摘要：為探索實(shí)驗(yàn)室前期改造保存的乳酸菌素PlnJ（G5）對脂多糖LPS誘導(dǎo)下腸上皮細(xì)胞IPEC-J2與小鼠腸道炎癥的作用機(jī)制。選取腸上皮細(xì)胞IPEC-J2及模式動(dòng)物小鼠作為研究載體，利用LPS建立炎癥模型，并通過添加PlnJ（G5）進(jìn)行處理，采用cck-8檢測細(xì)胞活力以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化。結(jié)果表明：5.0μg·mL?1的LPS對IPEC-J2細(xì)胞活力的影響較小，且該濃度作用下IPEC-J2細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α及IFN-β的mRNA表達(dá)量顯著高于空白對照組，證明LPS對IPEC-J2細(xì)胞致炎造模成功；CCK-8檢測結(jié)果顯示PlnJ（G5）對IPEC-J2細(xì)胞的安全添加劑量為20.0μg·mL?1；qPCR檢測結(jié)果表明IPEC-J2細(xì)胞在經(jīng)5.0μg·mL?1的LPS作用4 h后，添加20.0μg·mL?1未經(jīng)熱處理的PlnJ（G5）對IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α及IFN-β的mRNA表達(dá)量的抑制效果最佳；添加乳酸菌素處理對LPS誘導(dǎo)模式動(dòng)物小鼠腸炎試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)灌服未經(jīng)熱處理的PlnJ（G5），對小鼠的抗炎效果最好。

關(guān)鍵詞：乳酸菌素；脂多糖；誘導(dǎo)；腸上皮細(xì)胞；炎癥

中圖分類號(hào)：S852文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253?2301（2024）10?0036?07

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.10.006

許麗惠，嚴(yán)夢涵，王全溪.乳酸菌素PlnJ（G5）緩解LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞及小鼠腸道炎癥的作用機(jī)制[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2024，55（10）：36?42.

Mechanism of Lactobacillin PlnJ（G5）on Alleviating the Intestinal Epithelial Cells and IntestinalInflammation in Mice Induced by LPS

XU Li-hui，YAN Meng-han，WANG Quan-xi*

（College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Abstract：In order to explore the mechanism of lactobacillus PlnJ（G5）modified and preserved in the laboratory on the intestinal epithelial cells IPEC-J2 and the intestinal inflammation in mice induced by lipopolysaccharide LPS，the intestinal epithelial cell IPEC-J2 and model animal mice were selected as the research carriers.LPS was used to establish an inflammatory model，and PlnJ（G5）was added for the treatment.Then，the cell viability was detected by cck-8 and the expression changes of inflammatory cytokines was detected by the real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed that 5.0μg·mL?1 LPS had little effect on the cell viability of IPEC-J2，and the mRNA expression levels of IL-1，IL-6，TNF-α，IFN-αand IFN-βin IPEC-J2 cells treated with this concentration were significantly higher than those in the blank control group，which proved that the inflammatory model of IPEC-J2 cells induced by LPS was successful.The results of CCK-8 detection showed that the safe additive dosage of PlnJ（G5）for IPEC-J2 cells was 20.0μg·mL?1.The results of qPCR detection showed that after IPEC-J2 cells treated with 5.0μg·mL?1 LPS for 4 h，the addition of 20.0μg·mL?1 unheated PlnJ（G5）had the best inhibitory effect on the mRNA expression of IL-1，IL-6，TNF-α，IFN-αand IFN-β.The experimental results showed that PlnJ（G5），which was not heat treated，had the best anti-inflammatory effect on mice induced by LPS.

Key words：Lactobacillin；Lipopolysaccharide；Induce；Intestinal epithelial cells；Inflammation

腸道不僅是畜禽獲取營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，也是畜禽機(jī)體很重要的天然黏膜免疫器官，可在病原入侵機(jī)體時(shí)發(fā)揮重要的阻擋作用[1]。在畜禽的整個(gè)飼養(yǎng)過程中，畜禽所受到的各種應(yīng)激易對腸道的黏膜屏障造成不同程度的損傷而產(chǎn)生炎癥。隨著“禁抗令”的全面實(shí)施，尋求飼料中抗生素替代品以維持畜禽的腸道健康已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，乳酸菌微生態(tài)制劑作為替抗產(chǎn)品的重要一員，其研究應(yīng)用也得到了廣泛的開展。

