摘要：為探究漢遜酵母增香介質(zhì)與拜耳接合酵母增香介質(zhì)混合固態(tài)發(fā)酵對(duì)雪茄煙葉香氣物質(zhì)含量的影響，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)發(fā)酵后雪茄煙葉的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明：對(duì)2種酵母增香介質(zhì)進(jìn)行拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)交叉點(diǎn)無抑菌圈，說明兩菌無拮抗效果；對(duì)接菌比例、接菌量和煙葉濕度進(jìn)行工藝優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接菌比例（漢遜酵母∶拜耳接合酵母）1.1∶1，接菌量19.14%，煙葉濕度31.06%時(shí)，香氣物質(zhì)總量為1 200.92 μg/g，比單菌發(fā)酵提高了9.31%。其中，葉綠素降解產(chǎn)物、苯丙氨酸降解產(chǎn)物和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物明顯提升。

關(guān)鍵詞：漢遜酵母；拜耳接合酵母；增香介質(zhì)；雪茄煙葉；混菌發(fā)酵

中圖分類號(hào)：TS44+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）10-0081-06

Optimization of Fermentation Process for Cigar Tobacco Leaves with Composite

Yeast Aroma-Enhancing Medium

DING Jing-yi1，YANG Jin-peng2，YU Jun2，YANG Chun-lei2，CHEN Xiong1，YAO Lan1

（1. School of Life and Health Sciences， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， PRC; 2. Tobacco Research Institute of

Hubei Province， Wuhan 430030， PRC）

Abstract： This study aims to explore the effect of mixed solid-state fermentation of cigar tobacco leaves with Hanseniaspora uvarum aroma-enhancing medium and Zygosaccharomyces bailii aroma-enhancing medium on the aroma components of the product. Gas chromatography-mass spectrometry was employed to qualitatively and quantitatively analyze the aroma components of cigar tobacco leaves after fermentation. The results of the antagonistic experiment on the two yeast species showed no inhibition zone at the intersection， indicating that the two species had no antagonistic effect. The optimization results showed that after fermentation at the Hanseniaspora uvarum： Zygosaccharomyces bailii ratio of 1.1∶1， yeast inoculation amount of 19.14%， and tobacco leaf moisture of 31.06%， the total content of aroma substances reached 1 200.92 μg/g， which was 9.31% higher than that of fermentation with single strains.

Moreover， the products of chlorophyll degradation， phenylalanine degradation， and carotenoid degradation were significantly improved.

Key words： Hanseniaspora uvarum; Zygosaccharomyces bailii; aroma-enhancing medium; cigar tobacco leaves; mixed fermentation

微生物在雪茄煙葉發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用，能夠改善煙葉的品質(zhì)，預(yù)防霉變，提升煙葉的風(fēng)味和香氣。單個(gè)微生物發(fā)酵對(duì)雪茄煙葉的影響較為單一，因此許多研究者會(huì)將不同的微生物混合起來發(fā)酵，即混菌發(fā)酵[1]。與單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵的產(chǎn)品品質(zhì)更高[2-6]。王穎等[7]對(duì)比了單一菌株和復(fù)配菌株發(fā)酵后的煙葉化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)復(fù)配菌株發(fā)酵后煙葉中石油醚提取物明顯增加。杜飛等[8]分別從酒糟和茶葉中篩選出了一株釀酒酵母和一株曲霉菌，混合發(fā)酵后其發(fā)酵液中醇類、酯類等物質(zhì)含量增加，煙葉雜氣減小，品質(zhì)明顯提升。龍章德等[9]對(duì)釀酒酵母與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌發(fā)酵雪茄煙葉的條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化發(fā)酵所得的雪茄煙葉總糖、還原糖和石油醚提取物等含量增加，致香成分中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物與西柏烷類降解產(chǎn)物含量增加，雪茄煙葉香氣質(zhì)量得到提升。該研究利用漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）兩種酵母增香介質(zhì)對(duì)固態(tài)發(fā)酵雪茄煙葉的過程進(jìn)行優(yōu)化，探究復(fù)合微生物發(fā)酵對(duì)雪茄煙葉香氣總量及香氣成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪茄煙葉與煙草花蕾均于2022年在湖北省恩施州采集，煙葉型號(hào)為CX-026茄衣。產(chǎn)香酵母菌株為湖北工業(yè)大學(xué)功能酵母與釀造微生物實(shí)驗(yàn)室分離篩選的優(yōu)質(zhì)酵母菌株：漢遜酵母和拜耳接合酵母。主要試劑有YPD液體培養(yǎng)基、葡萄糖、異亮氨酸、蛋白胨、無水硫酸鈉、氯化鈉、二氯甲烷（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、酵母粉（安琪酵母股份有限公司）、乙酸苯乙酯[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器有電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、HNY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司）、恒溫恒濕箱（天津市歐諾儀器儀表有限公司）、CJ-2D型無菌操作臺(tái)（天津市泰斯特儀器有限公司）、鹵素水分快速測(cè)定儀（青島拓科儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，Agilent 7890A/5975C，安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母種子液的制備 在30℃、200 r/min條件下，分別將漢遜酵母與拜耳接合酵母于YPD液體培養(yǎng)基中活化24 h，再接入新的YPD液體培養(yǎng)基中二代活化12 h得到2種酵母的種子液。

