摘要：為明確患根腐病的油茶在不同病情等級(jí)下根系和根際土壤內(nèi)真菌群落組成、多樣性、功能特征及與環(huán)境因子的關(guān)系，以德宏州梁河縣的油茶為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)5個(gè)病情等級(jí)的油茶根系及根際土壤內(nèi)真菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，染病油茶根系及根際土壤內(nèi)的真菌群落多樣性（Shannon指數(shù)）降低，根系中真菌總OTUs（operational taxonomic units）、特有OTUs和豐富度（Chao1指數(shù)）呈先增加后減少的趨勢(shì)；根際土壤中染病油茶真菌群落的均勻度和豐富度上升。門水平上，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為根系及根際土壤中共同的優(yōu)勢(shì)菌門，球囊菌門（Glomeromycota）和被孢囊門（Mortierellomycota）在根系中豐度表現(xiàn)為逐級(jí)遞減的趨勢(shì)。屬水平上，患病后油茶根系內(nèi)樹狀孢屬（Dendrosporium）、暗雙胞屬（Cordana）、Matsushimamyces、無柄盤菌屬（Pezicula）、黑孢盤屬（Melanconium）的豐度明顯上升。油茶林下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子為速效鉀、有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷，真菌群落與環(huán)境因子聯(lián)合分析結(jié)果表明，部分有益菌和磷含量呈正相關(guān)，部分病原菌和鉀含量呈負(fù)相關(guān)。FUNGuild 功能分析表明，油茶根系及根際土壤中真菌以腐生型為主，健康油茶中共生營養(yǎng)型真菌豐度最高，染病后逐漸降低；從Ⅱ級(jí)病害以后的油茶根系內(nèi)植物病原功能群開始成為優(yōu)勢(shì)功能群。綜上所述，油茶患病后真菌的多樣性減少，根系內(nèi)部分有益真菌豐度減少，植物病原菌和腐生菌增加，叢枝菌根真菌的定殖在調(diào)節(jié)油茶病健關(guān)系中發(fā)揮著重要的作用。針對(duì)德宏州梁河縣的油茶基地，需要多施鉀肥和磷肥，減少氮肥的施用，可提高部分有益菌的豐度，降低病原菌的豐度，從而減輕油茶根腐病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：油茶根腐?。徽婢鄻有?；群落結(jié)構(gòu)；土壤理化性質(zhì)；FUNGuild功能

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.1006

中圖分類號(hào)：S763.7；S476 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008?0864（2024）07?0121?15

油茶（Camellia oleifera）泛指山茶科（Theacea）山茶屬（Camellia）中種子含油率較高且有利用價(jià)值的一類木本食用油料植物[1]。油茶籽富含不飽和脂肪酸，是健康型高級(jí)食用植物油，也是我國食用油的重要組成部分，被譽(yù)為“東方橄欖油”[2]。油茶在中國已有2 300年的栽植歷史，截至2020年，我國實(shí)有油茶林面積445.1 萬hm2，預(yù)計(jì)2030 年將達(dá)到618.67萬hm2[3]。油茶的種植區(qū)域主要在長江流域及其以南地區(qū)[4]，云南省德宏州是油茶主要種植區(qū)域之一，但近年來多處油茶林頻發(fā)炭疽病、根腐病和灰斑病等病害，致使油茶品質(zhì)和產(chǎn)量下降，一定程度上影響了德宏州油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

植物內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，有增強(qiáng)植株抗病蟲害等生態(tài)功能[5]；根際土壤中的微生物能夠轉(zhuǎn)化土壤養(yǎng)分，參與有機(jī)質(zhì)的分解來維持土壤的健康[6]。微生物群落的組成受到環(huán)境因子和氣候的影響，植物根系會(huì)向土壤中釋放化合物招募不同的微生物，從而吸引更多有益的微生物，同時(shí)微生物能向植物提供更復(fù)雜的反饋[7]。作為土壤微生物中的重要組成，真菌比細(xì)菌更加敏感，它對(duì)植物攝取營養(yǎng)物質(zhì)、促進(jìn)生長發(fā)育、提高宿主植物抗病性以及維持根際微生態(tài)系統(tǒng)平衡等起重要調(diào)節(jié)作用[8]。土壤真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)是評(píng)價(jià)生態(tài)系統(tǒng)是否健康穩(wěn)定的重要指標(biāo)。因此，研究根系及根際土壤真菌有助于了解該區(qū)域植株及土壤的健康情況并提出針對(duì)性意見。