目前關(guān)于乳酸菌對宿主健康的有益作用主要通過抑制病原體的繁殖[2]、改善腸道黏膜上皮的屏障功能[3?4]、誘導(dǎo)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[5]等途徑發(fā)揮作用?，F(xiàn)有研究表明乳桿菌具有應(yīng)對機(jī)體炎癥反應(yīng)的潛力，可降低炎癥細(xì)胞白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）的分泌[6]，且多種乳桿菌已被證明可通過抑制促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[7]。Jang等[8]研究也表明乳桿菌可以通過抑制IL-1β、IL-6與TNF-α的分泌從而緩解小鼠的腸炎。而有關(guān)乳桿菌分泌產(chǎn)生的乳酸菌素的針對性研究報(bào)道并不多見。本實(shí)驗(yàn)室保存有前期經(jīng)耐熱性改造的乳酸菌素PlnJ（G5）[9]，其在機(jī)體炎癥發(fā)生時(shí)所發(fā)揮的作用機(jī)制尚不清晰。本研究從細(xì)胞水平（腸上皮細(xì)胞IPEC-J2）、模式動(dòng)物水平（小鼠）兩個(gè)方面闡明乳酸菌素PlnJ（G5）對LPS誘導(dǎo)炎癥損傷的保護(hù)機(jī)制，為PlnJ（G5）在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供重要理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

豬腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）由本實(shí)驗(yàn)室保存，ICR清潔級小鼠購自福州言蹊生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器超凈臺(tái)購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購自青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司，酶標(biāo)儀購自上海帝肯實(shí)驗(yàn)器材有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自北京羅氏生物科技發(fā)展有限公司。

1.2.2主要試劑乳酸菌素PlnJ、改造后乳酸菌素PlnJ（G5）均為本實(shí)驗(yàn)室前期體外表達(dá)得到，蛋白濃度均調(diào)整至0.45 mg·mL?1。DMEM/F12完全培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自美國APE×BIO公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 IPEC-J2細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)將存有豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）的細(xì)胞凍存管從液氮罐取出后于37℃水浴鍋中解凍；待凍存液完全融化后擦干管外的水珠，于4℃離心機(jī)中1 000 r·min?1離心5 min；離心結(jié)束后棄去上清，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液將管中細(xì)胞重懸后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)備用。

1.3.2 LPS對IPEC-J2細(xì)胞活力的影響試驗(yàn)分組：空白對照組（不含細(xì)胞，100μL細(xì)胞培養(yǎng)基+10μLCCK-8）、0加藥組（細(xì)胞+100μL細(xì)胞培養(yǎng)基+10μL CCK-8）、LPS藥物處理組（細(xì)胞+100μL細(xì)胞培養(yǎng)基+10μL CCK-8+0.1、0.5、1.0、5.0或10.0μg·mL?1LPS）。在96孔板中加入的細(xì)胞數(shù)量約1×104個(gè)·孔?1，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后。按試驗(yàn)分組加入等量相應(yīng)濃度的LPS對PEC-J2細(xì)胞進(jìn)行處理，每個(gè)處理孔加入CCK-8后，37℃孵育4 h后，使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測其在450 nm的吸光值。

1.3.3 qPCR檢測LPS誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響按1.2.2的方法再培養(yǎng)一批細(xì)胞后用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用于熒光定量PCR（qPCR）試驗(yàn)。

用表1中的引物（由北京擎科生物技術(shù)公司合成）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20μL：模板2μL、上下游引物各1μL、預(yù)混液10μL、無菌水6μL，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃5 min，循環(huán)條件：95℃5 s，60℃30 s，72℃15 s，循環(huán)數(shù)為45；72℃延伸5 min。選用β-actin作為內(nèi)參基因，用2?△△CT進(jìn)行計(jì)算IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-βmRNA的相對表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)數(shù)為3。

