摘 要 東北虎（Panthera tigris altaica）是全球生物多樣性保護的旗艦物種，在維持生態(tài)系統(tǒng)功能中占據(jù)不可替代的重要地位。東北虎對于可感染家貓的病毒均易感，但目前關(guān)于東北虎病毒病的流行病學資料仍然十分有限。貓冠狀病毒（Feline coronavi?rus，F(xiàn)CoV）感染，輕可導致貓科（Felidae）動物腹瀉，重則呈現(xiàn)高致病性、致死性的貓傳染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis，F(xiàn)IP）。因此，采用巢氏PCR方法對來自黑龍江省東北虎林園的6份東北虎全血樣本進行FCoV檢測，結(jié)果顯示2份樣本為陽性（H-11-1241、H-11-1310），陽性率為33. 3%。所得PCR片段與其他參考株同源性為99. 3% ～ 100. 0%。研究結(jié)果豐富了圈養(yǎng)東北虎中貓冠狀病毒流行病學數(shù)據(jù)，為其他圈養(yǎng)貓科動物的FCoV 監(jiān)測提供了參考，對野生貓科動物的保護與繁育具有重要意義。

關(guān)鍵詞：東北虎；貓冠狀病毒；巢氏PCR

中圖分類號：S852. 65

文獻標志碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 04 - 0896 - 05

DOI：10.12375/ysdwxb.20240424

近年隨著國家對野生動物保護力度的加大，圈養(yǎng)和野生貓科（Felidae）動物數(shù)量也在增加，人為以及各種生態(tài)因素導致了病原體在不同種間的傳播。病毒性傳染病嚴重威脅著貓科動物的健康及種群數(shù)量，感染家貓的多數(shù)病原體都可感染野生貓科動物，并引起相似的臨床癥狀。貓冠狀病毒（Feline coro?navirus，F(xiàn)CoV）主要感染半歲至兩歲的貓，在全球范圍內(nèi)廣泛存在，幼貓更易感染［1］。Kennedy et al.［2］對美國多種圈養(yǎng)貓科動物如獵豹（Acinonyx jubatus）、東北虎（Panthera tigris altaica）進行了FCoV檢測，結(jié)果顯示超過一半的樣本呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。東北虎不僅是我國一級重點保護野生動物，還是全球生物多樣性保護的旗艦物種，但目前關(guān)于東北虎的冠狀病毒感染流行病學數(shù)據(jù)幾乎是空白，因此，對東北虎等大型貓科動物進行冠狀病毒感染的監(jiān)測對于本病的防控具有重要意義。

FCoV 于20 世紀60 年代被Holzworth［3］首次發(fā)現(xiàn)，屬于尼多病毒目（Nidovirales），冠狀病毒科（Coronaviridae），冠狀病毒屬（Coronavirus），它是一種不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，擁有一個較為龐大的基因組（約30 kb）［4］。FCoV基因組含有11個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白分別是刺突蛋白S、膜蛋白E、包膜蛋白M和核衣殼蛋白N；非結(jié)構(gòu)蛋白主要是復制酶蛋白（1a和1b）、輔助蛋白（3a、3b、3c、7a和7b）［5］。FCoV 具有兩種生物型，一種為可導致貓傳染性腹膜炎（Feline infectious perito?nitis，F(xiàn)IP）的貓傳染性腹膜炎病毒（Feline infectiousperitonitis virus，F(xiàn)IPV），呈現(xiàn)高致病性、致死性特征，臨床上根據(jù)腹腔和胸腔是否有滲出液，可將FIP分為干性、濕性和混合型3種；另一種為低致病性的貓腸道冠狀病毒（Feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECV）［6］，只存在于貓的消化道，通常引發(fā)貓輕微的腸胃腹瀉，嚴重時會導致貓脫水。盡管在FCoV感染的貓中FIP的發(fā)病率比較低，但FIP是導致患貓死亡的主要原因［7］。根據(jù)S 基因序列及抗原性的不同，可以將FCoV分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型FCoV是貓科動物獨有；Ⅱ型FCoV 是Ⅰ型FCoV 與犬冠狀病毒（Canine co?rona virus，CCoV）之間發(fā)生重組產(chǎn)生的，具有較強的遺傳變異性，在亞洲地區(qū)Ⅱ型約占FCoV感染的25%甚至更多［8］。

