摘 要：目的：驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室定量檢測金黃色葡萄球菌能力，提升檢測技術(shù)和服務(wù)水平。方法：應(yīng)用國標(biāo)方法與3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片計(jì)數(shù)法兩種方法進(jìn)行金黃色葡萄球菌定量檢測。結(jié)果：國標(biāo)方法測得乳粉樣品（TF04900003）金黃色葡萄球菌的含量為7 900 CFU·g-1，乳粉樣品（TF04900004）金黃色葡萄球菌的含量為8 400 CFU·g-1，驗(yàn)證結(jié)果為滿意。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室具備金黃色葡萄球菌定量檢測能力。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；能力驗(yàn)證；3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片

Application of Two Methods in Quantitative AbilityVerification of Staphylococcus aureus in Milk Powder

YANG Shengmei， XIN Cuixia， GAO Pinglin， TIAN Xiaoqin， WU Qiqi， DUAN Aili*

（Wuwei City Food Inspection Testing Center， Wuwei 733000， China）

Abstract：Objective： To verify the quantitative detection capability of Staphylococcus aureus in our laboratory and improve the detection technology and service level. Method： Two methods， namely the national standard method and the 3M PetrifilmTM Staphylococcus aureus test strip counting method， were used for quantitative detection of Staphylococcus aureus. Result： The content of Staphylococcus aureus in the milk powder sample （TF04900003） was determined to be 7 900 CFU·g-1 by the national standard method， and the content of Staphylococcus aureus in the milk powder sample （TF04900004） was 8 400 CFU·g-1. The verification results are satisfactory. Conclusion： This laboratory has the ability to quantitatively detect Staphylococcus aureus.

Keywords： Staphylococcus aureus; capability verification; 3M PetrifilmTM Staphylococcus aureus test strip

能力驗(yàn)證是評價實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的有效手段，也是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)[1]。金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，在自然界廣泛分布，能引起嚴(yán)重的化膿性感染和疾病，對人類呼吸道、皮膚、血液及腸道等組織均具有一定的攻擊性[2]。金黃色葡萄球菌繁殖過程產(chǎn)生的腸毒素，是引發(fā)食物中毒的主要致病因子[3]。國家對食品、藥品及化妝品等產(chǎn)品中的金黃色葡萄球菌限量進(jìn)行明確規(guī)定，其中，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》《中華人民共和國藥典》中規(guī)定金黃色葡萄球菌不得檢出，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[4]中規(guī)定巴氏殺菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳、加糖煉乳（甜煉乳）和調(diào)制加糖煉乳中金黃色葡萄球菌不得檢出，乳制品中干酪、再制干酪和干酪制品，肉制品，糧食制品，即食豆制品，即食果蔬制品，冷凍飲品，即食調(diào)味品的殘留限量允許為采樣量5，最多允許有2個值在100～1 000 CFU·g-1（mL-1）?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[5]要求散裝即食食品金黃色葡萄球菌≤1 000 CFU·g-1（mL-1）。金黃色葡萄球菌常見的檢測方法為國標(biāo)方法，該方法要先進(jìn)行傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)，再進(jìn)行生化鑒定，其中生化鑒定步驟復(fù)雜，檢測時間長且易出現(xiàn)假陰性，本文采用國標(biāo)方法進(jìn)行檢驗(yàn)的同時應(yīng)用3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片計(jì)數(shù)輔助判斷試驗(yàn)結(jié)果，有效確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品來源

NIFDC-PT-490乳粉中金黃色葡萄球菌（定量）檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證共發(fā)放2份待測樣品，樣品編號為TF04900003、TF04900004（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部編號為1、2），每份樣品包含1個菌球與1袋奶粉基質(zhì)，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

陰性對照菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922-1；陽性對照菌株：金黃色葡萄球菌ATCC6538-1，兩種菌株均為本實(shí)驗(yàn)室的儲備菌株。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

