蛋白資源、提高農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物資源利用率具有重要意義。

目前關(guān)于花椒籽蛋白的研究主要集中在蛋白的理化功能性質(zhì)和多肽的生物活性方面。劉慶慶等[4]證明了pH偏移可以改變花椒籽蛋白的理化性質(zhì)和乳化性。原洪[5]制備出具備抗氧化和抗菌活性的花椒籽鐵結(jié)合肽；姜太玲等[6]從花椒籽蛋白中純化出抗菌肽，對(duì)大腸桿菌的抑制率達(dá)100%；吳紅洋等[7]從花椒籽蛋白中純化出降血壓肽，具有良好的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制效果；張志清等[8]使用Alcalase酶解花椒籽蛋白制得抗氧化肽，對(duì)DPPH自由基的清除率為61.00%。另外，張志清等[9]、宋燕[10]分別通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了鹽提法和酶法提取花椒籽蛋白的工藝參數(shù)。但有關(guān)響應(yīng)面優(yōu)化堿溶酸沉法提取花椒籽蛋白工藝條件的研究以及對(duì)花椒籽蛋白組成的分析尚無(wú)報(bào)道。

基于此，本文以堿溶酸沉法提取花椒籽蛋白，擬用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)獲得幾個(gè)關(guān)鍵因素的最佳參數(shù)，并通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳圖譜和氨基酸測(cè)定分析花椒籽蛋白組成，從而分析其特征及潛在功能，以期為花椒籽蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，促進(jìn)花椒籽蛋白的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽：由山東興源農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供的山東省濟(jì)南市萊蕪區(qū)大紅袍花椒籽；碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚（分析純）：上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-ⅡA型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金南儀器廠；Kjeltec 2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀 廣州賽為思儀器設(shè)備有限公司；Scientz-18N型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；PowerPac HC型Bio-Rad電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花椒籽蛋白的提取

脫脂的花椒籽粉末過(guò)80目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)量1.000 g花椒籽粉末，按照一定的料液比加入蒸餾水，混勻。用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液至堿性，置于恒溫水浴鍋中保溫，期間使用攪拌器攪拌。一段時(shí)間后，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速在室溫下離心15 min。用1.0 mol/L HCl將離心后的上清液調(diào)至酸性，再次離心，棄去上清液。所得沉淀用蒸餾水反復(fù)洗至中性，經(jīng)冷凍干燥后即得花椒籽蛋白。

花椒籽蛋白提取率按照下式計(jì)算：

花椒籽蛋白提取率（%）=提取液中蛋白質(zhì)含量（g）總蛋白含量（g）×100%。

式中：提取液中蛋白質(zhì)含量采用Lowry法[11]測(cè)定，總蛋白含量采用凱氏定氮儀測(cè)定，蛋白換算系數(shù)為6.25。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1中方法制備蛋白質(zhì)，通過(guò)單因素試驗(yàn)探究料液比（1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45，g/mL）、pH值（7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5）、提取溫度（40，45，50，55，60，65 ℃）和提取時(shí)間（2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0 h）對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)料液比、pH值、提取溫度、提取時(shí)間四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以花椒籽蛋白提取率為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.4 SDS-PAGE凝膠電泳

將制得的花椒籽蛋白用還原型樣品溶解液配制成10 mg/mL的溶液，煮沸3 min后取10 μL上樣。首先在濃縮膠（3%）上以80 V電壓運(yùn)行30 min，然后在分離膠（12%）上以120 V電壓運(yùn)行120 min。制得的凝膠經(jīng)過(guò)固定2 h、染色2 h、脫色12 h后顯示出清晰條帶，即可使用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.5 氨基酸組成

稱(chēng)取0.1 g花椒籽蛋白與10 mL 6 mol/L HCl 混合，吹3 min氮?dú)夂蠓饪冢?10 ℃水解24 h。水解液用雙層濾紙過(guò)濾，并用超純水定容至50 mL，適當(dāng)稀釋后過(guò)0.22 μm濾膜。隨后取20 μL濾液于氨基酸自動(dòng)分析儀中分析花椒籽蛋白的氨基酸組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。采用Origin 8.0軟件分析數(shù)據(jù)并繪圖，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析響應(yīng)面結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響

在50 ℃、pH值為9.0的條件下提取4 h，料液比對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著花椒籽粉末與蒸餾水比例的增加，花椒籽蛋白的提取率先上升后下降，料液比為1∶35時(shí)，提取率達(dá)到最高。當(dāng)料液比小于1∶35時(shí)，提取率隨著料液比的增大而增加，可能是因?yàn)榱弦罕容^小時(shí)，高黏度的溶液在一定程度上阻礙了蛋白質(zhì)溶解；較大的料液比使花椒籽粉末分散更均勻，蛋白質(zhì)之間的作用力減少，有利于蛋白質(zhì)與水結(jié)合，從而增加了蛋白的溶解度[12]。當(dāng)料液比大于1∶35時(shí)，提取率降低，可能是溶液過(guò)稀，使蛋白質(zhì)分子與水結(jié)合不緊密，不利于花椒籽蛋白的溶出[13]。因此，選擇料液比1∶35作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心值。