油茶根腐病是危害德宏州油茶林較嚴(yán)重的一種病害，油茶受到病原菌侵染后，根部初期癥狀表現(xiàn)為褐色或黑褐色，后期癥狀表現(xiàn)為表皮腐爛脫落，嚴(yán)重時(shí)癥狀延伸到根莖交界處。地上部分植株表現(xiàn)為葉片黃化脫落，植株矮小，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，嚴(yán)重影響油茶果的產(chǎn)量，損害經(jīng)濟(jì)效益。因此，亟需對(duì)油茶林生長環(huán)境進(jìn)行探究，明確土壤微生物對(duì)油茶生長和病害的影響。本研究以德宏州油茶林為對(duì)象，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同發(fā)病程度油茶的根系及根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行檢測(cè)，并分析真菌功能多樣性以及根際土壤真菌與環(huán)境理化因子的相關(guān)性，以期為開發(fā)有益的油茶根際微生物資源、調(diào)控土壤環(huán)境因子和預(yù)防油茶病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

采樣地位于德宏州梁河縣九保鄉(xiāng)丙界村（24°48’59” N、98°19’40” E），海拔1 451 m，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫18.3 ℃，年均降水量1 396.2 mm。本研究選擇的油茶林占地44.4 hm2，是白花油茶示范基地，具有一定的代表性。經(jīng)課題組前期分離回接試驗(yàn)鑒定，本次油茶根腐病的主要病原為鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）。

1.2 樣品采集

研究對(duì)象為10年生的白花油茶，品種為‘德林油B1’。根據(jù)油茶地上部分發(fā)病情況進(jìn)行取樣對(duì)象選擇，共分為5個(gè)病害等級(jí)，每個(gè)等級(jí)選擇長勢(shì)相近的6株油茶，共選取30棵油茶樹。每棵樹之間距離大于20 m。去除表面枯葉及雜質(zhì)，在距離主干約30～50 cm的4個(gè)方向，將油茶的根系拔出，抖落并收集須根土壤樣品，充分混勻，為根際土壤樣品（S）；抖落土壤后的二級(jí)側(cè)根，為根系樣品（R）。

根據(jù)油茶根系發(fā)病程度設(shè)為5個(gè)處理，每個(gè)處理分別對(duì)應(yīng)1個(gè)病情等級(jí)。0級(jí)：根部健康無癥狀；Ⅰ級(jí)：主根基部輕微褐變，側(cè)根正常；Ⅱ級(jí)：主根部分褐變，側(cè)根輕微褐變；Ⅲ級(jí)：主根及側(cè)根褐變，側(cè)根脫落；Ⅳ級(jí)：根部變黑腐爛，側(cè)根脫落，整株枯死[9]。取6份同一病害等級(jí)下的不同油茶植株的根系及根際土壤，充分混合為1個(gè)樣本，最終0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)下根際土壤分別命名為HS0、DS1、DS2、DS3、DS4，根系分別命名為HR0、DR1、DR2、DR3、DR4。將樣本用干冰保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，根系樣品表面消毒流程為：75%乙醇1 min，無菌水沖洗1次，用有效氯5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的次氯酸鈉溶液表面消毒5 min，無菌水沖洗3次。吸取100 μL最后一遍清洗的無菌水涂布于PDA培養(yǎng)基觀察是否有菌落生長，依此判斷表面消毒是否徹底[10]。土壤以200目篩網(wǎng)過篩，分為2份，1份用于分子試驗(yàn)，1份用于理化性質(zhì)測(cè)定。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

采用電位法測(cè)定土壤pH；采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)（organic matter，OM）含量；采用高錳酸鉀-還原性鐵法測(cè)定全氮（total nitrogen，TN）含量；采用氫氧化鈉熔融法測(cè)定全鉀（totalpotassium，TK）含量；采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法測(cè)定全磷（total phosphorus，TP）含量；采用紫外分光光度法測(cè)定硝態(tài)氮（nitrate nitrogen，NO-3-N）含量；采用蒸餾后滴定法測(cè)定銨態(tài)氮（ammoniumnitrogen，NH+4-N）含量；采用醋酸銨-火焰光度計(jì)法測(cè)定速效鉀（available potassium，AK）含量；采用鉬銻抗比色法測(cè)定測(cè)定速效磷（availablephosphorus，AP）含量[11]。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 土壤真菌總DNA 提取及高通量測(cè)序

將采集的土壤、根系樣品進(jìn)行微生物DNA的提取。采用E.Z.N.A Mag-Bind soil DNA Kit提取試劑盒（OMEGA）提取總DNA。用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 完整性，用Qubit定量測(cè)定樣本含量。以土壤和根系作為模板，用ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’） 擴(kuò)增真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）中長度約250 bp的ITS1區(qū)段。PCR 反應(yīng)為30 μL體系：15 μL 2×Hieff? Robust PCR Master Mix、1 μL Bar-PCR primerF、1 μL Primer R、10～20 ng PCR產(chǎn)物、9～12 μL H2O補(bǔ)足30 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用于構(gòu)建微生物多樣性測(cè)序文庫，送至生物工程（上海）股份有限公司使用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)分析

