關(guān)鍵詞：油茶；組織培養(yǎng)；表面消毒；褐化；培養(yǎng)基成分；培養(yǎng)條件

油茶是山茶科Theaceae山茶屬Camellia一類木本食用油料樹種的總稱。油茶是中國(guó)特有的木本油料樹種，在中國(guó)已有2300多年的栽培歷史，是世界四大木本油料作物之一[1-3]。由油茶種子（茶籽）榨取的茶油是一種富含不飽和脂肪酸、維生素E和山茶苷等活性物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)食用油，有“東方橄欖油”的美稱。除食用和烹調(diào)功能外，茶油及其副產(chǎn)品在日用化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上都具有重要的用途，油茶是中國(guó)極具特色的經(jīng)濟(jì)林樹種之一[4-9]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可被用來對(duì)植物進(jìn)行工廠化快速繁殖，還是生物技術(shù)育種（如基因工程、基因編輯、體細(xì)胞雜交、突變體誘導(dǎo)與篩選、挽救雜種胚、體外授精等）的技術(shù)基礎(chǔ)[10]，因此，研究油茶組織培養(yǎng)有著重要意義。早在1978年，廣西林業(yè)科學(xué)研究所生理研究室顏慕勤等[11-15]對(duì)岑溪軟枝油茶進(jìn)行了組織培養(yǎng)并獲得成功。與此同時(shí)，其他研究者也對(duì)油茶幼胚和未成熟子葉的離體培養(yǎng)[16-17]以及花藥培養(yǎng)[18]進(jìn)行了探索。最近Li等[19]研究了普通油茶愈傷組織誘導(dǎo)、懸浮培養(yǎng)及原生質(zhì)體分離。為了給研究者提供參考，根據(jù)外植體培養(yǎng)類型對(duì)油茶組織培養(yǎng)研究進(jìn)展進(jìn)行了論述。

1油茶芽和莖段的組織培養(yǎng)

油茶為天然雜合體，通過種子或?qū)嵣绶敝车闹仓瓴灰妆３謨?yōu)良種性。采用油茶芽、莖尖和帶芽莖段進(jìn)行培養(yǎng)，不但無(wú)性系繁殖后代保持了母株的優(yōu)良性狀，而且由于存在分生組織，未經(jīng)脫分化階段形成愈傷組織就可以產(chǎn)生叢生芽，從而減少了變異的可能。因此，這類外植體組織培養(yǎng)一般用于油茶種苗快速繁殖。

1.1外植體采集與表面消毒

組織培養(yǎng)中的污染和褐變是影響油茶組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素[20-22]，油茶組織培養(yǎng)中外植體污染情況較為復(fù)雜，也較難控制[21]。表面消毒的難易程度受品種、生長(zhǎng)地區(qū)、外植體年齡、采集時(shí)間等因素影響。最簡(jiǎn)單的表面消毒方法是用乙醇和升汞的常規(guī)組合方法。顏慕勤等[13]最早采用岑溪軟枝油茶成年樹的腋芽進(jìn)行培養(yǎng)，在2—3月份腋芽剛開始萌動(dòng)、芽苞剛開始膨脹時(shí)采集外植體。采回后剝?nèi)ネ饷鎺讓影?，?5%乙醇浸泡12s，用0.1%升汞消毒12～15min，然后用無(wú)菌水沖洗4～5次，在無(wú)菌條件下剝離腋芽的最后幾層苞片，將腋芽切成2～3mm長(zhǎng)的小段接種。劉海龍等[23]以10月—次年1月岑溪軟枝油茶帶腋芽莖段為外植體，使用毛刷刷洗后用75%乙醇消毒10～15s，然后用0.1%升汞消毒10～15min，污染率最低（24.5%），其中用毛刷蘸洗潔精溶液刷洗莖段對(duì)莖段滅菌效果影響較大。1月底—4月新萌枝條不帶腋芽莖段較好的滅菌方法為75％乙醇消毒4～7s，0.1％升汞消毒5～6min，污染率為14.3%。陳勝群等[24]取小果油茶當(dāng)年生帶芽莖段作為外植體，用清水沖洗后，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇消毒10s，然后用1.0g/L的升汞消毒滅菌10min，無(wú)菌水沖洗5次。

利用乙醇和升汞的常規(guī)組合方法對(duì)油茶進(jìn)行消毒的效果一般較差。流水沖洗對(duì)降低污染率有重要影響。吳正凱等[25]取飽滿頂芽用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕輕刷洗芽苞，再置于水龍頭下用流水沖洗2～3h，然后用75%乙醇快速進(jìn)行表面滅菌，用無(wú)菌水沖洗3～4次，再用0.1%升汞消毒處理5min，最后用無(wú)菌水沖洗8～10次。黃莉雅等[26-28]以油茶品種岑軟2號(hào)和岑軟3號(hào)的鮮嫩帶芽的莖段和頂芽為外植體，用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕洗，再置于流水下沖洗2～3h，接著用75%乙醇快速滅菌30s，用無(wú)菌水沖洗3～4次，然后用0.1%升汞消毒6min，在各處理中這種處理的誘導(dǎo)效果最好，成活率分別達(dá)71%和73%。劉海英[29]取3—5月份當(dāng)年生嫩枝，用紗布包裹脫脂棉蘸少許清水輕輕擦洗枝條表面的塵土和絨毛，再用流水沖洗干凈，然后用洗衣粉溶液浸泡10min左右（其間不斷攪拌以使清洗均勻徹底），再用流水洗凈表面洗衣粉溶液并置于流水下沖洗2～5h，濾干水分后用75%的乙醇浸泡約30s，用無(wú)菌水沖洗3～5遍，最后用0.1%升汞消毒8min，在各處理中這種處理的腋芽啟動(dòng)率最高，可達(dá)64.0%?？碌て糩30]在用乙醇和升汞組合消毒材料（帶腋芽莖段使用70%乙醇浸洗30s和0.1%升汞消毒7min的效果最好）之前，用自來水沖洗后用洗潔精溶液浸洗15min，然后置于流水下沖洗2～4h。萬(wàn)珠珠等[31]在用乙醇和升汞組合消毒材料（帶腋芽莖段使用75%乙醇浸洗8s和0.1%升汞消毒8min的效果最好）之前，用自來水沖洗數(shù)次后，在洗衣粉溶液中浸泡12～20min，再用自來水沖洗2h。何超銀[32]以當(dāng)年生帶芽莖段為外植體，用刷子輕輕擦洗表面的塵土和絨毛后，用洗潔精溶液浸泡5min左右，再用自來水沖洗30min，用無(wú)菌水沖洗3次后，用75%乙醇處理30s，用無(wú)菌水沖洗8～10次后用0.1%升汞處理10min，在各處理中這種處理的效果最好。代忠迪等[33]在2次消毒之前，先將枝條外植體在5℃恒溫箱中低溫處理8h，再將經(jīng)低溫處理的油茶無(wú)性系組培外植體進(jìn)行修剪，在0.1%的多菌靈溶液中浸泡6min，然后用流水沖洗5h。