2.1.2 溶液pH值對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響

在50 ℃、料液比1∶35的條件下提取4 h，溶液pH值對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)pH值為7.0～9.0時(shí)，花椒籽蛋白提取率逐漸上升，當(dāng)pH值為9.0時(shí)提取率達(dá)到最大，當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，提取率隨著pH值的增加而降低。當(dāng)pH值小于9.0時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著溶液pH值的增加而上升，這是因?yàn)檩^高的堿濃度能夠促進(jìn)極性基團(tuán)的解離，同時(shí)也使銨根離子的電離增加，增強(qiáng)了蛋白的溶出效果，因此蛋白提取率較高[14]。當(dāng)pH值大于9.0時(shí)，堿濃度過(guò)高使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率下降，可能是蛋白質(zhì)發(fā)生部分變性所致。因此，選擇pH值9.0作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心值。

2.1.3 提取溫度對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶35、pH值9.0的條件下提取4 h，提取溫度對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，花椒籽蛋白提取率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為45 ℃時(shí)，花椒籽蛋白的提取率達(dá)到最大。當(dāng)提取溫度低于45 ℃時(shí)，提取率隨著提取溫度的升高快速升高，這是因?yàn)樘崛囟壬呤狗肿舆\(yùn)動(dòng)加快，有利于蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散并與水分子結(jié)合，提高了蛋白質(zhì)的溶解度，從而花椒籽蛋白提取率提高。當(dāng)提取溫度高于45 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)容易發(fā)生熱變性，造成蛋白質(zhì)流失，從而導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇提取溫度45 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心值。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響

在50 ℃、料液比1∶35、pH值9.0的條件下提取蛋白，提取時(shí)間對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間從2.5 h增加到3.5 h時(shí)，花椒籽蛋白提取率升高，當(dāng)提取時(shí)間為3.5 h時(shí)，提取率最大，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間小于3.5 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，更多的蛋白質(zhì)得以溶出，提取率隨之增加。當(dāng)提取時(shí)間為3.5 h時(shí)，水溶性蛋白的溶出趨于飽和，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間已不能夠提高蛋白提取率。當(dāng)提取時(shí)間高于3.5 h時(shí)，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致花椒籽蛋白重新被高含量的纖維素包埋[15]，限制了蛋白質(zhì)溶出，提取率有所降低。因此，選擇提取時(shí)間3.5 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心值。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

提取花椒籽蛋白的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

該回歸模型的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

以料液比（A）、pH值（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）4個(gè)因素為自變量，以花椒籽蛋白提取率為響應(yīng)值（Y），通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸模型分析，擬合得到二次回歸方程Y=45.96+0.49A+0.83B－0.27C－0.19D+0.95AB－3.03AC－0.60AD－0.80BC+1.90BD+1.57CD－2.81A2－4.70B2－2.47C2－2.81D2。

由表3可知，模型的P值lt;0.001，表示堿溶酸沉法提取花椒籽蛋白的回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)的P值為0.601 2gt;0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合。模型的決定系數(shù)R2=0.983 7，校正決定系數(shù)RAdj2=0.967 4，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性。以上結(jié)果表明該模型可以被用來(lái)預(yù)測(cè)4種提取條件對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響。與此同時(shí)，該回歸方程中，一次項(xiàng)A（料液比）顯著，B（pH值）極顯著，C（提取溫度）和D（提取時(shí)間）不顯著；交互項(xiàng)AB、BC顯著，AC、BD、CD極顯著，AD不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均極顯著，說(shuō)明各因素之間的作用對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響不是簡(jiǎn)單的加和效應(yīng)，而是一種復(fù)雜的交互影響的關(guān)系。由F值可知，4個(gè)因素對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響大小為B（pH值）gt;A（料液比）gt;C（提取溫度）gt;D（提取時(shí)間）。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)A（料液比）、B（pH值）、C（提取溫度）和D（提取時(shí)間）的交互作用進(jìn)行分析，繪制響應(yīng)面3D曲面圖和等高線圖，見(jiàn)圖5。曲面越彎曲表示兩因素交互作用的影響程度越大，等高線越接近橢圓形表示兩因素交互作用效果越明顯[16]。

由圖5可知，料液比和提取溫度、提取溫度與提取時(shí)間、pH值與提取時(shí)間、料液比與pH值的交互作用對(duì)花椒籽蛋白提取率具有明顯的影響，料液比與提取時(shí)間、提取溫度與pH值的交互作用對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響不明顯。對(duì)該回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得到花椒籽蛋白的最佳提取工藝條件為料液比1∶36.30、pH值9.06、提取溫度43.69 ℃、提取時(shí)間3.45 h。在該條件下理論上花椒籽蛋白的提取率為46.12%。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化模型的驗(yàn)證結(jié)果分析