1.3.2 漢遜酵母增香介質(zhì)和拜耳接合酵母增香介質(zhì)的制備 將一定量的煙草花蕾烘干磨碎，過60目篩，與去離子水（固液比1∶10）充分接觸并攪拌，90℃下水浴2 h，冷卻后過濾除渣得到提取液，加入10.12%葡萄糖，115℃高溫滅菌20 min，加入0.83%異亮氨酸，過濾除菌，制得煙草花蕾水提液培養(yǎng)基，即增香介質(zhì)。將2種酵母種子液以3.48%接菌量分別接入煙草花蕾水提液培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h得到發(fā)酵液，即漢遜酵母增香介質(zhì)和拜耳接合酵母增香介質(zhì)。

1.3.3 漢遜酵母與拜耳接合酵母拮抗試驗(yàn) 為了避免雪茄煙葉發(fā)酵過程中發(fā)生菌種拮抗，影響2種酵母的生長，對(duì)漢遜酵母與拜耳接合酵母進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，觀察是否會(huì)發(fā)生排異反應(yīng)[10]。

1.3.4 雪茄煙葉固態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn) （1）優(yōu)化接菌比例條件。取100 g雪茄煙葉放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，分別考慮接菌比（漢遜酵母∶拜耳接合酵母）為1∶1、1∶2、2∶1，在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵濕度80%、煙葉濕度30%、接菌量20%條件下發(fā)酵6 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量。（2）優(yōu)化接菌量條件。取100 g雪茄煙葉放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵濕度80%、接菌比（漢遜酵母∶拜耳接合酵母）1∶1、煙葉濕度30%條件下，分別取接菌量10%、20%、30%的發(fā)酵液噴灑于雪茄煙葉上發(fā)酵6 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量。（3）優(yōu)化煙葉濕度條件。取100 g雪茄煙葉放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，分別考慮煙葉濕度25%、30%、35%，在發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵濕度80%、接菌比（漢遜酵母∶拜耳接合酵母）1∶1、接菌量20%條件下發(fā)酵6 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取接菌比例、接菌量、煙葉濕度作為試驗(yàn)因素，以雪茄煙葉香氣總量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)（表1），對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化；使用Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)最佳發(fā)酵條件。

1.3.6 香氣物質(zhì)含量的測(cè)定 采用同時(shí)蒸餾萃取技術(shù)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定發(fā)酵后雪茄煙葉的揮發(fā)性致香成分[11]。將發(fā)酵后的煙葉在70℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥12 h，用粉碎機(jī)粉碎后過60目篩網(wǎng)得到煙末。準(zhǔn)確稱取10 g煙末樣品和200 mL飽和食鹽水放入同時(shí)蒸餾萃取裝置一端的圓底燒瓶中，另一端加入60 mL二氯甲烷。當(dāng)有機(jī)相水浴達(dá)到55℃時(shí)，打開另一端的加熱開關(guān)進(jìn)行加熱，至液面出現(xiàn)明顯分層時(shí)開始計(jì)時(shí)萃取5 h。記時(shí)結(jié)束后關(guān)閉磁力攪拌器，待油浴與水浴降至室溫后，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將二氯甲烷萃取液濃縮至2 mL，然后用少量無水硫酸鈉干燥，過0.22 μm微孔有機(jī)濾膜于2.0 mL的色譜瓶中，加入1.202 8 mg/mL乙酸苯乙酯50 μL作為內(nèi)標(biāo)，立即上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果通過NIST 14.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，對(duì)香氣成分進(jìn)行定性和定量分析。