為了降低污染率，有研究人員采用重復(fù)消毒的方式。李澤等[34]取普通油茶當(dāng)年生半木質(zhì)化莖段作為外植體，用自來水沖洗20min左右，再用洗衣粉溶液浸泡15min，用自來水沖洗干凈后，用75%的乙醇浸泡2次（每次30s），用無(wú)菌水沖洗3～5遍，然后用0.1%的升汞消毒2次（第1次10min，第2次5min），用無(wú)菌水沖洗5遍，最后用濾紙吸干莖段表面水分。唐國(guó)濤等[35]將大棚內(nèi)2年生油茶扦插苗嫩枝剪去葉片后，用洗潔精溶液清洗，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗后，用0.05%升汞溶液消毒6min，用無(wú)菌水沖洗后，再用升汞溶液重復(fù)消毒1次。王瑞等[36]將外植體用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕洗，將莖段置于流水下沖洗2～3h，先用75%乙醇快速滅菌10s，然后用無(wú)菌水沖洗3次，接著用0.1%的升汞消毒2min，用無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞消毒3min，最后用無(wú)菌水沖洗5次。賈效成等[37]也采用了類似的方法，取油茶頂芽或腋芽在流水下沖洗1h，先用75%乙醇快速滅菌10s，然后用無(wú)菌水沖洗3次，接著用0.1%升汞消毒2min，用無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒3min，最后用無(wú)菌水沖洗5次。代忠迪等[33]采用2次消毒來降低污染率：第1次消毒時(shí)，將帶芽莖段外植體剝?nèi)ネ鈱尤~鞘，用76％的乙醇消毒，然后用0.2％升汞消毒，再用無(wú)菌水漂洗，然后剝?nèi)ブ袑尤~鞘用0.1％升汞消毒，再用無(wú)菌水漂洗若干次；第2次消毒時(shí)，用75％的乙醇消毒16s，無(wú)菌水沖洗5次。

在傳統(tǒng)的“乙醇+升汞”表面消毒方法的基礎(chǔ)上，輔以超聲和低溫冷處理可更好地清除外植體表面雜質(zhì)，并有助于洗脫外植體內(nèi)酚類物質(zhì)，降低污染率和褐化率。具體做法：取油茶樹當(dāng)年萌發(fā)的春梢（1/3～1/2長(zhǎng)度的枝條基部由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚┳鳛橥庵搀w，依次用乙醇和升汞進(jìn)行表面滅菌，然后依次進(jìn)行超聲處理（外植體浸入無(wú)菌水中，在300～500W、10～30℃條件下超聲處理2～4h）和無(wú)菌冷處理（外植體浸入無(wú)菌水中，置于3～5℃冰箱中4～6d，其間每隔1d更換1次無(wú)菌水），得到滅菌外植體，再經(jīng)升汞滅菌后，修剪成用于組織培養(yǎng)的外植體莖段[38]。

盡管常將乙醇和升汞組合使用進(jìn)行外植體表面消毒處理，但是有少數(shù)研究結(jié)果表明，乙醇和升汞處理對(duì)外植體的毒害較強(qiáng)，處理時(shí)間不易掌握。而以2.5%次氯酸鈉對(duì)油茶帶芽莖段和腋芽消毒20min的效果最好[39-40]。

為了增強(qiáng)消毒效果，有研究人員采用次氯酸鈉和升汞復(fù)合消毒處理。侯辛辛[41]取當(dāng)年生半硬油茶枝條的頂芽或帶腋芽的莖段作為外植體，先用軟毛刷蘸淡硫磺皂0.1%稀釋液刷洗，流水漂洗10min，用70%乙醇浸泡漂洗45s后，再用3種試劑進(jìn)行組合消毒。結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)使用0.1%升汞和2%次氯酸鈉消毒均不能起到滅菌的效果，外植體污染率達(dá)到100%；采用2%次氯酸鈉與0.1%升汞復(fù)合消毒的方法后，污染率降至10%以下，在此基礎(chǔ)上將0.4%多菌靈添加在培養(yǎng)基中，污染率與誘導(dǎo)率均降低，但未達(dá)到顯著水平。2%次氯酸鈉溶液（消毒15min）與0.1%升汞（消毒12min）聯(lián)合使用為最適消毒方法。

在油茶組織培養(yǎng)過程中，即使進(jìn)行了嚴(yán)格消毒，也會(huì)遇到嚴(yán)重的污染問題。因此有研究者使用抗生素、殺菌劑及防腐劑來進(jìn)行抑菌。王瑞等[42]在繼代培養(yǎng)基中分別添加不同種類和質(zhì)量濃度的抗生素和防腐劑，結(jié)果表明添加鏈霉素20mg/L的抑菌效果最佳，污染率為0，增殖系數(shù)為3.69，其次為青霉素G鈉鹽、青霉素G鈉鹽+四環(huán)素、四環(huán)素，添加多黏菌素B的抑菌效果最差，采用苯甲酸鈉、山梨酸鉀作為抑菌劑，污染率均在92%以上。張騏飛等[43]試驗(yàn)了多種消毒方法，發(fā)現(xiàn)如下方法效果最佳：取當(dāng)年生半硬枝條在流水下沖洗10min，用0.1%硫磺皂稀釋液浸泡并用軟毛刷蘸刷嫩枝條，用流水漂洗干凈后，剪成帶單個(gè)腋芽或頂芽的莖段，先用75%乙醇浸泡45s后，用0.1%升汞處理12min和2%次氯酸鈉處理15min進(jìn)行復(fù)合消毒，然后接種在添加0.1g/L的殺菌劑清菌易芽的萌動(dòng)培養(yǎng)基上。

然而在培養(yǎng)基中添加抗生素、殺菌劑及防腐劑來抑菌，可能會(huì)影響到外植體的培養(yǎng)[10]。由于野外采集的外植體不易消毒，有研究者取室內(nèi)或溫室內(nèi)萌發(fā)的新芽作為外植體。楊育紅[44]先將明月山紅花油茶多年生硬枝插入盛有濕潤(rùn)河沙的紙箱內(nèi)，以其新萌發(fā)的側(cè)芽為材料進(jìn)行試驗(yàn)。將芽于流水下沖洗1h后，用無(wú)菌水浸泡10min，用70%乙醇浸泡15s左右，然后用0.1%的升汞溶液（加少許吐溫80）滅菌4～8min，再用無(wú)菌水清洗4～5次。唐國(guó)濤等[35]將扦插成活且健壯的油茶苗種植在塑料大棚內(nèi)的花盆里，2月下旬—3月中旬取2年生扦插苗帶側(cè)芽的嫩枝，剪去葉片后用洗潔精溶液清洗，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，然后切成帶1～2個(gè)側(cè)芽的莖段，用0.05%升汞溶液消毒6min，用無(wú)菌水沖洗后，再用升汞溶液重復(fù)消毒1次。龔崢等[45]為了降低污染率，先將植株移栽上盆，待生長(zhǎng)穩(wěn)定后移入大棚管護(hù)；采集外植體前給植株的地上部分套上透明薄膜袋，每天對(duì)全株枝葉噴1次多菌靈，連續(xù)噴7d；剪取枝條后用洗衣粉溶液刷洗枝條表面，用流水沖洗0.5h，然后浸入0.025%的升汞液中20min，同時(shí)用小毛刷仔細(xì)刷洗枝條表面，流水沖洗0.5h；在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇浸泡1min，用0.1%升汞溶液消毒6min，用無(wú)菌蒸餾水沖洗6次。陳春[46]采取預(yù)培養(yǎng)的方式來降低污染率：取油茶優(yōu)良無(wú)性系閩43的帶腋芽莖段，用自來水沖洗1～2h，用無(wú)菌水沖洗2遍，用70%乙醇溶液處理30s后立刻浸入0.1%升汞溶液中消毒10～12min，或浸入0.15%升汞溶液中消毒8～10min，用無(wú)菌水沖洗5遍后瀝干，以莖尖為中心，切成2cm左右莖段，接種于未添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d，確定無(wú)菌后轉(zhuǎn)入初代培養(yǎng)基上。經(jīng)這樣處理的外植體的存活率可達(dá)45%以上。陳博雯等[47]將在4—5月或9—10月采集的半木質(zhì)化莖段，用75%乙醇消毒5s和0.1%升汞消毒10min后，接種在含有改良MS液體培養(yǎng)基的河沙基質(zhì)中，將新萌發(fā)的嫩芽接種至MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，可將未被污染的無(wú)菌芽用于下一步的組織培養(yǎng)。采用該方法不僅可降低污染率，還能有效避免褐化，有效萌芽率最高可達(dá)90.91%。劉虹[48]將去殼油茶種子置于河沙中萌發(fā)，然后取1月生實(shí)生苗帶腋芽的莖段來培養(yǎng)。雖然實(shí)生苗容易消毒，但這種組織培養(yǎng)快速繁殖體系本質(zhì)上與實(shí)生苗繁育無(wú)差別，即繁殖的植株與親本存在變異。