利用Cutadapt（version1.18）、PEAR （version 0.9.8）、PRINSEQ（version 0.20.4）等軟件對(duì)Illumina Miseq測(cè)序獲得的序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾，得到各樣本的高質(zhì)量序列。利用Usearch 軟件（version11.0.667），按照97% 相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTUs（operational taxonomic units）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTUs的代表序列。采用RDP classifier 貝葉斯算法（version 2.12）對(duì)97% 相似度水平的OTUs代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在門、綱、目、科、屬、種水平統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品的菌落組成，繪制不同分類水平真菌類群的相對(duì)豐度圖。利用Mothur（version1.43.0）軟件計(jì)算各樣本的Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)，分析樣本真菌的Alpha 多樣性。利用R 的gplots package繪制不同分類的相對(duì)豐度熱圖。采用冗余分析（redundancy analysis， RDA）進(jìn)行環(huán)境因子與微生物群落分布的關(guān)聯(lián)分析?；诠采⒏筒±?種營養(yǎng)型來劃分[12]真菌的生態(tài)功能類群。運(yùn)用FUNGuild 數(shù)據(jù)庫對(duì)5組根系樣品和5組根際土壤樣品真菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，置信水平選用highly probable 和probable。應(yīng)用Excel2010 對(duì)各分類單元數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用Word2010進(jìn)行表格制作，使用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析，運(yùn)用Duncan法（Plt;0.05）進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶植被土壤理化性質(zhì)分析

由表1 可知，油茶土壤為酸性土壤，pH 在4.50～4.90。土壤中有機(jī)質(zhì)和全氮含量隨著油茶病害等級(jí)的上升呈現(xiàn)出逐級(jí)遞增的趨勢(shì)，病害等級(jí)為0級(jí)的油茶土壤的有機(jī)質(zhì)和全氮含量最低，患病后升高；全鉀含量隨著油茶病害等級(jí)的上升呈現(xiàn)出逐級(jí)遞減的趨勢(shì)，病害等級(jí)為0級(jí)的油茶土壤的全鉀含量最高，患病后降低。

2.2 不同病害等級(jí)油茶根系及根際土壤內(nèi)真菌的α 多樣性分析

Alpha 多樣性分析結(jié)果如表2 所示，在根系中，0 級(jí)油茶真菌的Shannon 指數(shù)（3.07）最高，Simpson指數(shù)（0.09）最低，表明健康油茶根系中真菌的多樣性最高，患病后真菌多樣性下降；而豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)）則是隨著病害等級(jí)的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，Ⅱ級(jí)油茶根系中真菌的豐富度（790.30）最高。

根際土壤中，油茶真菌的Shannon 指數(shù)隨病害等級(jí)的升高而降低，Simpson指數(shù)隨病害的升高而升高，說明油茶根際土壤中真菌的多樣性隨病害的加重而降低；同時(shí)，0級(jí)油茶根際土壤中真菌的Chao1指數(shù)（871.34）和Ace指數(shù)（844.51）最低，感病后的油茶根際土壤中真菌的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均有不同程度的升高，說明感病后真菌的物種豐富度上升。

2.3 不同病害等級(jí)油茶土壤及根系樣品細(xì)菌的OTUs 分類

對(duì)5個(gè)油茶根系樣本真菌進(jìn)行測(cè)序，共獲得高質(zhì)量質(zhì)控序列297 212條，平均長度243.06 bp，序列聚類共獲得1 019個(gè)OTUs，5個(gè)病情等級(jí)共有OTUs 198個(gè)，占比19.43%。隨著病害等級(jí)的增加，油茶根系中的真菌總OTUs數(shù)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。就特有OTUs 而言，健康油茶（HR0）特有OTUs 60個(gè)（5.89%），Ⅰ級(jí)油茶（DR1）特有OTUs 84 個(gè)（8.24%），Ⅱ級(jí)油茶（DR2）特有OTUs 101個(gè)（9.91%），Ⅲ級(jí)油茶（DR3）特有OTUs67 個(gè)（6.58%），Ⅳ級(jí)油茶（DR4）特有OTUs 63 個(gè)（6.18%），表明特有OTUs隨病情等級(jí)增加也呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，其中Ⅱ級(jí)油茶特有的OTUs數(shù)最多（圖1A）。

