【摘要】目的 探討衰老標(biāo)記物沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、p21、Ku70 mRNA在支氣管擴(kuò)張（BE）中的表達(dá)差異，并分析其與BE嚴(yán)重程度的相關(guān)性。方法 選取2022年7月至2024年6月于廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院確診的85例BE患者，作為疾病組，另納入46名肺炎康復(fù)期或其他非慢性肺部疾病而接受肺泡灌洗的患者作為對(duì)照組，進(jìn)行前瞻性研究；并根據(jù)BE嚴(yán)重程度將疾病組患者分為輕度、中度及重度。通過(guò)支氣管鏡檢查獲取肺泡灌洗液，提取RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)檢測(cè)肺泡灌洗液Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表達(dá)情況，比較疾病組和對(duì)照組，不同嚴(yán)重程度疾病組Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表達(dá)水平；通過(guò)受試者工作特征（ROC）曲線分析Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA表達(dá)水平對(duì)BE的診斷價(jià)值。結(jié)果 疾病組患者Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組；重度組Sirtuin 1、SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于輕度組，p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于輕度組，Ku70 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于輕、中度組（均P<0.05）。ROC曲線分析顯示，Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量的最佳診斷截?cái)嘀捣謩e為0.983、1.068、1.223、0.860，且4 個(gè)衰老標(biāo)志物的曲線下面積（AUC）均超過(guò)0.600，并以Ku70 mRNA的AUC最大，為0.721，診斷效能均良好（均P<0.05）。結(jié)論 BE患者對(duì)比健康人Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，p21 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯增高，和BE疾病進(jìn)展相關(guān)，且Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA相對(duì)表達(dá)量對(duì)BE疾病程度均有良好的診斷價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】沉默信息調(diào)節(jié)因子1 ; 過(guò)氧化物歧化酶 ; 細(xì)胞周期蛋白 ; DNA修復(fù)因子 ; 支氣管擴(kuò)張 ; 作用機(jī)制

【中圖分類號(hào)】R563 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-3718.2024.23.0115.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.23.036

支氣管擴(kuò)張（bronchiectasia，BE）是一種慢性進(jìn)行性的氣道炎癥性疾病，其特征為持續(xù)性咳嗽、咳痰及氣道結(jié)構(gòu)不可逆性擴(kuò)張和破壞。盡管已有研究揭示了氣道感染、慢性炎癥及氣道結(jié)構(gòu)破壞與BE相關(guān)[1]，但該疾病的確切病理機(jī)制尚未清晰。近年來(lái)，衰老生物學(xué)的快速發(fā)展為理解慢性疾病提供了新的視角，衰老標(biāo)記物在多種慢性疾病中的異常表達(dá)已被廣泛報(bào)道[2]。特別是沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirtuin1），通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞生長(zhǎng)和應(yīng)激反應(yīng)蛋白有助于細(xì)胞抗氧化和延長(zhǎng)壽命；超氧化物歧化酶2（SOD2）、p21及Ku70 mRNA分別在中和有害的自由基、控制細(xì)胞周期以響應(yīng)DNA損傷及修復(fù)DNA雙鏈斷裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-4]。然而，這些衰老標(biāo)記物在BE中的相關(guān)性研究尚屬空白，因此，本研究旨在探討Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA在BE患者肺泡灌洗液的表達(dá)差異，以及其表達(dá)情況與BE嚴(yán)重程度的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022年7月至2024年6月于廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院確診的85例BE患者，作為疾病組，另納入46名肺炎康復(fù)期或其他非慢性肺部疾病而接受肺泡灌洗的患者作為對(duì)照組，進(jìn)行前瞻性研究。對(duì)照組研究對(duì)象男性24例，女性22例；年齡42～64歲，平均（51.39±5.64）歲。疾病組患者中男性37例，女性48例；年齡34～65歲，平均（49.69±6.11）歲。兩組研究對(duì)象一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），組間可比。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《中國(guó)成人支氣管擴(kuò)張癥診斷與治療專家共識(shí)》 [5]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵經(jīng)胸部高分辨率CT（HRCT）診斷為BE；⑶入組前至少4周內(nèi)無(wú)口服、靜脈滴注或霧化吸入抗生素治療（除了長(zhǎng)期使用低劑量大環(huán)內(nèi)酯類維持治療），合并用藥情況應(yīng)盡量維持穩(wěn)定；⑷對(duì)照組研究對(duì)象為同期住院治療病情好轉(zhuǎn)恢復(fù)至肺炎康復(fù)期繼續(xù)接受肺泡灌洗的患者或其他非慢性肺部疾病如支氣管異物需接受肺泡灌洗的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴妊娠、惡性腫瘤疾病或合并嚴(yán)重疾?。ㄈ缁顒?dòng)期肺結(jié)核或心肌梗死等）；⑵不愿意參加隨訪。本研究經(jīng)過(guò)廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2022-057-03），研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 BE嚴(yán)重程度及分組 使用支氣管擴(kuò)張嚴(yán)重程度指數(shù)（BSI）量表[6]（0～26分），將85例BE患者分為輕度（0～4分，29例）、中度（5～8分，39例）、重度（≥9分，17例）。