除消毒方法外，采集月份（即使在連續(xù)晴天時(shí)采集）可能是影響外植體表面消毒效果的重要因素。通常春季（2—3月）和秋冬季采摘的腋芽在培養(yǎng)基上容易萌發(fā)，且污染現(xiàn)象不明顯，而夏季采摘的腋芽不易萌發(fā)且易被污染，這可能與外植體的季節(jié)性帶菌情況有關(guān)[21]。王以紅等[49]以7齡‘岑軟3號(hào)’油茶母樹的健壯嫩梢為外植體，研究不同月份采摘的樣本的消毒難易程度，利用70%乙醇預(yù)處理15s和0.1%的升汞消毒（頂芽6min，莖段芽15min），結(jié)果表明無(wú)菌活外植體得率不同，2個(gè)高峰期分別為4月和10月，無(wú)菌活外植體得率最低的是8月，其次是7月。無(wú)菌活外植體得率與氣候特點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，因?yàn)楦邷馗邼癍h(huán)境有利于外植體表面的微生物繁殖。張偉寧[50]采用與劉海英[29]類似的方法進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在4—6月、7—9月、10—12月3個(gè)時(shí)間段采集的半木質(zhì)化帶腋芽莖段中，以4—6月所采集材料的萌發(fā)效果最佳，用0.1%升汞處理8min的消毒效果最好，污染率為7.33%，褐化率為5.87%，萌發(fā)率為83.11%。陳博雯等[47]的研究結(jié)果表明，帶腋芽的枝條經(jīng)消毒處理后，秋冬季節(jié)污染率較低，1月份污染率最低（26.00%），2月份起隨著當(dāng)?shù)貧鉁鼗厣蜐穸燃哟?，污染率逐漸升高，至4月份達(dá)最高（66.00%），8月份以后逐漸降低。11月—次年2月的消毒效果較好。以無(wú)木質(zhì)化、半木質(zhì)化、木質(zhì)化莖段為材料，消毒效果差異不大?？碌て糩30]的研究結(jié)果表明，帶腋芽莖段最佳取材時(shí)期為4—6月，此時(shí)期的材料污染率、褐化率及死亡率均較低，而腋芽萌發(fā)率最高，培養(yǎng)20d后達(dá)75.55%。

1.2外植體和培養(yǎng)物的褐化

除污染問題外，由于油茶等山茶科植物中酚類物質(zhì)含量較高，酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素合成的前體，所以在油茶組織培養(yǎng)過程中極易發(fā)生褐變，嚴(yán)重褐變會(huì)導(dǎo)致外植體和培養(yǎng)物的死亡[20-21]。闕生全等[51]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)油茶外植體褐化程度與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類（如2，4-D、KT和NAA）及其濃度、無(wú)機(jī)鹽含量等因素有關(guān)。較高的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中較高濃度的無(wú)機(jī)鹽、較高濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及木質(zhì)化程度高的外植體均會(huì)促進(jìn)褐化的發(fā)生，在培養(yǎng)基中加入吸附劑能有效抑制褐化的發(fā)生。吸附劑活性炭和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及抗壞血酸（維生素C）、硫代硫酸鈉（Na2S2O3）和檸檬酸3種抗氧化劑對(duì)褐化的影響存在差異，以吸附劑的抗褐化效果最好，維生素C效果次之，Na2S2O3和檸檬酸效果較差。接種后進(jìn)行暗處理，可在一定程度上減輕褐化反應(yīng)。戴小英等[52]發(fā)現(xiàn)在增殖過程中，以H改良培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基可有效防止油茶外植體褐化，比在培養(yǎng)基中添加活性炭的效果好。蔡玲等[53]發(fā)現(xiàn)在岑軟2號(hào)油茶繼代增殖培養(yǎng)基中添加20～25mg/L的維生素C，能有效減少油茶繼代芽的褐化，褐化率從73%降低到4%。

1.3培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件

油茶組織培養(yǎng)快速繁殖研究始于20世紀(jì)70年代末—80年代初。顏慕勤等[11]最早對(duì)10年生以上的老齡油茶的嫩莖及莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)用SH或H作基本培養(yǎng)基，并添加不同NAA和BAP組合，較難培養(yǎng)出愈傷組織，經(jīng)7～8周培養(yǎng)，僅60%～70%的外植體長(zhǎng)出愈傷組織，且無(wú)瘤狀物及綠芽出現(xiàn)，但根發(fā)育良好。顏慕勤[14]采用添加有不同種類及濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的改良ER固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)在2—3月采集的岑溪軟枝油茶成年樹腋芽。30d后腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)開始分化叢生小苗，且芽基部能不斷分化叢生苗。此后，關(guān)于油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的研究報(bào)道持續(xù)出現(xiàn)。以油茶芽和莖段為外植體的組織培養(yǎng)研究大多采用MS、WPM、H改良、1/2MS作為基本培養(yǎng)基，再添加不同類型和不同濃度的細(xì)胞分裂素（6-BA或BA、ZT、TDZ）和生長(zhǎng)素（NAA、IBA、IAA），有時(shí)會(huì)添加GA31.0～6.0mg/L或有機(jī)附加物如水解酪蛋白（CH）500～600mg/L，達(dá)到改善培養(yǎng)效果的目的（表1）。

目前主要采用頂芽、腋芽和帶芽莖段進(jìn)行油茶組織培養(yǎng)與快速繁殖研究。莖尖分生組織可用于脫除植物病毒和種苗快速繁殖，但由于外植體體積小，培養(yǎng)起來相對(duì)較困難，鮮見報(bào)道，目前僅見張桂琴等[63]采用改良1/2MS培養(yǎng)基對(duì)大果紅花油茶芽尖組織進(jìn)行培養(yǎng)的報(bào)道。油茶組織培養(yǎng)快速繁殖以芽生芽途徑（如叢生芽途徑）為主，這種方式是以促進(jìn)芽原基上腋芽的不斷提早萌發(fā)來實(shí)現(xiàn)數(shù)量增殖。培養(yǎng)階段主要分為芽誘導(dǎo)或萌發(fā)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)幾個(gè)階段，一般不涉及誘導(dǎo)愈傷組織及愈傷組織分化。有研究者以油茶芽和帶芽莖段為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織[26-28，37，64]，但一般認(rèn)為利用帶芽的莖段和頂芽為外植體，經(jīng)愈傷組織途徑對(duì)油茶快繁的意義有限。不過，在其他外植體難以再生的情況下，或可將該方法與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合使用[65]。油茶組織培養(yǎng)中較為重要的2個(gè)階段分別是增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。實(shí)現(xiàn)苗芽良好增殖是組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，生根則關(guān)系到得到完整的再生植株及油茶組織培養(yǎng)快速繁殖真正進(jìn)入生產(chǎn)實(shí)踐。