無菌生理鹽水、Baird-Parker平板（BP平板）、血瓊脂平板（血平板）、凍干血漿、腦心浸出液肉湯（BHI肉湯）、營養(yǎng)瓊脂小斜面（NA斜面）以及革蘭氏染色液，均購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；3MPetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片，購自3M公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器，冰山松洋生物科技（大連）有限公司；無菌均質(zhì)器，上海比郎儀器制造有限公司；立式智能生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；生物安全柜，蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司；移液槍，艾本德中國有限公司；生物顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

在生物安全柜內(nèi)，取225.0 mL滅菌生理鹽水加入無菌均質(zhì)袋內(nèi)，將西林瓶內(nèi)編碼為TF04900003小球加入生理鹽水中，充分溶解，再將與小球相同編碼的奶粉樣品25 g加入滅菌生理鹽水中，用無菌均質(zhì)器均質(zhì)2 min，制成10-1的樣品勻液，用移液槍吸取1 mL樣品勻液，加入9 mL生理鹽水中，制成10-2的樣品稀釋液，按以上步驟依次制成10-3、10-4、10-5的樣品稀釋液，TF04900004樣品重復(fù)上述操作。

1.2.2 樣品涂布及培養(yǎng)

將1.2.1中5個稀釋度的樣品勻液以0.30 mL、0.30 mL、0.40 mL的量分別接種于BP平板上，并用L棒均勻涂布平板，注意樣品盡量不要涂布到平板邊緣，涂布結(jié)束后，正置平板于36 ℃培養(yǎng)箱中，吸收1 h后倒置平板，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 典型菌落計(jì)數(shù)與確認(rèn)

篩選符合金黃色葡萄球菌典型特征的平板，選擇同一濃度3個平板典型菌落數(shù)之和在20～200 CFU的平板計(jì)數(shù)，同時進(jìn)行生化驗(yàn)證。從所選擇的平板上挑取至少5個可疑菌落，分別做革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)并接種血平板觀察菌落形態(tài)，同時以金黃色葡萄球菌ATCC6538-1菌種作為陽性對照，以大腸埃希氏菌ATCC25922-1作為陰性對照。①革蘭氏染色鏡檢。根據(jù)試劑盒說明書從每份樣品中選取5個可疑菌落進(jìn)行染色鏡檢，并在顯微鏡下觀察。②血漿凝固酶試驗(yàn)。將挑取的5個可疑性菌落接種到5 mL腦心浸出液肉湯中，同時接種營養(yǎng)瓊脂小斜面，放置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)物0.3 mL加入0.5 mL凍干血漿中，振蕩搖勻后，放置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h內(nèi)定時觀察血漿凝固情況。③血平板。在接種腦心浸出液肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面的同時劃線接種血平板，36 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 3MPetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片計(jì)數(shù)

將3MPetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片平鋪在無菌臺面上，揭開表面的膜，分別取5個濃度的稀釋液1 mL加入測試片中心，再將表面膜緩緩蓋上，用無菌鑷子輕輕按壓，使樣液盡可能均勻分布于圓形培養(yǎng)面，靜置，待培養(yǎng)基凝固后將測試片透明面向上放回原自封袋中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為36 ℃，24 h左右，每個濃度做2個平行實(shí)驗(yàn)，接種無菌生理鹽水1 mL作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 BP平板計(jì)數(shù)

樣品1和2在BP平板上有3種形態(tài)，一種呈圓形、黑色菌落，表面光滑、凸起、濕潤，菌落直徑為2～3 mm，有淺色邊緣，周圍繞以不透明圈，其形態(tài)和金黃色葡萄球菌典型菌落形態(tài)相符合，標(biāo)記為典型菌落；一種與典型菌落大小、顏色相似，無淺色邊緣，也無不透明圈，與金黃色葡萄球菌典型形態(tài)不符合，為干擾菌，排除；另一種有淺色邊緣及不透明圈，但較前兩種菌直徑較小，約為1 mm，不符合金黃色葡萄球菌直徑范圍，也是干擾菌，排除。經(jīng)過對有典型菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，篩選出適宜計(jì)數(shù)菌落濃度為10-2，分別計(jì)數(shù)樣品1和2在各個濃度上的菌落數(shù)，結(jié)果見表1。