1.3.7 GC/MS條件 氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣量1 μL，載氣為氦氣，流速1 mL/min，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：40℃保持2 min，以2℃/min升至200℃，保持5 min，以10℃/min升至280℃。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度250℃，離子源溫度230℃，電離方式EI，電壓70 eV。

1.3.8 揮發(fā)性香氣成分定性定量分析 采用NIST 14.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫與GC-MS得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行相似度對(duì)比，進(jìn)行定性分析，將匹配度最高的作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)；采用乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，將GC-MS中得到的各物質(zhì)峰面積代入公式（1），計(jì)算香氣物質(zhì)含量。

（1）

式中，C為各香氣物質(zhì)的含量，S1為各香氣物質(zhì)的峰面積，S2為內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯的峰面積，60為加入的內(nèi)標(biāo)（乙酸苯乙酯）的總質(zhì)量，10為煙末樣品的總質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用NIST 14.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，使用Desigin Expert 13軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)及對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行處理，使用Origin 2021軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 漢遜酵母與拜耳接合酵母拮抗試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，漢遜酵母（J4）與拜耳接合酵母（R6）皆呈白色、不透明、扁平、有一定厚度等特征，漢遜酵母表面光滑完整，拜耳接合酵母表面則較為粗糙，邊緣呈現(xiàn)顆粒狀。二者交點(diǎn)處拜耳接合酵母的特征較為明顯，但未發(fā)生排異現(xiàn)象；2種酵母相交點(diǎn)無抑菌圈，說明兩菌之間無拮抗作用，可以進(jìn)行混菌發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2 雪茄煙葉固態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，當(dāng)漢遜酵母與拜耳接合酵母的接菌比例為1∶1時(shí)，香氣總量最高（1 110.81 μg/g），此條件下兩種菌的協(xié)調(diào)性較好且能共生，而當(dāng)其中任意一方的比例增大或減小時(shí)，香氣總量均下降。當(dāng)接菌量為20%時(shí)，雪茄煙葉的香氣總量最高；當(dāng)接菌量減小或者接菌量提升至30%時(shí)，香氣總量均下降。綜合考慮，20%接菌量是最優(yōu)條件。煙葉濕度為30%時(shí)，香氣物質(zhì)總量最高，但當(dāng)濕度降低或者升高時(shí)，香氣總量下降，因此煙葉初始濕度30%是最優(yōu)條件。綜上所述，漢遜酵母∶拜耳接合酵母接菌量1∶1、接菌量20%、煙葉濕度30%分別是3種單個(gè)發(fā)酵因素的最優(yōu)條件。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

以雪茄煙葉香氣物質(zhì)總量（Y）為響應(yīng)值，選取接菌比例（A）、接菌量（B）、煙葉濕度（C）為參數(shù)，進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)方差分析是研究多個(gè)變量之間影響程度的重要指標(biāo)[12]。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表3），得出3個(gè)主效應(yīng)對(duì)香氣總量的影響為：煙葉濕度＞接菌比例＞接菌量，該回歸模型的P值小于0.01，失擬項(xiàng)大于0.05，說明模型的可靠性比較好，可利用回歸方程預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵條件。

響應(yīng)面是可以反映各主要因素以及主要因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[13]。各因素間的交互作用對(duì)雪茄煙葉香氣總量的影響見圖3。由圖3a可知，接菌比例與接菌量交互對(duì)雪茄煙葉中香氣物質(zhì)總量的影響呈現(xiàn)出拋物面分布，接菌比例引起曲面更大幅度的波動(dòng)，對(duì)雪茄煙葉中香氣物質(zhì)總量影響更大，且二者呈現(xiàn)顯著性關(guān)系。此外，雪茄煙葉香氣總量對(duì)接菌比例和接菌量交互、接菌比例和煙葉濕度交互的響應(yīng)均呈現(xiàn)拋物曲面分布。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳發(fā)酵條件為：接菌比例1.1∶1，接菌量19.14%，煙葉濕度31.06%，預(yù)測(cè)在此條件下發(fā)酵得到的雪茄煙葉最終香氣總量為1 187.25 μg/g。