在油茶增殖培養(yǎng)研究方面，戴小英等[52]發(fā)現(xiàn)，以MS、WPM為基本培養(yǎng)基時(shí)，褐化嚴(yán)重，葉片易出現(xiàn)卷曲、脫落，以H改良為基本培養(yǎng)基可明顯減少褐化現(xiàn)象，有較多有效芽產(chǎn)生，以H改良+BA2.0mg/L+IAA1.0mg/L的增殖效果為最佳。王瑞等[36]以‘湘林1號(hào)’組培無(wú)菌苗為材料，研究了基本培養(yǎng)基（WPM、MS和B5）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)類型及濃度對(duì)油茶組培苗增殖體系的影響，發(fā)現(xiàn)以WPM+6-BA5.0mg/L+NAA0.01mg/L+生物素1.0mg/L為培養(yǎng)基時(shí)增殖系數(shù)最高，以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L+生物素0.5mg/L為培養(yǎng)基時(shí)新梢生長(zhǎng)效果最好。蔡玲等[53]以‘岑軟2號(hào)’組培繼代芽為材料，研究了幾種影響油茶組培芽增殖與生長(zhǎng)的因素，發(fā)現(xiàn)在繼代培養(yǎng)基（改良MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L）中添加CH200或300mg/L，不僅能有效地提高繼代芽增殖系數(shù)，還能促進(jìn)芽生長(zhǎng)，縮短培養(yǎng)時(shí)間8～10d。同時(shí)添加20mg/L維生素C能有效減少油茶繼代芽褐化的發(fā)生。油茶組培繼代芽培養(yǎng)最適宜的光照條件是在自然散射光（2000～3000lx）下培養(yǎng)10d，后期移至3000～5000lx光照條件下再培養(yǎng)20d，每瓶的有效芽可達(dá)23株。He等[66]研究了光質(zhì)對(duì)普通油茶不定芽增殖的影響，發(fā)現(xiàn)在紅藍(lán)組合光（4∶1）條件下增殖系數(shù)最高，葉片也最厚。曾艷玲等[62]發(fā)現(xiàn)，在芽誘導(dǎo)階段采用白光（誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.01mg/L），在增殖、壯苗和生根階段采用紅藍(lán)光（紅、藍(lán)為4∶1，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0～4.0mg/L+IBA0.01～0.20mg/L，壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+GA35.0mg/L+IAA0.01mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS），可促進(jìn)油茶帶芽莖段植株再生。

油茶生根培養(yǎng)方面，顏慕勤等[13]最早進(jìn)行了探索，采用不同濃度的吲哚丁酸、吲哚乙酸及萘乙酸等生長(zhǎng)素，及固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、蛭石及濾紙紙橋等培養(yǎng)基進(jìn)行生根試驗(yàn)。在參試的3種生長(zhǎng)素中，添加NAA處理的生根率最高（100%），其根系粗壯，須根多，出根快，僅培養(yǎng)7～8d即開始出根。添加IBA處理的生根率明顯低于添加NAA處理，添加IAA處理中組培苗雖有一定的生根能力，但切口處易生愈傷組織，移栽后愈傷組織易發(fā)黑壞死，影響小苗的成活率。最佳誘導(dǎo)生根的NAA質(zhì)量濃度為8mg/L。在4種培養(yǎng)基中，濾紙紙橋培養(yǎng)的生根效果最佳，在瓊脂培養(yǎng)基上組培苗易生愈傷組織，在液體培養(yǎng)基上組培苗不但生根量少，而且多數(shù)植株僅在液面以上部分生根，液面以下部分生根量較少，呈明顯的倒塔形。在其后的研究報(bào)道中，大多采用附加較高濃度的生長(zhǎng)素（或者同時(shí)附加較低濃度的細(xì)胞分裂素）的低鹽基本培養(yǎng)基（如1/2MS和WPM等）（表1）。吳幼媚等[67]采用1/2MS、1/2WPM、1/2ER基本培養(yǎng)基對(duì)油茶‘岑軟2號(hào)’無(wú)性系組培苗生根培養(yǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明基本培養(yǎng)基是影響油茶組培苗生根的重要因素，其次是培養(yǎng)溫度，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響較小的因素。1/2ER為油茶組織培養(yǎng)最適基本培養(yǎng)基，ABT60.5mg/L+IAA2.0mg/L+NAA0.8mg/L為最優(yōu)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，室溫（28±2）℃、光強(qiáng)2500～3500lx有利于油茶組培苗生根。

油茶組培苗生根存在較大的難度，采用含NAA和IBA的常規(guī)生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，生根苗大多僅1條主根，須根較少[20，40]。唐國(guó)濤等[35]以1/4MS、1/2MS、MS、B5等基本培養(yǎng)基配以NAA、IBA、IAA、GA3、2，4-D進(jìn)行生根試驗(yàn)，經(jīng)過多次多組合試驗(yàn)均未能篩選出適合油茶生根的培養(yǎng)基。龔崢等[45]發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的培養(yǎng)方法無(wú)法誘導(dǎo)廣寧紅花油茶植株生根，但采用針對(duì)調(diào)節(jié)極性表現(xiàn)的程序系列培養(yǎng)，可促進(jìn)不定根分化，提高生根率，但作者未提供技術(shù)細(xì)節(jié)。譚曉風(fēng)等[58]發(fā)現(xiàn)在1/2MS+IBA0.5mg/L的瓊脂培養(yǎng)基中加入珍珠巖，使油茶根系能夠充分呼吸，大大提高了油茶生根率和移栽成活率。制備方法：配制1/2MS+IBA0.5mg/L瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂為7～10g/L，pH5.0～5.5），然后用網(wǎng)兜包好粉碎的珍珠巖，置于融化的培養(yǎng)基中，使珍珠巖充分吸收培養(yǎng)基，稍瀝干后滅菌即可。