1.3.4 PlnJ（G5）對IPEC-J2細(xì)胞活力的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組如下：空白對照組（不含細(xì)胞，100μL細(xì)胞培養(yǎng)基+10μL CCK-8）、0加藥組（細(xì)胞+100μL細(xì)胞培養(yǎng)基+10μL CCK-8）、添加PlnJ（G5）處理組（細(xì)胞+100μL細(xì)胞培養(yǎng)基+10μL CCK-8+5、10、20、40、80或160μg·mL?1 PlnJ（G5））。方法同1.2.2。1.3.5 PlnJ（G5）對LPS處理下IPEC-J2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響根據(jù)1.2.2、1.2.3和1.2.4篩選出來的最適PlnJ（G5）和LPS作用劑量，檢測PlnJ（G5）對LPS處理下IPEC-J2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響。用5.0μg·mL?1的LPS對IPEC-J2細(xì)胞刺激處理4 h后，棄去LPS后，按空白對照組（無LPS刺激處理）、陽性對照組（不加PlnJ（G5）處理）、未經(jīng)熱處理的PlnJ（G5）（20.0μg·mL?1）、100℃加熱30 min處理的PlnJ（G5）20.0μg·mL?1對IPEC-J2細(xì)胞繼續(xù)處理4 h后，收集各處理組細(xì)胞，經(jīng)RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用于后續(xù)熒光定量PCR檢測。

熒光定量PCR檢測的引物序列、反應(yīng)體系及條件參照1.2.3。

1.3.6 PlnJ（G5）對LPS處理下小鼠腸道相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響將30只體重在20±2 g的ICR雌性小鼠，隨機(jī)分成5組，每組6個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)處理為空白對照組、LPS處理組、LPS+PlnJ（100℃熱處理30 min）組、LPS+PlnJ（G5）組、LPS+PlnJ（G5）（100℃熱處理30 min）組，PlnJ及PlnJ（G5）經(jīng)處理后調(diào)整濃度至0.02 mg·mL?1，每天每只小鼠的灌喂量為0.5 mL，空白對照組、LPS處理組均灌服同等劑量的滅菌PBS，連續(xù)灌服7 d后，于第8 d給空白對照組腹腔注射200μL的滅菌生理鹽水、其余處理組均腹腔注射200μL濃度為1μg·uL?1的LPS，注射24 h后，對小鼠經(jīng)斷頸處理后，無菌獲取小鼠結(jié)腸組織用于炎癥細(xì)胞因子mRNA的檢測。

熒光定量PCR檢測的引物序列、反應(yīng)體系及條件參照1.3.3。

1.3.7數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)使用Excel 2021進(jìn)行計(jì)算處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差作圖，使用SPSS軟件以one-way ANOVA方法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1 LPS對IPEC-J2細(xì)胞活力的影響

由圖1可知，當(dāng)LPS濃度在0.1～1.0μg·mL?1范圍內(nèi)，IPEC-J2細(xì)胞活力都在60%以上，但當(dāng)LPS濃度上升為5.0μg·mL?1時(shí)，其細(xì)胞活力在40%左右，而LPS濃度達(dá)到10.0μg·mL?1時(shí)，細(xì)胞活性則降到40%以下，影響較大。

2.2 qPCR檢測LPS對IPEC-J2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響

將不同濃度的LPS作用IPEC-J2細(xì)胞4 h后，收集細(xì)胞，檢測其炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-β的mRNA表達(dá)量，由圖2（A-E）可知，當(dāng)LPS濃度為5.0μg·mL?1時(shí)，炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，LPS濃度為10.0μg·mL?1和5.0μg·mL?1相比炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量顯著性降低。因此，選擇5.0μg·mL?1的LPS來建立炎癥細(xì)胞模型。

2.3 PlnJ（G5）對IPEC-J2細(xì)胞活力的影響

由圖3可知，當(dāng)PlnJ（G5）的濃度低于（含）20μg·mL?1時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞的活力均在80%以上，說明其對細(xì)胞的培養(yǎng)影響不大，但當(dāng)其濃度達(dá)到40μg·mL?1以上，IPEC-J2細(xì)胞的活力迅速降到60%左右甚至更低，說明其對細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)生了不利影響。因此，選擇20μg·mL?1的PlnJ（G5）作為后續(xù)試驗(yàn)的使用濃度。

2.4 PlnJ（G5）對LPS處理下IPEC-J2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響

由圖4可知，同LPS處理組相比，添加PlnJ（G5）（未加熱或加熱）的處理組對IL-1、TNF-α、IFN-α、IFN-β的mRNA水平表達(dá)量均起到了抑制（r＜0.05），說明PlnJ（G5）均對LPS作用下的IPEC-J2細(xì)胞具有保護(hù)作用，但加熱處理對其仍有一定影響。PlnJ與PlnJ（G5）在同樣進(jìn)行100℃加熱30 min的處理后，PlnJ（G5）對IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α的mRNA水平表達(dá)量更低（r＜0.05），說明了PlnJ（G5）的耐熱性能得到了提升。