對(duì)5個(gè)油茶根際土壤樣品進(jìn)行測(cè)序，共獲得高質(zhì)量質(zhì)控序列284 441條，平均長度248.94 bp，序列聚類共獲得1 585個(gè)OTUs，5個(gè)病情等級(jí)共有OTUs 246 個(gè)，占比15.52%；健康油茶（HS0）根際土壤中的總OTUs數(shù)最少，患病后總OTUs數(shù)量增加， DS3 樣本中的總OTUs 數(shù)最多，占比52.18%。此外，0 級(jí)油茶（HS0）特有OTUs 110 個(gè)（6.94%），Ⅰ 級(jí)油茶（DS1）特有OTUs 115 個(gè)（7.26%），Ⅱ 級(jí)油茶（DS2）特有OTUs 108 個(gè)（6.81%），Ⅲ 級(jí)油茶（DS3）特有OTUs 121 個(gè)（7.63%），Ⅳ 級(jí)油茶（DS4）特有OTUs 120 個(gè)（7.57%）。由此可以看出，油茶患病后總OTUs數(shù)增加，但與病害等級(jí)無關(guān)；而特有OTUs數(shù)與油茶的患病情況無明顯關(guān)系（圖1B）。

2.4 不同病害等級(jí)油茶根系及根際土壤的真菌物種組成

在門分類水平上對(duì)每組樣品的根系真菌相對(duì)豐度分布進(jìn)行分析并繪制優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度（gt;1%）柱形圖（圖2A），不同根系樣本中各門的相對(duì)豐度不同，子囊菌門（Ascomycota， 69.10%～93.26%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，3.13%～23.28%）和球囊菌門（Glomeromycota，2.24%～6.25%）在病害等級(jí)為0、Ⅰ和Ⅱ級(jí)的油茶根系樣本中為優(yōu)勢(shì)菌門（豐度前3）；子囊菌門（90.01%～95.25%）、未明確地位的真菌（unclassified_fungi，3.14%～8.27%）和擔(dān)子菌門（1.24%～1.35%）在病害等級(jí)為Ⅲ和Ⅳ級(jí)的油茶根系樣本中為優(yōu)勢(shì)菌門。其中，子囊菌門相對(duì)豐度表現(xiàn)為HR0DR2gt;DR1gt;DR3gt;DR4，健康油茶根系中擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度最高，患病后該類群相對(duì)豐度下降，Ⅳ級(jí)時(shí)相對(duì)豐度降至最低；此外，球囊菌門和被孢霉門（Mortierellomycota）的相對(duì)豐度都表現(xiàn)為HR0gt;DR1gt;DR2gt;DR3gt;DR4，呈現(xiàn)逐級(jí)遞減的趨勢(shì)，健康根樣中相對(duì)豐度最高，Ⅳ級(jí)根樣中相對(duì)豐度最低。

如圖2B所示，健康根際土壤樣本與患病油茶樣本中各門的相對(duì)豐度不同，子囊菌門（Ascomycota，61.06%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，23.60%）和球囊菌門（Glomeromycota，4.59%）在健康油茶根際土壤樣本中為優(yōu)勢(shì)菌門（豐度前3）；子囊菌門（61.06%～74.84%）、擔(dān)子菌門（5.08%～23.60%）和被孢霉門（Mortierellomycota，2.48%～20.72%）在病害等級(jí)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)的油茶根際土壤樣本中為優(yōu)勢(shì)菌門。其中，子囊菌門相對(duì)豐度表現(xiàn)為HS0DS1gt;DS3gt;DS2gt;DS4，健康油茶根際土壤中擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度最高，患病后該類群相對(duì)豐度不同程度地下降，Ⅳ級(jí)相對(duì)豐度降至最低；被孢霉門相對(duì)豐度表現(xiàn)為DS3gt;DS2gt;DS4gt;HS0gt;DS1，該類群在根際土壤中與病害的發(fā)生無明顯變化規(guī)律；球囊菌門相對(duì)豐度表現(xiàn)為HS0gt;DS2gt;DS1gt;DS3gt;DS4，健康油茶根際土壤中該類群的相對(duì)豐度最高，患病后相對(duì)豐度不同程度地下降，在Ⅳ級(jí)油茶中相對(duì)豐度降至最低。