鑒于在常規(guī)生根培養(yǎng)基上組培苗生根存在困難，研究者多采用兩步法促進(jìn)組培苗生根，即首先在高濃度的生長(zhǎng)素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，然后轉(zhuǎn)接到無(wú)任何生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上進(jìn)行根的發(fā)育，或者首先用高濃度的生長(zhǎng)素溶液浸泡處理苗芽基部，然后進(jìn)行扦插（即瓶外生根法）[68]。范曉明[54]采用1000mg/L的IBA處理芽苗基部5s，然后轉(zhuǎn)入1/2MS空白培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。陳永忠等[55]采用1000mg/L的IBA溶液浸泡苗基部10s，然后接種在1/4MS+AC200培養(yǎng)基。張偉寧[50]發(fā)現(xiàn)瓶?jī)?nèi)生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+NAA2.0mg/L+蔗糖20g/L，將小苗莖段基部在1000mg/L的NAA溶液中蘸20s，然后在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的效果最佳。袁德義等[57]發(fā)現(xiàn)試管苗經(jīng)1g/L的IBA處理5s后，轉(zhuǎn)入1/2MS空白培養(yǎng)基培養(yǎng)，50d后生根率高達(dá)88.3%。陳永忠等[56]采用瓶外生根方法（將生根和移栽步驟合二為一）可提高組培苗的生根率和成活率。具體方法：將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出后，在0.1%瑞毒霉-錳鋅溶液中浸泡2～4min進(jìn)行消毒，之后將組培苗基部在500～8000mg/LKIBA溶液中浸泡3～4s，然后扦插在由黃心土、炭化谷殼灰、細(xì)沙按體積比1∶2～3∶1配制而成的基質(zhì)上，最后用透光薄膜封口。劉虹[48]通過對(duì)比瓶?jī)?nèi)生根和瓶外生根方法，發(fā)現(xiàn)瓶?jī)?nèi)生根處理的生根率較低，根系脆弱，移栽成活率也較低，瓶外生根（100mg/LNAA浸泡幼苗45min后扦插移栽）處理的生根率較高，且根系粗壯，移栽成活率高。唐國(guó)濤等[35]以細(xì)沙作基質(zhì)（將濕潤(rùn)的細(xì)沙裝入玻璃瓶中，厚度2.5～3.0cm，然后經(jīng)高壓滅菌處理），將培養(yǎng)60d以上、長(zhǎng)5cm的木質(zhì)化油茶莖段（切去基部2cm以內(nèi)的葉片）基部在0.1mg/L、深度約2cm的GGR（6號(hào)生根粉）溶液中浸泡12h，然后進(jìn)行扦插，生根率達(dá)95%。唐國(guó)濤等[35]認(rèn)為油茶組培苗生根較為困難，可能與誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)過程中6-BA和外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在油茶組培苗中的累積有關(guān)，將繼代培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)接到無(wú)6-BA和外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可有效降低6-BA和外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑累積效應(yīng)對(duì)苗木產(chǎn)生的影響。戴小英等[59]比較了油茶組培苗的根系質(zhì)量及移栽成活率，發(fā)現(xiàn)試管外生根方法更具優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)試管內(nèi)誘導(dǎo)根系需40d以上，且生根率和根數(shù)量不理想，而采用高濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行短期誘導(dǎo)（在1/2H改良+NAA3.0mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d）后，蘸取生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑GGR200mg/L，直接扦插到黃心土和草木灰（6∶1）基質(zhì)上，30d后組培苗可在基質(zhì)中產(chǎn)生根系。閆曉芳等[61]采用1.5～3.0g/LIBA誘導(dǎo)處理芽苗3～30min后，接種到1/2MS+多效唑2～6mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，可促進(jìn)油茶組培苗生根。為了繞過油茶組培苗生根困難環(huán)節(jié)，有研究者對(duì)增殖芽進(jìn)行壯芽和煉芽后，將其作為接穗，以種子萌發(fā)的胚芽為砧木，進(jìn)行芽苗砧嫁接[33，43]。

此外，為探明油茶組培苗生根機(jī)制，王瑞等[69]研究了油茶組培苗生根過程中生理生化指標(biāo)的變化，陳曉明等[70]研究了油茶組培苗生根過程中過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等的活性變化。

2油茶胚、子葉、葉片等的組織培養(yǎng)

采用油茶胚、子葉、葉片等外植體進(jìn)行培養(yǎng)，可以經(jīng)直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生或直接器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)植株再生（即不經(jīng)過愈傷組織階段），也可經(jīng)愈傷組織階段通過間接體細(xì)胞胚胎或間接器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)植株再生。特別是間接體細(xì)胞胚胎或器官發(fā)生途徑需要首先誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，再經(jīng)體細(xì)胞胚胎或器官發(fā)生途徑產(chǎn)生完整植株，最有利于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯，因此受到許多研究者的重視[10]。此外，采用幼胚培養(yǎng)產(chǎn)生完整植株，可以在遠(yuǎn)緣雜交中挽救雜種胚，對(duì)于油茶遠(yuǎn)緣雜交育種具有重要意義[10]。以油茶胚、子葉、葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，大多以MS為基本培養(yǎng)基，采用不同比例的細(xì)胞分裂素（6-BA或BA、KT、ZT、TDZ）和生長(zhǎng)素（NAA、IBA、IAA）組合。與培養(yǎng)芽和帶芽莖段不同，有研究者采用生長(zhǎng)素2，4-D來誘導(dǎo)胚、子葉、葉片產(chǎn)生愈傷組織（表2）。

2.1油茶胚和子葉的組織培養(yǎng)

油茶胚和子葉培養(yǎng)有2種情況，一種是取成熟胚和子葉進(jìn)行培養(yǎng)，另一種是取未成熟胚和子葉進(jìn)行培養(yǎng)。由于油茶種子十分堅(jiān)硬，難以從成熟種子中分離胚和子葉，因此，一般先將種子表面消毒后進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，然后取子葉和胚軸進(jìn)行培養(yǎng)。從正在發(fā)育的種子中切割分離未成熟胚（幼胚）和子葉相對(duì)容易，因此，通常取幼果或幼嫩種子進(jìn)行表面消毒，然后取胚、子葉和胚軸進(jìn)行培養(yǎng)。與大田植株的葉片相比，合子胚（包括子葉和胚軸）的表面消毒較為容易，而且培養(yǎng)反應(yīng)能力更強(qiáng)，更易培養(yǎng)。但是油茶通常為異株授粉，合子胚來源于母株的有性雜交后代，與母株在遺傳上是異質(zhì)的。

顏慕勤[12]首先報(bào)道在油茶種子的子葉基部可誘導(dǎo)體細(xì)胞胚狀體發(fā)生。其采用1～2月齡無(wú)菌實(shí)生苗的節(jié)間及下胚軸作為外植體，可誘導(dǎo)出愈傷組織和小瘤狀物。用SH或H作為基本培養(yǎng)基，附加NAA0.5mg/L和BAP0.5mg/L最有利于小瘤狀物的產(chǎn)生；再加入10mL油茶子葉浸出液可以把瘤狀物的產(chǎn)生率從1%增加至10%。將外植體轉(zhuǎn)移到無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的SHO培養(yǎng)基上，會(huì)進(jìn)一步長(zhǎng)出不定芽及小苗[11]。其后，彭秋發(fā)等[72]、蔡玲等[74]采取油茶種子無(wú)菌萌發(fā)后的子葉等外植體進(jìn)行培養(yǎng)，林青[76]、Li等[77]將成熟種子的種仁進(jìn)行表面消毒，然后切取油茶成熟種胚（帶有胚乳組織）接種在1/2MS培養(yǎng)基中獲得無(wú)菌苗，然后取無(wú)菌苗的子葉、下胚軸進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。