通過(guò)分析響應(yīng)面回歸模型，得到了提取花椒籽蛋白的最佳工藝條件，為了方便試驗(yàn)操作，將上述提取工藝條件修正為料液比1∶35、pH值9.0、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間3.5 h。按照修正條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，得到花椒籽蛋白的實(shí)際提取率為46.54%，與模型預(yù)測(cè)值的差異不大。由此可知，花椒籽蛋白提取條件的響應(yīng)面回歸模型可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)花椒籽蛋白的提取率。

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果分析

SDS-PAGE可以分析蛋白質(zhì)分子量組成的信息，花椒籽蛋白的還原型SDS-PAGE凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖6，泳道M和泳道1分別代表標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker和花椒籽蛋白電泳條帶。

由圖6可知，花椒籽蛋白包含6個(gè)主條帶，分子量分別為54，31，25，18，10，9 kDa，其中分子量為31 kDa和18 kDa的蛋白質(zhì)含量較豐富。

2.5 氨基酸組成結(jié)果分析

花椒籽蛋白的氨基酸組成測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，由于酸水解過(guò)程完全破壞了色氨酸，因此表4中未顯示色氨酸的測(cè)定值。

由表4可知，花椒籽蛋白中氨基酸種類(lèi)齊全，共檢測(cè)出17種氨基酸，其中包括10種必需氨基酸（Thr、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His）和7種非必需氨基酸（Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Arg、Pro）?；ń纷训鞍椎目偘被岷繛?4.82 g/100 g，其中必需氨基酸含量為36.88 g/100 g，占總氨基酸含量的0.434 8，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.769 3，均高于FAO/WHO的推薦值（0.4和0.6），說(shuō)明花椒籽蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源[17]。

氨基酸的組成、含量和序列往往會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[18]。谷氨酸（Glu）是一種鮮味氨基酸，在花椒籽蛋白中含量最高，達(dá)到16.37 g/100 g，說(shuō)明花椒籽蛋白可以用于增添鮮味。精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）和亮氨酸（Leu）在花椒籽蛋白中的含量也較高，分別為8.54，8.28，7.13 g/100 g。Arg有助于細(xì)胞分裂，對(duì)于維持嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育十分重要[19]；Asp不僅可以呈鮮味，而且可以消除疲勞，促進(jìn)肝功能[20]；Leu能夠刺激肌肉蛋白合成，有助于肌肉代謝[21]?；ń纷训鞍字泻休^高含量的Arg、Asp和Leu，說(shuō)明其可能具備良好的上述功效。另外，花椒籽蛋白中疏水性氨基酸（HAA）和酸性氨基酸（NCAA）含量較高，分別為34.75，24.65 g/100 g。多數(shù)研究表明HAA可以提供電子，因而賦予蛋白質(zhì)清除自由基的能力；NCAA側(cè)鏈的氨基和羧基一般具有金屬螯合能力[22]。因此，花椒籽蛋白可能具有較好的抗氧化活性，可以用于制備抗氧化產(chǎn)品。此外，支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的比值（BCAA/AAA）高往往有利于肌肉代謝、維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，花椒籽蛋白的BCAA/AAA比值（1.95）高于大麻籽（1.83），說(shuō)明花椒籽蛋白的上述功效優(yōu)于大麻籽[23]。賴(lài)氨酸與精氨酸的比值（Lys/Arg）低有利于降低血液中膽固醇含量，花椒籽蛋白的Lys/Arg比值（0.35）低于綠豆蛋白（0.98），說(shuō)明花椒籽蛋白降低膽固醇的功效可能優(yōu)于綠豆蛋白[24]。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得出各因素對(duì)花椒籽蛋白提取率的影響大小為pH值gt;料液比gt;提取溫度gt;提取時(shí)間，并且檢驗(yàn)驗(yàn)證響應(yīng)面模型擬合良好，可以用于預(yù)測(cè)4個(gè)因素對(duì)提取率的影響。由上述試驗(yàn)得到花椒籽蛋白的最佳提取條件為料液比1∶35、pH值9.0、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間3.5 h，此條件下花椒籽蛋白的提取率可達(dá)46.54%。SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示花椒籽蛋白主要包含低分子量亞基，其中31 kDa的蛋白質(zhì)含量最豐富?；ń纷训鞍装被峤M成齊全，必需氨基酸含量高于FAO/WHO的推薦值，且含有較高含量的與抗氧化功能相關(guān)的疏水性氨基酸與酸性氨基酸，表明花椒籽蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。本研究為花椒籽蛋白的進(jìn)一步加工和利用提供了參考，對(duì)提高花椒籽的附加值有一定的促進(jìn)作用。

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