從屬水平上分析（圖3A），0級(jí)油茶根系內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬（ 相對(duì)豐度gt;5%）為粉褶菌屬（Entoloma，17.53%）、unclassified_Hyaloscyphaceae（13.93%）、梭鏈孢屬（Fusidium，10.01%）、規(guī)整霉屬（Codinaea，9.54%）和Alatospora（8.65%）。Ⅰ級(jí)油茶根系內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為樹狀孢屬（Dendrosporium，62.47%）和unclassified_Hyaloscyphaceae（7.48%）。Ⅱ 級(jí)油茶根系內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為樹狀孢屬（29.59%） 、Thozetella （18.78%） 、晶杯菌屬（Hyaloscypha，9.80%）和Cephalotheca（5.77%）。Ⅲ級(jí)油茶根系內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為樹狀孢屬（20.65%）、暗雙胞屬（Cordana，16.67%）、無柄盤菌屬（Pezicula，10.79%）、unclassified_fungi（8.27%）、黑孢盤屬（Melanconium， 6.91%）和樹粉孢屬（Oidiodendron，6.34%）。Ⅳ級(jí)油茶根系內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為暗雙胞屬（25.08%）、Matsushimamyces（24.42%）、樹狀孢屬（11.61%）、黑孢盤屬（5.63%）、unclassified_Dothideomycetes（5.57%）和unclassified_Hyaloscyphaceae（5.03%）。各樣本間的物種相對(duì)豐度差異較大，粉褶菌屬、Alatospora、梭鏈孢屬、規(guī)整霉屬和unclassified_Hyaloscyphaceae 在健康油茶根系內(nèi)占比最大， 在油茶患根腐病后，樹狀孢屬、暗雙胞屬、Matsushimamyces、無柄盤菌屬、黑孢盤屬、unclassified_fungi 和unclassified_Dothideomycetes 的相對(duì)豐度明顯增加。

根際土壤內(nèi)（圖3B），0級(jí)油茶真菌的優(yōu)勢(shì)屬為Fellozyma（5.91%）。Ⅰ級(jí)油茶根際土壤內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為樹狀孢屬（Dendrosporium，11.07%）、Verrucoconiothyrium （7.54%） 、原隱球菌屬（Saitozyma，6.17%）和unclassified_Sordariomycetes（5.72%）。Ⅱ級(jí)油茶根際土壤內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為被孢霉屬（Mortierella，18.42%）、毛殼菌屬（Chaetomium，11.52%）和赤霉屬（Gibberella，9.35%）。Ⅲ級(jí)油茶根際土壤內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為被孢霉屬（20.68%）、原隱球菌屬（7.86%）、Knufia（6.73%） 、錐毛殼屬（Coniochaeta，6.05%） 和Scleroconidioma（5.77%）。Ⅳ級(jí)油茶根際土壤內(nèi)真菌的優(yōu)勢(shì)屬為被孢霉屬（16.67%）、Mycofalcella（15.98%）和枝鼻菌屬（Cladorrhinum，9.16%）。各樣本間的物種相對(duì)豐度差異較大，患病情況較嚴(yán)重的3個(gè)等級(jí)下（Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)），被孢霉屬的相對(duì)豐度明顯多于患病情況較輕（0和Ⅰ級(jí)）的油茶。此外，發(fā)病情況最嚴(yán)重的油茶根際土壤中Mycofalcella 和枝鼻菌屬的相對(duì)豐度最高，且明顯多于其他病害等級(jí)下的；而在健康油茶根際土壤中Fellozyma的相對(duì)豐度最高，且明顯多于其他病害等級(jí)。

2.5 不同病情等級(jí)下油茶根系及根際土壤中真菌β 多樣性分析

在屬分類單元水平上，采用unweighted-unifrac算法對(duì)樣本進(jìn)行分析（圖4）。PCoA（principalco-ordinates analysis）分析結(jié)果顯示，PCoA1 軸解釋了關(guān)系值的31.43%，PCoA2軸解釋了關(guān)系值的20.32%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率為51.75%。根系樣品和根際土壤樣品在PCoA1上分開，此外，健康油茶根系內(nèi)的真菌組成與患病油茶的有明顯差異。

聚類樹顯示，健康油茶根系內(nèi)真菌群落組成處于獨(dú)立的分支，與患病油茶的根內(nèi)及根際土壤真菌組成存在較大差異；在患病油茶中，病害等級(jí)為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的真菌群落組成相似，病害等級(jí)為Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)的真菌群落組成相似。根際土壤中，健康油茶和Ⅰ級(jí)油茶的真菌群落組成相似，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)油茶的真菌群落組成相似。由此說明，健康油茶患病后，無論是根系還是根際土壤內(nèi)的真菌群落都存在過渡過程，真菌結(jié)構(gòu)隨病害程度的加重逐漸發(fā)生變化。

2.6 環(huán)境因子對(duì)油茶根系及根際土壤真菌群落組成的影響

通過方差膨脹因子分析，去掉多重共線性較強(qiáng)的因子，將剩余因子用于冗余分析（redundancyanalysis，RDA）。將油茶根際土壤真菌群落豐度前10（屬水平）以及4種環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析，結(jié)果顯示（圖5），第1、第2 軸的解釋率分別為46.86%和23.24%，累計(jì)總解釋率達(dá)70.10%，表明該結(jié)果較好地反映了對(duì)真菌群落的影響，從大到小依次為：速效鉀gt;有機(jī)質(zhì)gt;pHgt;速效磷。選取豐度gt;1%的屬水平下根際土壤真菌，相關(guān)性類型為spearman，顯著性P 值為0.05，對(duì)油茶根際土壤真菌群落組成與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性做熱圖分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，原隱球菌屬（Saitozyma）與速效磷（AP）呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；Mycofalcella 與pH和全氮（TN）呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），與全鉀（TK）呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）；毛殼菌屬（Chaetomium）與pH和全磷（TP）呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）；暗雙孢屬（Cordana）與速效鉀（AK）呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）；Echria 與速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）；粗糙孔菌屬（Trechispora）與pH和全磷呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）。