隆振雄[16]最早對(duì)油茶幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，將油茶幼果進(jìn)行常規(guī)表面消毒（先用70%的乙醇消毒30s，再放入0.1%的升汞中消毒30min，然后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3～4次）后，用無(wú)菌刀切割并剝出幼果種胚，再割成長(zhǎng)2～3mm的組織塊接種。隆振雄[16]采用N6、White和MS基本培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明在White培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果良好，其次是MS培養(yǎng)基。White+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L或White+2，4-D0.02mg/L+NAA0.05mg/L+BA0.5mg/L培養(yǎng)基對(duì)油茶幼胚愈傷組織及胚狀體的誘導(dǎo)效果較好。在同一誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，油茶幼胚組織的胚狀體誘導(dǎo)率與加入鉬酸銨量呈現(xiàn)正相關(guān)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入10mg/L鉬酸銨，誘導(dǎo)率約提高1.6%。幼胚發(fā)育時(shí)期從3月油茶幼果開始膨大時(shí)起，至9月中旬茶果即將成熟時(shí)止。在幼胚尚未形成時(shí)取樣培養(yǎng)，難以獲得成功；只有在幼胚長(zhǎng)2～3mm時(shí)取樣培養(yǎng)，才能誘導(dǎo)出愈傷組織，并產(chǎn)生胚狀體。油茶幼胚胚狀體的最佳芽分化培養(yǎng)基為N6+IAA0.5mg/L+BA2.0mg/L+LH（水解乳蛋白）500mg/L。N6培養(yǎng)基的分化效果較好，其次是MS培養(yǎng)基。分化植株的頻率在較大程度上取決于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和比值，如在N6分化培養(yǎng)基中，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值為4的條件下，添加BA比添加KT的分化效果好，分化植株的頻率高。為了保持優(yōu)良組合的雜交優(yōu)勢(shì)并擴(kuò)大再繁殖，盧天玲[17]對(duì)油茶未成熟子葉和幼胚進(jìn)行了離體培養(yǎng)，采用附加2mg/LNAA和4mg/LBA的MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，然后轉(zhuǎn)入減少或無(wú)生長(zhǎng)素及提高細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上分化叢生苗，也可以在再分化培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)叢生苗。生長(zhǎng)素NAA、IAA對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)與分化均有良好效果，BA、ZT、NAA的適當(dāng)配比是誘導(dǎo)叢生小苗的重要因素。只有綠色或黃綠色的愈傷組織才能分化。培養(yǎng)基含2，4-D或5%以上的蔗糖均不利于愈傷組織綠化，也不利于分化。6月之后，油茶種子的胚乳已完全消失，以此時(shí)的子葉和幼胚作為外植體較易誘導(dǎo)成苗。韓春霞[88]以六倍體‘華碩’自然授粉后7—8月份的幼胚為外植體，發(fā)現(xiàn)在WPM+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+NAA1.5mg/L+6-BA2.0mg/L培養(yǎng)基上，幼胚成苗效果最佳。畢方鋮等[40]采用普通油茶優(yōu)良無(wú)性系‘湘林4號(hào)’油茶幼果為材料，進(jìn)行表面消毒后，直接剝?nèi)ネ鈱臃N皮，取出幼胚，將子葉基部切成0.3～0.5cm3的組織塊接種。此后，范曉明[54]、范曉明等[73]、胡玉玲等[75]、侯辛辛[41]、王江英等[80]、龐芳芹等[81]采取類似方法對(duì)果實(shí)進(jìn)行滅菌，然后取出種子，分離幼胚和子葉進(jìn)行培養(yǎng)。張智俊[39]、張智俊等[71]將油茶未成熟果實(shí)進(jìn)行表面消毒后，剝?nèi)ネ夥N皮，置于無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，然后將子葉切成小塊作為外植體，結(jié)果表明附加適量的2，4-D和KT有利于胚性愈傷組織的形成，油茶胚狀體起源于單細(xì)胞原胚或者多細(xì)胞團(tuán)，多從表皮細(xì)胞的胚性愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生[89]。

2.2油茶葉片的組織培養(yǎng)

與合子胚（包括子葉和胚軸）相比，以在無(wú)性繁殖植株上采集的葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)，其再生植株理論上與母株在遺傳上是同質(zhì)的，且油茶葉片來源豐富，容易取材。但是葉片隨其生長(zhǎng)部位和發(fā)育年齡不同，表達(dá)細(xì)胞全能性的能力是不同的，培養(yǎng)反應(yīng)性比合子胚差，從大田采集的葉片還存在難消毒和容易褐化的問題。為了解決表面消毒難的問題，有研究者取組培苗的葉片[90]，或?qū)嵣绲娜~片培養(yǎng)[48，83]，但后者會(huì)帶來遺傳上的異質(zhì)性問題。

王瑞等[82]取油茶優(yōu)良無(wú)性系‘湘林1號(hào)’和‘湘林4號(hào)’當(dāng)年生枝條上完全展開的嫩葉進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種愈傷組織的萌發(fā)時(shí)間以及誘導(dǎo)率差別較大。‘湘林1號(hào)’以MS+IBA0.01mg/L+KT0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+NAA2.0mg/L為培養(yǎng)基最佳，‘湘林4號(hào)’以IBA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L+KT1.0mg/L+NAA2.0mg/L為培養(yǎng)基最佳，對(duì)于‘湘林4號(hào)’來說，在4種基本培養(yǎng)基（MS、WPM、N6、改良ER4）中，以改良ER4為佳。此外，低溫預(yù)處理5～10d有助于愈傷組織的誘導(dǎo)，光照條件（暗培養(yǎng)較好）和葉片部位（葉柄較差）均對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有影響。袁德義等[57]通過直接器官發(fā)生途徑使葉片外植體產(chǎn)生不定芽，蔡冬元[84-85]則以間接器官發(fā)生途徑使外植體產(chǎn)生不定芽。黃武[86]以幼嫩枝條頂端嫩葉為外植體，用MS+毒莠定16mg/L+CuSO42μmol/L誘導(dǎo)出白色松脆的愈傷組織，用WPM+NAA1mg/L+6-BA1mg/L誘導(dǎo)出綠色致密的愈傷組織，用WPM+KT0.5mg/L+NAA0.5mg/L誘導(dǎo)出結(jié)節(jié)性愈傷組織。對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，可獲得4種類型的愈傷組織。在MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+ZT0.5mg/L+TDZ1mg/L上可獲得結(jié)構(gòu)松脆的白色愈傷組織，轉(zhuǎn)接到WPM+NAA2mg/L+ZT2mg/L培養(yǎng)基上6周后可形成黃色胚性愈傷組織，再轉(zhuǎn)接到MS+NAA0.5mg/L+2，4-D2mg/L培養(yǎng)基上8周后可分化出體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚在MS+6-BA1mg/L+NAA0.5mg/L培養(yǎng)基上4周后可產(chǎn)生綠色子葉。子葉在MS+6-BA1mg/L培養(yǎng)基上可直接分化成芽，將子葉切碎后轉(zhuǎn)接到MS+6-BA1mg/L+NAA0.5mg/L培養(yǎng)基上可脫分化形成愈傷組織；剝離出胚性愈傷和體細(xì)胞胚，在MS+NAA0.5mg/L+2，4-D2mg/L培養(yǎng)基上繼代增殖，可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚循環(huán)培養(yǎng)。王瑞等[90]以油茶優(yōu)良無(wú)性系‘湘林1號(hào)’的無(wú)菌組培苗葉片為外植體，比較分析了蔗糖、果糖、葡萄糖、白糖和麥芽糖5種碳源以及不同蔗糖濃度對(duì)油茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果顯示在碳源中蔗糖（30mg/L）處理的誘導(dǎo)率最高（100%），以白糖為碳源誘導(dǎo)率達(dá)到93.3%，其可作為替代碳源。

以葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，酚類物質(zhì)會(huì)從葉片切口處釋放到周圍的培養(yǎng)基上，導(dǎo)致葉片褐化死亡，愈傷組織的誘導(dǎo)率降低。劉海英[29]發(fā)現(xiàn)低溫預(yù)處理7d能較好地抑制葉片愈傷組織褐化，張偉寧[50]、柯丹萍[30]的研究結(jié)果表明消毒后暗培養(yǎng)7d能有效抑制褐化現(xiàn)象。黃國(guó)文等[91]以油茶葉片為外植體，研究了誘導(dǎo)愈傷組織過程中降低外植體褐化率和提高誘導(dǎo)率的方法，發(fā)現(xiàn)在水中弱光培養(yǎng)枝條1～2d，0.3g/L的維生素C溶液漂洗外植體2～3min，在培養(yǎng)基中添加1.0g/L活性炭和0.3g/L維生素C等方法均可以顯著減少外植體的褐化。優(yōu)化的培養(yǎng)基WPM+6-BA1.0mg/L+2，4-D1.5mg/L+蔗糖15.0g/L+葡萄糖15.0g/L+瓊脂6.5g/L+活性炭1.0g/L+維生素C0.3g/L可提高外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率，減少外植體褐化。黃武[86]消除越南油茶外植體褐化的辦法是采用在無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7d，以釋放酚類物質(zhì)，再轉(zhuǎn)移到添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)進(jìn)行脫分化。

3油茶花藥的組織培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)是獲得單倍體植株的有效手段，是植物單倍體育種和倍性操作的重要方法[10]?；ㄋ幣囵B(yǎng)的表面消毒相對(duì)容易，采集適宜花粉發(fā)育時(shí)期的未開放花苞，經(jīng)低溫預(yù)處理后除去表面幾層花瓣，經(jīng)常規(guī)消毒即可。如隆振雄[18]用70%乙醇消毒0.5min，然后用0.1%升汞中滅菌10min，無(wú)菌水漂洗3～4次。

3.1適宜的花粉發(fā)育時(shí)期

隆振雄[18]最早報(bào)道對(duì)油茶花藥進(jìn)行培養(yǎng)，他發(fā)現(xiàn)在不同花粉發(fā)育時(shí)期進(jìn)行取樣，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率存在明顯差異，以四分體期花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高（46.43%），單核晚期次之（21.67%），雙核初期花藥則較少產(chǎn)生愈傷組織（4%）。聞麗[92]取大部分小孢子處于單核時(shí)期發(fā)育階段的花蕾作為外植體來源，對(duì)8個(gè)油茶物種的花藥進(jìn)行了培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)盛花初期所采樣品的愈傷組織誘導(dǎo)率高于盛花末期所采樣品的誘導(dǎo)率。丁植磊[93]取小孢子發(fā)育處于減數(shù)分裂單核靠邊期的材料，對(duì)12個(gè)油茶物種的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明在幼壯齡油茶植株背陰面、枝條下部以及始花期采摘花蕾，可獲得較高的油茶愈傷組織誘導(dǎo)率和繼代培養(yǎng)增殖效果。范曉明等[94]以攸縣油茶花藥為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)花粉四分體時(shí)期為油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最佳時(shí)期，取幼壯齡油茶植株背陰面、枝條下部以及始花期花蕾較為適合。侯辛辛[41]認(rèn)為處于單核靠邊期的花藥為誘導(dǎo)油茶胚性愈傷組織的合適外植體（花蕾橫縱長(zhǎng)度比在0.53左右）。

3.2低溫預(yù)處理

對(duì)于大多數(shù)植物花藥培養(yǎng)而言，低溫預(yù)處理有助于提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。低溫預(yù)處理同樣可提高油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。李建安等[95]的小果油茶花藥培養(yǎng)結(jié)果表明，不同低溫（4℃）預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的影響，預(yù)處理12、6、0d，愈傷組織誘導(dǎo)率分別為2.99%、2.68%和0.83%。說明經(jīng)過一定時(shí)間的低溫預(yù)處理可提高小果油茶的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率。聞麗[92]于10月上中旬—1月下旬摘取普通油茶、小果油茶、攸縣油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、越南油茶、宛田紅花油茶8個(gè)品種的花蕾作為材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同物種、低溫（4℃）預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)，油茶花藥的愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。低溫預(yù)處理有利于油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，但不同油茶物種最適宜的預(yù)處理時(shí)間不同，普通油茶為10d左右，攸縣油茶為5～10d，越南油茶為15d左右，浙江紅花油茶為10d左右，廣寧紅花油茶為15d左右，騰沖紅花油茶為10d左右，宛田紅花油茶為15d，小果油茶花藥經(jīng)過低溫預(yù)處理其誘導(dǎo)率未明顯提高，而普通油茶和小果油茶的花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率均達(dá)到了70%以上[96]。范曉明等[94]發(fā)現(xiàn)攸縣油茶花藥低溫預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)應(yīng)在10d以內(nèi)。

3.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

隆振雄[18]研究了N6、MS、B5、MB、Miller和White等基本培養(yǎng)基對(duì)油茶花藥培養(yǎng)效果的影響，并在培養(yǎng)基中添加了2，4-D0.5mg/L、NAA0.2mg/L、BA0.2mg/L、KT1.5mg/L，結(jié)果表明MB、N6和White較為適宜用于油茶花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)率高，而且所誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，呈圓形瘤狀物，乳白色，質(zhì)量較好。以蔗糖為碳源較好。采用器官分化培養(yǎng)基N6+BA2mg/L+IAA0.5mg/L+5BR0.5mg/L+核黃素1mg/L+蔗糖3%進(jìn)行分化培養(yǎng)時(shí)，愈傷組織僅出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，未能再生完整植株。進(jìn)行花藥愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)不加人工光照，但培養(yǎng)室內(nèi)有自然散射光；在進(jìn)行愈傷組織器官分化時(shí)，置于2000lx光照條件下進(jìn)行，每日補(bǔ)照明10～12h。

李建安等[95]在對(duì)小果油茶和廣寧紅花油茶的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)廣寧紅花油茶花藥具有較強(qiáng)的愈傷組織誘導(dǎo)能力，而小果油茶花藥褐化嚴(yán)重，誘導(dǎo)率較低。在最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D0.6mg/L+NAA0.4mg/L和B5+2，4-D1.2mg/L+6-BA0.4mg/L上，廣寧紅花油茶愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)94.67%和91.00%，小果油茶則分別為8.00%和3.34%。MS培養(yǎng)基有利于愈傷組織生長(zhǎng)增殖。

聞麗等[97]在進(jìn)行油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在MS、B5、N6、Miller基本培養(yǎng)基中，MS的誘導(dǎo)效果最好。2，4-D0.5mg/L和6-BA0.2mg/L為較佳的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合。3%～4%蔗糖溶液的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好。在黑暗條件下培養(yǎng)可以提高油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率[85]。