2.2 生化鑒定結(jié)果

樣品1和2各5個可疑菌落經(jīng)過革蘭氏染色后，在100倍鏡下均為藍(lán)紫色，呈葡萄球狀排列，無莢膜，無芽孢，鏡檢結(jié)果與陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538-1一致，為革蘭氏陽性菌。將樣品1、2各5個可疑菌落腦心浸出液肉湯培養(yǎng)物接種于凍干血漿后每30 min觀察1次，均于3 h后開始凝固，4 h后基本凝固，陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538-1于2 h后開始，3 h后完全凝固，陰性對照ATCC25922-1觀察至6 h結(jié)束時，未出現(xiàn)凝固。樣品1、2各5個可疑菌落經(jīng)血平板培養(yǎng)后均表現(xiàn)為菌落形態(tài)較大、圓形、濕潤、周圍可見較大透明溶血圈，與陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538-1在血平板上的形態(tài)一致，陰性對照ATCC25922-1在血平板上無菌落生長，經(jīng)生化鑒定，樣品1、2各5個可疑菌落均為金黃色葡萄球菌，鑒定后計(jì)算結(jié)果為7 900 CFU·g-1、8 400 CFU·g-1。

2.3 3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片結(jié)果

經(jīng)培養(yǎng)后，測試片中出現(xiàn)紫紅色和藍(lán)綠色兩種形態(tài)的菌落，對照3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片說明書，紫紅色的菌落是金黃色葡萄球菌，而除紫紅色外的其他顏色菌落為干擾菌，排除，對兩種菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定10-2為最適宜計(jì)數(shù)濃度，將該濃度金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)濃度得樣品1菌落結(jié)果為8 000 CFU·g-1，樣品2菌落結(jié)果為8 300 CFU·g-1，計(jì)數(shù)片結(jié)果如表2所示。

3 結(jié)論與討論

本次能力驗(yàn)證，國標(biāo)方法與3M PetrifilmTM金黃色葡萄球菌測試片計(jì)數(shù)法測得乳粉樣品中金黃色葡萄球菌含量十分相近，進(jìn)一步驗(yàn)證了國標(biāo)方法結(jié)果的準(zhǔn)確性，填報(bào)時以作業(yè)指導(dǎo)書中規(guī)定的國標(biāo)方法結(jié)果為準(zhǔn)，最終組織能力考核單位根據(jù)所有參加能力考核單位的結(jié)果計(jì)算的本次能力驗(yàn)證結(jié)果為滿意。通過本次能力驗(yàn)證總結(jié)出以下注意事項(xiàng)。①考核樣檢測一定要根據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書操作，尤其是樣品前處理，要反復(fù)研讀作業(yè)指導(dǎo)書中的操作步驟，再進(jìn)行操作。②BP平板接種樣品前，要先將平板上的水珠放在生物安全柜內(nèi)出風(fēng)口烘干，如果未烘干，接種平板后，平板吸收緩慢，易出現(xiàn)菌落連片生長現(xiàn)象，不易觀察計(jì)數(shù)。③血漿凝固酶試驗(yàn)最適觀察時間為每30 min觀察1次，避免觀察太頻繁或觀察時晃動力度過大，將凝固塊搖碎，影響結(jié)果判斷。

參考文獻(xiàn)

[1]路桂芬，韓深.以新版《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（CNAS-CL01：2018）要求開展檢測方法驗(yàn)證的問題及解決方法[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2020，11（2）：638-642.

[2]韓塔拉，王俊瑞.金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥機(jī)制及實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)[J].中國感染控制雜志，2022，21（12）：1249-1256.

[3]易小利，陳玟妃.食品中金黃色葡萄球菌檢測能力驗(yàn)證結(jié)果分析與討論[J].現(xiàn)代食品雜志，2024，30（7）：168-172.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量：GB 29921—2021[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2021.

[5]中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量：GB 31607—2021[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2021.

作者簡介：楊生梅（1992—），女，甘肅武威人，碩士，工程師。研究方向：食品微生物檢測。

通信作者：段愛莉（1986—），女，甘肅定西人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全檢測。E-mail： 404615320@qq.com。