2.7 根系和根際土壤真菌群落的功能多樣性特征

運(yùn)用FUNGuild數(shù)據(jù)庫對(duì)5組根系樣品和5組根際土壤樣品真菌群落進(jìn)行真菌功能預(yù)測(cè)分析，得到真菌營養(yǎng)型在不同樣本中的相對(duì)豐度信息（圖7A、B），樣本中的真菌類群主要為病理營養(yǎng)型、腐生營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型、病理-腐生營養(yǎng)型等營養(yǎng)類型。其中，根系內(nèi)腐生營養(yǎng)型、病理-腐生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型的相對(duì)豐度較高；根際土壤內(nèi)腐生營養(yǎng)型、腐生-共生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型的相對(duì)豐度較高。

5個(gè)根系樣本和5個(gè)根際土壤樣本預(yù)測(cè)得到的生態(tài)共位群相對(duì)豐度如圖7C、D所示（選擇豐度gt;1%）。根系中，HR0的優(yōu)勢(shì)菌群（豐度gt;10%）包括叢枝菌根功能群（arbuscular mycorrhizal，39.95%）和木腐功能群（wood saprotroph，31.45%）；DR1的優(yōu)勢(shì)菌群包括未定腐生功能群（undefinedsaprotroph，52.74%）、外生菌根-未定腐生功能群（ectomycorrhizal-undefined saprotroph，14.12%）和叢枝菌根功能群（arbuscular mycorrhizal，12.60%）；DR2的優(yōu)勢(shì)菌群包括植物病原-木腐功能群（plant saprotroph-wood saprotroph，41.05%）和未定腐生功能群（undefined saprotroph，31.38%）；DR3 和DR4 的優(yōu)勢(shì)菌群都為未定腐生功能群（undefined saprotroph，19.98%和22.23%）、植物病原- 植物腐生功能群（plant pathogen-plantsaprotroph，25.74% 和11.21%）、內(nèi)生-植物病原-植物腐生功能群（endophyte-plant pathogen-plantsaprotroph，16.47%和29.30%）、藻類寄生-苔蘚寄生-真菌寄生-未定腐生功能群（algal parasitebryophyteparasite-fungal parasite-undefined saprotroph，19.33%和14.66%）和外生菌根-未定腐生功能群（ectomycorrhizal-undefined saprotroph，13.92% 和12.98%）。根際土壤中，HS0的優(yōu)勢(shì)菌群（相對(duì)豐度gt;10%）包括未定腐生功能群（undefinedsaprotroph，19.95%）、內(nèi)生-植物病原-木腐功能群（endophyte-plant pathogen-wood saprotroph，16.19%） 和叢枝菌根功能群（arbuscularmycorrhizal，13.83%）；DS1的優(yōu)勢(shì)菌群包括未定腐生功能群（undefined saprotroph，25.60%）和動(dòng)物病原-植物病原-未定腐生功能群（animal pathogenplantpathogen-undefined saprotroph，23.20%）；DS2的優(yōu)勢(shì)菌群包括未定腐生功能群（undefinedsaprotroph，18.99%）；DS3的優(yōu)勢(shì)菌群包括未定腐生功能群（undefined saprotroph，26.74%%）和動(dòng)物病原- 真菌寄生- 未定腐生功能群（animalpathogen-fungal parasite-undefined saprotroph，12.66%）；DS4 的優(yōu)勢(shì)菌群包括未定腐生功能群（undefined saprotroph，28.59%）和內(nèi)生-凋落物腐生-土壤腐生-未定腐生功能群（endophyte-littersaprotroph-soil saprotroph-undefined saprotroph，20.05%）。可以看出，隨著病害等級(jí)的增加，植物病原菌和腐生菌增加，而叢枝菌根真菌的定殖可能在調(diào)節(jié)油茶病健關(guān)系中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

真菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是凋落物降解、養(yǎng)分周轉(zhuǎn)循環(huán)等多種生態(tài)系統(tǒng)過程或功能的核心介導(dǎo)及驅(qū)動(dòng)者[13]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)德宏州油茶5個(gè)發(fā)病等級(jí)下根系及根際土壤中的真菌進(jìn)行測(cè)定，了解真菌多樣性、組成及功能的差異。根系內(nèi)，真菌總OTUs數(shù)、特有的OTUs 數(shù)以及豐富度指數(shù)（Chao1 指數(shù)）隨病害等級(jí)的上升呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，推測(cè)是由于油茶根部防御機(jī)制被破壞，原有內(nèi)生菌的結(jié)構(gòu)比例失衡，使得其他的病原及腐生微生物更容易侵入，導(dǎo)致根系中的微生物種類逐漸增多，到病級(jí)為Ⅱ級(jí)時(shí)最多，根系腐爛程度繼續(xù)加重后，腐生微生物成為優(yōu)勢(shì)類群，此消彼長，部分微生物類群消失，導(dǎo)致種類逐漸減少，因而呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。研究還發(fā)現(xiàn)，健康油茶根系內(nèi)真菌的多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)）最高，不同病害等級(jí)油茶根系內(nèi)真菌多樣性發(fā)生了不同程度的下降，這與戴瑞卿等[14]的研究結(jié)果一致。根際土壤中，多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）隨發(fā)病程度的加重呈逐級(jí)遞減趨勢(shì)，說明病害越嚴(yán)重，根際土壤內(nèi)真菌的多樣性越低，這與李婷婷等[15]的研究結(jié)果一致，病原菌的入侵能降低土壤微生物的多樣性，可能是因?yàn)榛几∮筒韪H土壤中病原菌豐度增加，占據(jù)了更多的生態(tài)位，抑制了其他真菌的生存，導(dǎo)致真菌多樣性降低；同時(shí)，土壤內(nèi)患病油茶真菌群落的豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)）和均勻度指數(shù)（Ace指數(shù)）較健康油茶有不同程度上升，這與向立剛等[16]的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)榛疾『笥筒璺烙芰档停烁嗤饨绛h(huán)境中的真菌侵入植株。

羅鑫等[17]在貴州7個(gè)地區(qū)油茶土壤樣品中共獲得634個(gè)OTUs，隸屬于9門、32綱、73目、141科和213屬，優(yōu)勢(shì)門為擔(dān)子菌門和子囊菌門，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，德宏州油茶根區(qū)內(nèi)有豐富的真菌類群，根系內(nèi)真菌共劃分為1 019個(gè)OTUs，根際土壤內(nèi)真菌共劃分為1 585個(gè)OTUs。子囊菌門有大量的腐生真菌[18]，油茶患病后根系內(nèi)和根際土壤中子囊菌門的相對(duì)豐度增加。擔(dān)子菌門在健康油茶根系及根際土壤中的相對(duì)豐度最高，該類群可與植物共生形成菌根，有利于植物生長發(fā)育[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，油茶根系內(nèi)的球囊菌門和被孢霉門豐度與病害呈負(fù)相關(guān)，球囊菌門包含許多叢枝菌根（AM）真菌，AM 真菌能夠與植物根系形成互惠共生體，可提高植物的抗逆性[20]；被孢霉門是很多植物的內(nèi)生菌，可幫助植物抵御病原的侵染，能夠促進(jìn)植物生長[21]，它們的定殖能減輕油茶根腐病的發(fā)生。

從屬水平上看，根系內(nèi)，油茶患根腐病后樹狀孢屬、暗雙孢屬、無柄盤菌屬和黑孢盤菌屬的相對(duì)豐度明顯上升，成為不同病害等級(jí)下的優(yōu)勢(shì)菌群。研究發(fā)現(xiàn)，香蕉暗雙孢菌（Cordana musae）會(huì)引起香蕉葉斑病的發(fā)生[22]，該類群在本研究中發(fā)病嚴(yán)重的油茶根系內(nèi)相對(duì)豐度明顯增高，其對(duì)油茶的致病性需進(jìn)一步研究。無柄盤菌屬是植物的內(nèi)生真菌，同時(shí)也是一種植物的病原菌。Kehr[23]曾報(bào)道，無柄盤菌屬真菌（Pezicula cinnamomea）會(huì)導(dǎo)致紅櫟樹干上發(fā)生潰瘍病，因此該類群可能會(huì)引起油茶根系的腐爛。黑盤孢屬會(huì)引起胡桃科和樺木科等植物的枝枯病，甚至導(dǎo)致植株死亡[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在根腐病嚴(yán)重的油茶根系中有大量該類群的存在，對(duì)于其是否為根腐病的的病原菌還需進(jìn)一步研究。根際土壤中，患病油茶被孢霉屬和枝鼻菌屬的相對(duì)豐度升高。被孢霉屬是一種分解纖維素能力極強(qiáng)的屬，能夠很好地抵抗根腐病[25]。枝鼻菌屬也是一類有益真菌，可改善關(guān)鍵的土壤理化因子[26]。根際土壤中這類有益菌群的相對(duì)豐度在患病后升高，可能是因?yàn)橛筒柙谑艿讲≡秩竞?，根系產(chǎn)生分泌物，招募有益菌群。研究發(fā)現(xiàn)，赤霉屬在根系及根際土壤樣品中均有分布，赤霉屬為鐮刀菌屬（Fusarium）的有性階段，它是油茶根腐病的主要病原，該類群的相對(duì)豐度與病害等級(jí)之間無明顯規(guī)律性，可能是因?yàn)槌嗝箤賰?nèi)的病原真菌并非都是致病的病原菌，因此相對(duì)豐度的變化不一定與病害等級(jí)相關(guān)。