丁植磊等[98]發(fā)現(xiàn)在油茶12個(gè)物種花藥中，基因型不同，愈傷組織誘導(dǎo)率也不同。以小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江紅花油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶的愈傷組織誘導(dǎo)率較高（40%～70%），小果油茶、普通油茶的愈傷組織誘導(dǎo)率甚至高達(dá)70％。但紅皮糙果油茶、廣西糙果油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶、攸縣油茶的花藥褐化較嚴(yán)重。在繼代培養(yǎng)中6-BA和KT均有較好的促進(jìn)作用，小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江紅花油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶的愈傷組織均增殖較好。MS培養(yǎng)基適合油茶不同物種愈傷組織的誘導(dǎo)；在MS、N6培養(yǎng)基上能獲得較好的愈傷組織繼代增殖效果（均附加蔗糖35g/L，瓊脂7g/L，pH值5.8）。NAA0.5mg/L+2，4-D0.6mg/L及6-BA0.2mg/L+2，4-D0.5mg/L適合用于不同物種白花油茶與紅花油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)；MS培養(yǎng)基附加NAA0.5mg/L+ZT0.5mg/L、NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L或6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L均能獲得較好的愈傷組織增殖效果。添加0.2%～0.8%活性炭對(duì)于油茶花藥愈傷組織有抑制增殖作用；在愈傷組織繼代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)中，當(dāng)添加BA0.4mg/L、NAA1.0mg/L時(shí)，活性炭能起到較好的防止褐化和促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。暗培養(yǎng)5～10d改善愈傷組織繼代增殖的效果較好。顏色嫩綠純正、質(zhì)地致密稍硬的愈傷組織的增殖效果最好。繼代時(shí)間以（30±5）d為宜，繼代6次后愈傷組織增殖效果較差[93]。

葉思誠(chéng)等[99]對(duì)浙江紅山茶花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)2，4-D、KT（6-BA）、TDZ之間存在協(xié)同作用，通過特定組合能夠更容易誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，提高愈傷組織誘導(dǎo)率。適當(dāng)增加蔗糖的質(zhì)量濃度（30～80g/L），提高滲透壓，能夠提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。此外，CH、LH、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的添加也可以促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚的形成和生長(zhǎng)。

范曉明等[94]將接種的攸縣油茶花藥置于（25±3）℃條件下暗培養(yǎng)25d后，再移至自控光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度2000lx，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基添加物以AgNO3效果最優(yōu)，誘導(dǎo)率最高為81.02%，繼代增殖培養(yǎng)基配以MS+6-BA2.00mg/L+NAA0.05mg/L為最佳。

侯辛辛[41]的研究結(jié)果表明適宜海南油茶花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的初代培養(yǎng)基為改良MS+2，4-D2.0mg/L+ZT2.0mg/L，胚性愈傷組織在1/2改良MS+6-BA2.0mg/L+ZT1.0mg/L+NAA0.5mg/L培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)可有效增殖，并分化出體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚在1/2改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)成熟和萌發(fā)形成再生植株，但誘導(dǎo)率較低，培養(yǎng)基配比仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。其花藥培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度為（25±2）℃。在暗培養(yǎng)條件下愈傷組織快速增殖，在光照培養(yǎng)下愈傷組織增殖緩慢，且大部分呈現(xiàn)褐色或壞死狀態(tài)，僅少部分為胚性愈傷組織狀態(tài)。暗培養(yǎng)條件對(duì)胚性愈傷組織維持和增殖更有利。

韓春霞等[100]發(fā)現(xiàn)普通油茶品種‘華金’‘華碩’‘華鑫’的花藥愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基分別為MS（去NH4+）+NAA0.5mg/L+KT2mg/L、MS（去NH4+）+NAA2mg/L+KT0.5mg/L、MS（去NH4+）+NAA1mg/L+KT2mg/L，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率分別達(dá)到94.80%、47.78%和75.00%；誘導(dǎo)胚性愈傷組織最佳配方為MS（去NH4+）+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2，4-D5μmol/L+KT5μmol/L+谷氨酰胺800mg/L+絲氨酸200mg/L，‘華金’‘華碩’‘華鑫’花藥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率分別是36.00%、56.33%、8.25%。

此外，靳皓然[101]探索了采用油茶未授粉子房和胚珠誘導(dǎo)單倍體，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子房愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+蔗糖60g/L+瓊脂7g/L+NAA0.3mg/L+TDZ2.0mg/L，未授粉胚珠誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+蔗糖40g/L+瓊脂7g/L+NAA1.0mg/L+TDZ2.0mg/L。

3.4褐變問題

油茶花藥組織培養(yǎng)同樣存在褐變問題，因此，有效控制褐變成為油茶花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵[102]。李建安等[95]發(fā)現(xiàn)小果油茶和廣寧紅花油茶的花藥愈傷組織誘導(dǎo)能力差異十分明顯，廣寧紅花油茶花藥愈傷組織容易誘導(dǎo)，而小果油茶誘導(dǎo)困難。小果油茶花藥在接種后第3天出現(xiàn)明顯褐化，10d后所有花藥均呈黑褐色，而廣寧紅花油茶花藥接種后未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，因此花藥褐化是小果油茶花藥愈傷組織發(fā)生的限制因素。聞麗[92]的研究結(jié)果也表明，不同油茶物種花藥的褐化程度不同。愈傷組織誘導(dǎo)率較高的普通油茶和小果油茶的花藥褐化程度較低，越南油茶花藥褐化程度也相對(duì)較低，其次是廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、宛田紅花油茶、浙江紅花油茶，最高是攸縣油茶。一般褐化情況越嚴(yán)重，愈傷組織誘導(dǎo)率越低。預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)組織褐化基本上無(wú)影響。油茶花藥褐化愈傷組織的組織化學(xué)分析結(jié)果表明：無(wú)褐化愈傷組織的細(xì)胞含淀粉、脂滴相對(duì)較多，這些物質(zhì)在褐化愈傷組織細(xì)胞的含量相對(duì)較少；褐化愈傷組織細(xì)胞中單寧類物質(zhì)、過氧化物酶含量相對(duì)較多，而在無(wú)褐化愈傷組織細(xì)胞中含量相對(duì)較少[103]。

4展望

油茶種苗繁育方法包括實(shí)生繁育、扦插繁育、嫁接繁育和組織培養(yǎng)繁育[104-107]。雖然研究結(jié)果表明經(jīng)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的再生植株能夠保持原無(wú)性系的優(yōu)良特性[15，71，108]，但由于油茶外植體表面消毒困難、褐化嚴(yán)重及生根困難等，還未能實(shí)現(xiàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行工廠化快繁。消毒困難和褐化問題相對(duì)容易解決，而生根困難則主要是由于木本植物本身的生理狀態(tài)，外植體培養(yǎng)反應(yīng)性差。在采集外植體時(shí)，盡量采集樹體下部的萌條（更接近幼態(tài)），或采取措施促進(jìn)主莖基部萌芽，然后再取主莖基部產(chǎn)生的萌條來培養(yǎng)[68]。

由于油茶組織培養(yǎng)和植株再生比較困難，在利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行油茶生物育種方面，目前僅見Li等[109]報(bào)道普通油茶葉肉原生質(zhì)體分離和PEG介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和Lin等[110]報(bào)道普通油茶花瓣原生質(zhì)體分離和PEG介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，尚未見油茶穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法的報(bào)道。目前，有關(guān)油茶基因組組裝和測(cè)序、重要性狀的關(guān)鍵基因克隆方面的研究取得不少進(jìn)展[111-114]。未來油茶基因工程與基因編輯的應(yīng)用仍將有賴于油茶組織培養(yǎng)和植株再生技術(shù)的突破，因此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)油茶組織培養(yǎng)研究。