1.2.2 肺泡灌洗液衰老標(biāo)記物mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 在進(jìn)行支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)前，患者需完成血常規(guī)、凝血功能、輸血前四項(xiàng)檢查及心電圖，并在術(shù)前6 h禁食、禁飲。手術(shù)采用局部麻醉，使用2%鹽酸利多卡因注射液（廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H45020569，規(guī)格：5 mL∶0.1 g）對(duì)鼻腔和咽喉部進(jìn)行表面麻醉。使用纖支鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)：Olympus P60）經(jīng)鼻腔進(jìn)入氣管，根據(jù)胸部CT結(jié)果，通過(guò)活檢孔注入生理鹽水以清除痰栓，最后回收灌洗液，目標(biāo)回收率為40%～50%。

使用TRIZOL試劑（Invitrogen，貨號(hào)：15596026）結(jié)合氯仿進(jìn)行RNA的粗提取，并通過(guò)異丙醇沉淀進(jìn)一步純化，得到的RNA在超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher，型號(hào)：NanoDrop Lite）上定量分析，并用無(wú)RNase水稀釋至工作濃度，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)換為cDNA，以備后續(xù)的基因表達(dá)分析。使用染料法熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)4種衰老標(biāo)記物的表達(dá)水平，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器（蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司，型號(hào)：Q2000B）及多重PCR擴(kuò)增試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，編號(hào)：KT109]，對(duì)Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70及HRRT1（作為內(nèi)參基因）進(jìn)行定量擴(kuò)增分析。每個(gè)反應(yīng)孔的體積設(shè)定為20 mL，包括2 mL的cDNA、10 mL的TB Green Premix Ex Tag Ⅱ、各0.8 mL的正反向引物（10 μmol/L），以及6.0 mL的無(wú)菌水。PCR程序包括95 ℃預(yù)變性5 min，隨后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s的步驟，用于信號(hào)收集。每個(gè)樣本進(jìn)行3次獨(dú)立測(cè)定，利用2-ΔΔCT方法計(jì)算肺泡灌洗液中Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在對(duì)照組與疾病組研究對(duì)象肺泡灌洗液中的表達(dá)情況。⑵Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在不同嚴(yán)重程度BE患者肺泡灌洗液中的表達(dá)情況。⑶Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在BE病情診斷中的準(zhǔn)確性。通過(guò)受試者工作特征（ROC）曲線分析評(píng)估這些衰老標(biāo)記物mRNA相對(duì)表達(dá)水平對(duì)BE的診斷價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料經(jīng)S-W法檢驗(yàn)證實(shí)符合正態(tài)分布，用（ x ±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；通過(guò)ROC曲線分析評(píng)估這些衰老標(biāo)記物mRNA相對(duì)表達(dá)水平對(duì)BE的診斷價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和疾病組研究對(duì)象肺泡灌洗液衰老標(biāo)志物mRNA表達(dá)量 疾病組患者Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 不同嚴(yán)重程度BE患者肺泡灌洗液中衰老標(biāo)志物mRNA表達(dá)量 重度組Sirtuin 1、SOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于輕度組，p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于輕度組，Ku70 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于輕、中度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 4種衰老標(biāo)志物mRNA表達(dá)量對(duì)BE病情的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，4個(gè)衰老標(biāo)志物 mRNA表達(dá)量的曲線下面積（AUC）均超過(guò)0.600，其中Ku70 AUC最大，為0.721，診斷效能均良好，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)圖1、表3。

3 討論

BE的病理機(jī)制涉及氣道炎癥、感染及結(jié)構(gòu)破壞的復(fù)雜相互作用，盡管已有研究揭示了這些因素與BE的相關(guān)性[7]，但具體的作用機(jī)制仍不完全清楚，研究已表明，衰老標(biāo)記物的變化與多種慢性疾病的發(fā)展有關(guān)[2]。例如，氣道上皮細(xì)胞的衰老可能在BE的進(jìn)展中發(fā)揮作用，但衰老標(biāo)記物如Sirtuin 1、SOD2、p21及Ku70 mRNA在BE中的表達(dá)及其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性尚需闡明。