2.5 PlnJ（G5）對LPS處理下小鼠腸道相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響

由圖5可知，同LPS處理的小鼠相比較，飼喂不同處理的乳酸菌素試驗(yàn)組的炎性因子IL-1、IFN-α、TNF-α的mRNA表達(dá)水平均受到了顯著抑制（P＜0.05）。在100℃加熱30 min處理下，與飼喂PlnJ處理組相比，PlnJ（G5）處理組在對IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-β的mRNA表達(dá)水平抑制作用顯著（P＜0.05），說明PlnJ（G5）保持了對炎性因子的抑制作用。而同未經(jīng)加熱處理的PlnJ（G5）相比，經(jīng)加熱處理后的PlnJ（G5）在對炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)抑制效果并無差異，這說明基因改造可以較好地在高溫條件下維持其在加熱處理前的活性。

3討論

腸道對動(dòng)物機(jī)體來說不僅僅是重要的消化吸收器官，同時(shí)也是重要的免疫器官，其健康程度對動(dòng)物的生長態(tài)勢具有重要的影響。隨著集約化養(yǎng)殖的飛速發(fā)展，畜禽在高密度養(yǎng)殖環(huán)境中更易受到不良應(yīng)激以及病原體的侵襲，引起腸道炎癥，使機(jī)體的營養(yǎng)消化吸收受阻，造成生長性能降低，甚至導(dǎo)致死亡，引發(fā)經(jīng)濟(jì)損失[10]。脂多糖（LPS）亦稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌（G-）外膜的重要組成[11]。研究表明低劑量的LPS在動(dòng)物體內(nèi)的暴露，可經(jīng)緊密連接使腸道的通透性增加，進(jìn)而誘發(fā)腸道炎癥的發(fā)生，可用于腸道功能障礙模型的建立[12]。楊麗萍[13]、劉燕蓉[14]等均采用LPS建立腸道損傷模型進(jìn)行研究。本研究利用不同濃度的LPS處理IPEC-J2細(xì)胞，細(xì)胞存活率及炎癥因子mRNA表達(dá)量的檢測結(jié)果均表明當(dāng)添加的LPS濃度為5.0μg/mL時(shí)，IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-β的mRNA表達(dá)量顯著增加，這與孫麗[15]等的研究結(jié)果相似，可以建立較好的炎癥模型。

LPS可激發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂，刺激免疫細(xì)胞分泌過量的炎性因子如IL-1β，IL-6、TNF-α等[16?17]。TNF-α既可以提升中性粒細(xì)胞的吞噬功能，激活相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-1α和IL-6，也會(huì)加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)[18?19]；還可以協(xié)同IL-1β一起誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，對白細(xì)胞的黏附起到促進(jìn)作用，進(jìn)而加重腸道組織的損傷[20?21]。干擾素IFN作為糖蛋白不僅具有抗病毒作用，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，炎癥反應(yīng)可促進(jìn)IFN的分泌。

在探討耐熱性改造的乳酸菌素PlnJ（G5）作用于IPEC-J2細(xì)胞的安全濃度試驗(yàn)中，篩選得出PlnJ（G5）對IPEC-J2細(xì)胞的最佳處理濃度為20.0μg·mL?1。細(xì)胞試驗(yàn)中，將濃度均為20.0μg·mL?1的PlnJ（加熱30 min）、PlnJ（G5）、PlnJ（G5）（加熱30 min）作用于經(jīng)LPS濃度為5.0μg·mL?1處理的IPEC-J2細(xì)胞，結(jié)果表明乳酸菌素均可抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-βmRNA水平，雖然加熱30 min的PlnJ（G5）效果不如未做加熱處理的PlnJ（G5），但仍優(yōu)于做加熱30 min處理的PlnJ，說明PlnJ（G5）耐熱性得到提高，可保持其良好的功能。動(dòng)物試驗(yàn)中，乳酸菌素對LPS刺激下的IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-βmRNA水平也均起到了抑制作用，說明經(jīng)PlnJ（G5）在100℃加熱處理30 min后仍保持了較好的蛋白活性。

4結(jié)論

PlnJ（G5）能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α及Ⅰ型干擾素mRNA的表達(dá)，可作為PlnJ（G5）在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。

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