組間β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，根系樣本和土壤樣本中真菌群落存在差異，而根系真菌來源于土壤[27]，說明根系招募土壤真菌具有選擇性，這與根系分泌物或者生長發(fā)育過程相關(guān)，且健康油茶根系內(nèi)真菌群落組成明顯區(qū)別于其他幾組患病的，說明患病會(huì)改變根系內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)。本研究還發(fā)現(xiàn)，無論是根系內(nèi)還是根際土壤內(nèi)，相鄰病害等級(jí)間的真菌群落都有相似性，說明真菌群落的變化都存在一個(gè)逐漸過渡過程。

油茶喜好酸性土壤，本研究所測(cè)土壤pH 在4.5～4.9，屬于酸性土壤。植物病害發(fā)生與土壤理化特性的改變有關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)質(zhì)和全氮隨著病害等級(jí)的上升逐級(jí)升高。陳海念[29]研究發(fā)現(xiàn)，土壤理化因子中有機(jī)質(zhì)含量高會(huì)加劇煙株青枯病的發(fā)生，與本研究結(jié)果相似。有研究指出，施用氮肥過多作物發(fā)病率會(huì)更高、病害程度會(huì)加重[30]。全鉀含量隨著油茶病害等級(jí)的上升逐級(jí)遞減，土壤中的鉀可誘導(dǎo)植物根系分泌相關(guān)物質(zhì)來抑制病原菌的生長，從而減輕植物病害的發(fā)生[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，速效鉀、有機(jī)質(zhì)、pH和速效磷是影響根際土壤真菌群落組成的主要因子，這與羅鑫等[17]的研究結(jié)果部分相似，說明這些土壤因子對(duì)于5個(gè)樣本根際土壤真菌的群落組成和豐度起著重要作用。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，原隱球菌屬與速效磷呈顯著正相關(guān)，與pH呈顯著負(fù)相關(guān)；Mycofalcell與pH和全氮呈正相關(guān)，與全鉀呈正相關(guān)；毛殼菌屬與pH和全磷呈正相關(guān)，暗雙孢屬和Echria 與速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)，粗糙孔菌屬與pH和全磷呈正相關(guān)。由此表明，針對(duì)德宏州梁河縣的油茶基地，需要多施鉀肥和磷肥，少施氮肥，可提高部分有益菌的相對(duì)豐度，降低病原菌的相對(duì)豐度，從而減輕油茶根腐病的發(fā)生。

FUNGuild功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，油茶種植基地土壤真菌功能類群中腐生營養(yǎng)型真菌比例最大，其次為病理-腐生營養(yǎng)真菌，共生營養(yǎng)型真菌比例排名第3，與患病油茶相比，健康油茶中共生營養(yǎng)型真菌比例最高。共生型營養(yǎng)真菌與病原菌之間存在拮抗關(guān)系，能夠抑制病原的生長，從而保護(hù)寄主、減輕病原菌侵染帶來的危害[32]。從功能分組上可以看出，健康油茶根系及根際土壤中叢枝菌根功能群的相對(duì)豐度比患病油茶高，說明油茶根區(qū)有豐富的叢枝菌根真菌，叢枝菌根真菌通常與植物根系建立菌根共生體，減少植物病害的發(fā)生、促進(jìn)植物生長[33]。從Ⅱ級(jí)病害以后的油茶根系內(nèi)植物病原功能群開始成為優(yōu)勢(shì)功能群，說明從這一階段開始，有大量的病原菌對(duì)油茶根系進(jìn)行了侵染導(dǎo)致油茶病害發(fā)生加重。綜上，油茶患病后，根系和根際土壤真菌多樣性下降，部分有益真菌豐度下降，植物病原菌和腐生菌增加。本研究獲得的真菌群落組成、多樣性特征、優(yōu)勢(shì)類群、環(huán)境因子以及功能特征的分析結(jié)果具有一定的實(shí)踐意義，為預(yù)防植物病害及土壤真菌資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFD1002002）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31860208）。