2.3 復(fù)合菌株增香介質(zhì)對(duì)雪茄煙葉香氣物質(zhì)的影響

雪茄煙葉發(fā)酵香氣物質(zhì)包括葉綠素降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、苯丙氨酸降解產(chǎn)物、西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物以及其他香氣物質(zhì)6種類型[14]。對(duì)比單菌發(fā)酵與最優(yōu)條件下混菌發(fā)酵香氣物質(zhì)含量（表4）可知，混菌發(fā)酵后雪茄煙葉香氣物質(zhì)總含量明顯提高（1 200.92 μg/g），比單菌發(fā)酵提高了9.31%。其中，混菌發(fā)酵的葉綠素降解產(chǎn)物比單菌發(fā)酵提高了14.38%；與單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物含量略有下降，苯丙氨酸產(chǎn)物和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量有所增加，其他香氣物質(zhì)含量明顯降低。

3 討論與結(jié)論

研究利用漢遜酵母和拜耳接合酵母兩種酵母增香介質(zhì)對(duì)雪茄煙葉發(fā)酵工藝和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在雪茄煙葉固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的單因素試驗(yàn)中，在漢遜酵母與拜耳接合酵母的接菌比例為1∶1的基礎(chǔ)上，增加或減小其中任意一方的比例，香氣總量均會(huì)降低，可能是因?yàn)閮删鷶?shù)量相當(dāng)時(shí)，可以在雪茄煙葉中維持一個(gè)良好的環(huán)境，對(duì)煙葉中的土著微生物起到促進(jìn)作用，進(jìn)而提高雪茄煙葉的香氣含量。接菌量小于20%時(shí)，香氣總量下降，可能是因?yàn)榻泳枯^少不足以影響雪茄煙葉的整體香氣；而當(dāng)接菌量提升至30%時(shí)，盡管這些外來菌種帶來了額外的營養(yǎng)物質(zhì)和香氣成分，但大量的外來菌種會(huì)對(duì)雪茄煙葉中原有的土著微生物產(chǎn)生影響，從而降低香氣含量。煙葉初始發(fā)酵濕度對(duì)于雪茄煙葉的發(fā)酵有重要影響，合適的濕度可以促進(jìn)微生物在初始發(fā)酵階段的生長，進(jìn)而加快香氣物質(zhì)的積累[15-16]。濕度降低不僅影響土著微生物的活性，對(duì)漢遜酵母和拜耳接合酵母的活性也有所影響；濕度增高會(huì)增加霉變的可能，因此煙葉初始濕度為30%是最優(yōu)條件。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)后，將發(fā)酵條件調(diào)整為接菌比例（漢遜酵母∶拜耳接合酵母）1.1∶1，接菌量19.14%，煙葉濕度31.06%。對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵的香氣物質(zhì)含量比單菌發(fā)酵提高了9.31%。其中，葉綠素降解產(chǎn)物和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物明顯提升，而類胡蘿卜素降解產(chǎn)物中巨豆三烯酮和法尼基丙酮的增加最為顯著。苯丙氨酸產(chǎn)物中苯EeC3tVSe/H/vRRH4ZLaAfBjakScBFsoos4y1K+uxYPc=乙醛含量降低但苯乙醇的含量卻增加，這與毛亞浩等[17]的結(jié)果一致，因此混菌發(fā)酵對(duì)苯丙氨酸降解產(chǎn)物的提高并不明顯，推測(cè)苯乙醇含量的增加可能是苯乙醛脫氫造成的[18]。與單菌發(fā)酵相比，混菌發(fā)酵的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物略有下降，這可能是因?yàn)檫胚岷康臏p少。吲哚作為雪茄煙葉中花香香型的代表，濃度太高會(huì)產(chǎn)生難聞的氣味，而濃度較低時(shí)則有花香的氣息[19]。因此，雖然混菌發(fā)酵導(dǎo)致美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣含量略有下降，但它對(duì)雪茄煙葉整體香氣的優(yōu)化和提升起到了積極作用。香紫蘇醇是雪茄煙葉龍涎香的主要香氣成分之一，對(duì)煙草中龍涎香特質(zhì)具有顯著影響，是提升雪茄煙葉香氣品質(zhì)的重要因素。李鋒等[20]的研究表明，香紫蘇醇主要從植物中提取，但也可以由微生物進(jìn)行生產(chǎn)合成。該研究中混菌發(fā)酵的其他香氣物質(zhì)中，香紫蘇醇的含量有所下降。

總體而言，相較漢遜酵母增香介質(zhì)發(fā)酵，利用漢遜酵母增香介質(zhì)與拜耳接合酵母增香介質(zhì)進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵，能提高雪茄煙葉香氣物質(zhì)總含量和提升雪茄煙葉產(chǎn)品品質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：王婷）