BE的病理癥狀主要表現(xiàn)于肺部，肺部組織或其他肺部檢測(cè)樣本是反映衰老加速的最佳組織，因此本研究選取的檢測(cè)樣本是肺泡灌洗液。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，疾病組中Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均降低，而p21 mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高，且Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨著病情嚴(yán)重而降低，p21 mRNA隨著病情嚴(yán)重而升高，這表明在BE的病理過(guò)程中，可能存在抗氧化和DNA修復(fù)能力的減弱，以及細(xì)胞周期調(diào)控的改變。分析其原因，Sirtuin家族在人體成熟組織、胚胎期組織及生殖細(xì)胞中廣泛存在[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Sirtuin 1能夠通過(guò)去乙?；饔糜绊懖骖^蛋白盒轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1），從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低細(xì)胞損傷[9]。一項(xiàng)初步研究顯示，BE患者氣道中Sirtuin 1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較健康人明顯減少[10]。在BE中，Sirtuin 1的表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞衰老、減弱抗氧化和抗炎能力，以及損害DNA修復(fù)機(jī)制，加劇氣道炎癥和結(jié)構(gòu)損傷。

SOD2主要作用為中和超氧自由基，以防止氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。有研究表明，急性肺損傷小鼠對(duì)比正常鼠SOD2顯著降低，槲皮素可干預(yù)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，提高SOD2，改善肺功能[11]。SOD2的降低可能意味BE患者氣道上皮細(xì)胞清除活性氧的能力受損，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的累積，進(jìn)而加劇氣道炎癥和組織損傷[12]。

Ku70蛋白是參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的主要分子之一。Sirtuin 1對(duì)Ku70的去乙?；揎椏稍鰪?qiáng)Ku70的活性，并增強(qiáng)其介導(dǎo)的DNA修復(fù)[13]。LIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從衰老個(gè)體分離的成纖維細(xì)胞DNA中Ku70的表達(dá)水平顯著降低。另一項(xiàng)研究中，DNA損傷可導(dǎo)致哮喘小鼠模型中氣道上皮細(xì)胞的Ku70表達(dá)下降，這表明Ku70蛋白可能通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞器功能來(lái)減少細(xì)胞死亡，其表達(dá)降低與哮喘患者氣道上皮的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器障礙相關(guān)[15]。在BE中，Ku70的減少加劇了氣道上皮的損傷和功能障礙，進(jìn)而促進(jìn)了炎癥和病理進(jìn)展。

在BE中，p21的高表達(dá)標(biāo)志著氣道上皮細(xì)胞的衰老和功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法每月清除衰老小鼠中高表達(dá)p21的衰老細(xì)胞，能顯著延長(zhǎng)其壽命和健康期[16]。有研究進(jìn)一步指出，通過(guò)調(diào)控p53/p21信號(hào)通路抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞衰老抗肺纖維化，顯著降低肺纖維化模型中p21的表達(dá)，減輕Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的衰老，從而有效降低炎癥反應(yīng)，改善了肺纖維化[17]。這提示了p21在BE中的表達(dá)增加可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期停滯進(jìn)而加劇氣道炎癥和結(jié)構(gòu)損傷。

此外，本研究中ROC曲線分析結(jié)果顯示，衰老標(biāo)記物Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA診斷BE的AUC均超過(guò)0.600，均有較好的診斷價(jià)值。既往研究發(fā)現(xiàn)，Sirtuin 1、SOD2、p21、Ku70 mRNA在診斷牙周炎合并2型糖尿病、支氣管哮喘等疾病中同樣發(fā)揮一定應(yīng)用價(jià)值[18-19]。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了衰老標(biāo)記物在不同炎癥性疾病中的潛在診斷作用，強(qiáng)調(diào)了其作為生物標(biāo)志物的廣泛適用性。

綜上，在BE患者中，Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組低，而p21 mRNA的表達(dá)量則較高。且隨著B(niǎo)E病情的加重，Sirtuin 1、SOD2及Ku70 mRNA表達(dá)進(jìn)一步下降，p21 mRNA表達(dá)上升，與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，且均對(duì)BE病情具有良好的診斷價(jià)值。但研究受限于樣本量和橫斷面設(shè)計(jì)，難以推廣結(jié)果或確定因果關(guān)系，未來(lái)需擴(kuò)大樣本，采用縱向研究以深入分析。

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