本研究采用巢氏PCR方法對來自黑龍江東北虎林園的6份東北虎全血樣本進行FCoV檢測，以期了解和掌握虎源FCoV的分子流行病學資料，為我國后續(xù)圈養(yǎng)貓科動物FCoV監(jiān)測和預防提供數(shù)據(jù)參考。

1 實驗動物及藥品處理

2021年11月—2022年11月在黑龍江東北虎林園，由專業(yè)獸醫(yī)采集6 份（只）東北虎（0 ～ 6 歲）的全血樣本。所有東北虎在采血前禁食1 d，用含有10 mg/kg氯胺酮飛鏢麻醉（江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司，中國），每只虎由前肢靜脈采血2 mL。采樣后將所有樣品血液放置于含有適量抗凝劑的采集管內(nèi)并于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2. 1 引物的設(shè)計與合成

參照Herrewegh et al.［9］研究基礎(chǔ)設(shè)計引物，以FCoV的3′-UTR（untranslated region，UTR）部分基因作為目標片段，采用巢氏PCR方法對6份東北虎全血樣本進行逐一篩查，引物序列以及反應(yīng)條件見表1。

2. 2 病毒核酸的提取與反轉(zhuǎn)錄

核酸提取采用Baypure通用型磁珠法病毒DNA/RNA快速提取試劑盒（廣州灣區(qū)生物科技有限公司，中國），并按照試劑盒說明書對全血樣本核酸進行提取，置于-80 ℃儲存。將4 μL隨機引物加入帶有核酸且無RNA酶的EP管內(nèi)，置于干式恒溫器中70 ℃培養(yǎng)5 min，再于-20 ℃冰浴5 min；之后向EP管中加入dNTP 8 μL，DEPC水6 μL，M-MLV 5 × Buffer 10 μL，RNase 抑制劑1 μL 和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega 公司，美國）1 μL，于37 ℃反應(yīng)1 h；繼續(xù)置于-20 ℃冰浴5 min，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 3 樣品的PCR 檢測

以病毒核酸的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行第1 輪PCR擴增，擴增體系25. 0 μL，包含2 × Mix 12. 5 μL，上、下游引物各1. 0 μL，DNA/第1輪PCR 擴增產(chǎn)物1. 0 μL；ddH2O 9. 5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。將該輪PCR產(chǎn)物進行第2輪擴增，擴增程序與第1輪完全一致，擴增產(chǎn)物大小為177 bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將PCR檢測陽性產(chǎn)物送至吉林庫美生物科技有限公司進行測序。

2. 4 3′-UTR 基因片段的同源性分析

將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的參考毒株進行BLAST比對分析，使用DNAStar 5. 0軟件的MegA?lign程序?qū)y序所得序列和參考毒株序列（表2）進行同源性比對，再采用R 4. 3進行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用卡方檢驗，P lt; 0. 05具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與分析

3. 1 PCR 鑒定結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，6份來自黑龍江東北虎林園的樣本中僅有2 份樣本擴增到約177 bp 的陽性目的條帶，陽性率為33. 3%，陽性產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

3. 2 同源性比較分析

貓冠狀病毒3′-UTR 保守基因片段經(jīng)巢氏PCR驗證，所獲得的2 株陽性樣本序列之間的同源性達100. 0%，對該樣本擴增產(chǎn)物進行BLAST分析，確定2 株陽性樣本（H-11-1241、H-11-1310）為FCoV。使用DNAStar 軟件的MegAlign 程序?qū)? 株測序毒株和參考毒株的FCoV 部分基因進行同源性比對，兩陽性株與參考株同源性比對相似性為99. 3% ～100. 0%（圖2）。其中，陽性株與來自黑龍江家貓的KY566210、KY566209 和KY292377 的同源性為99. 3%，結(jié)合陽性目的條帶長約177 bp，即存在大約一個堿基的差異，與黑龍江家貓源毒株具有較高的同源性。

4 討論

近年來，我國對圈養(yǎng)東北虎的飼養(yǎng)管理措施逐漸完善，東北虎數(shù)量逐漸上升，但一些病毒（包括FCoV）性傳染疾病給東北虎的繁育帶來巨大壓力。FCoV是一種常見的高傳染性冠狀病毒，可在家貓和野生貓科動物中傳播，其傳播方式主要為糞口傳播。不同品種貓跨地區(qū)培育、流浪貓的增多和養(yǎng)殖市場衛(wèi)生環(huán)境惡劣等諸多因素導致貓冠狀病毒的變異和進化，F(xiàn)CoV不僅在貓群中廣泛流行，還可能對東北虎造成潛在威脅。本研究采用巢氏PCR對6份東北虎全血樣本進行FCoV檢測，結(jié)果有2份全血樣品顯示陽性，陽性率為33. 3%。同源性比對分析顯示，本研究所獲得的基因與黑龍江本地流行毒株具有較高同源性（99. 3%），即存在流浪貓與圈養(yǎng)東北虎交互的可能性。

劉秋瑾等［10］在2015—2016年對黑龍江省3個地區(qū)的貓冠狀病毒進行了分子流行病學調(diào)查，選取黑龍江省哈爾濱市、大慶市和齊齊哈爾市不同寵物醫(yī)院中初步診斷患FIP貓的腹水樣品，結(jié)果顯示我國FCoV-Ⅰ型、FCoV-Ⅱ型均在國內(nèi)流行，但以FCoV-Ⅰ型流行為主。李少柏［11］通過對東北部分地區(qū)貓冠狀病毒的病原學調(diào)查，不僅確定了我國東北地區(qū)的貓冠狀病毒主要以FCoV-Ⅰ型流行為主，還驗證了FCoV感染與年齡及居住方式顯著相關(guān)。這與Klein-Richers et al.［12］在多變量試驗所得到的結(jié)論基本相符，即在多貓科動物聚集環(huán)境中和在幼齡時更易感染FCoV。在區(qū)分貓冠狀病毒的血清型上，一般選取FCoV的S基因序列進行分析。本研究選取高度保守的3′-UTR基因序列不足以分辨東北虎源FCoV的血清型，但采樣時圈養(yǎng)東北虎并未表現(xiàn)出明顯的FIP癥狀（如黃疸、腹部膨大和腹圍增大等），可以確定該陽性樣本的生物型為FECV。

Olarte-Castillo et al.［13］在糞便中長期檢測FCoV的研究結(jié)果表明，個體持續(xù)的病毒脫落是FCoV持續(xù)感染的結(jié)果，而不是不同變體的再感染，即在探討FIP的發(fā)病機制時，觀察到患病個體具有一種逐漸增強的自身感染和排毒能力。這種增強的能力主要源于FCoV毒株在機體內(nèi)引發(fā)的二次感染，而機體的抗依賴性增強作用（ADE）則進一步加劇了FIP的嚴重程度。目前，針對FCoV感染無疫苗和特效治療的藥物，一般的治療方法是：及時補液以糾正酸中毒，使用抗炎抗病毒藥物和適宜適量的抗生素藥物防止繼發(fā)感染?；⒘謭@圈養(yǎng)東北虎有暴露風險，即可能存在流浪貓與東北虎之間交互傳染的情況，故對于抑制FCoV傳播的有效措施是加強圈養(yǎng)東北虎的飼養(yǎng)管理，在無癥狀或出現(xiàn)類似癥狀時，定期或及時地對其進行檢查和藥物預防，并做好患病虎的隔離措施避免交叉?zhèn)鞑?；同時對籠舍嚴格消毒，規(guī)范處理排泄物；提高飼糧質(zhì)量，提高免疫力；避免接觸外界流浪貓，對進出籠舍人員或車輛消毒。

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