摘要：通過優(yōu)化液相色譜條件和質(zhì)譜條件等，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定當歸中藥材中9種真菌毒素的檢測方法。樣品經(jīng)70%甲醇溶液超聲提取，經(jīng)固相萃取柱凈化；采用流動相A：2 mmol/L甲酸銨0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇，經(jīng)C18色譜柱分離后注入質(zhì)譜儀，電噴霧電離源（ESI）和多反應監(jiān)測模式（MRM）進行檢測，基質(zhì)外標法定量。經(jīng)方法學驗證，9種真菌毒素標準曲線線性關系良好（R2 > 0.995 0），方法的檢出限0.04～1.43 μg/kg，定量限0.12～4.75 μg/kg，高、中、低3個濃度加標回收率為77.8%～113.6%，測定結果的相對標準偏差為0.2%～17.7%。該檢測方法應用于72批當歸樣品9種真菌毒素同時檢測，2批當歸樣品檢出真菌毒素，檢出率為2.8%，樣品中主要的污染真菌毒素為黃曲霉毒素B1（AFTB1）、黃曲霉毒素B2（AFTB2）、黃曲霉毒素G1（AFTG1）。本研究建立的方法具有預處理簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點，適用于當歸樣品9種真菌毒素的快速檢測。

關鍵詞：當歸；中藥材；真菌毒素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；方法驗證

中圖分類號：S567.23 文獻標志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）10-0974-07

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.10.017

Simultaneous Determination of 9 Mycotoxins in Angelica sinensis by Ultra High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LI Yufang 1， 2， JIAO Jie 1， 2， HUANG Zheng 1， 2， XIAO Feng 3， HUANG Yuanfei 3，

WANG Qing 1， 2， LIU Lilong 4， ZHANG Huan 1， 2

（1. Institute of Animal Husbandry， Pasture and Green Agriculture， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou

Gansu 730070， China; 3. Wenshan Sanqi Digital Materia Medica Inspection Centre Co.， Ltd.， Wenshan Yunnan 663000， China;

4. Wheat Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： An ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS） method for the determination of 9 mycotoxins in Angelica sinensis was established by optimizing the conditions of liquid chromatography and mass spectrometry. The samples were extracted by ultrasonic extraction of 70% methanol solution and purified by solid phase extraction column. Using mobile phase A， i.e.， 0.1% formic acid solution（containing 2 mmol/L ammonium formate）， and mobile phase B， i.e.， methanol， samples were separated by a C18 column and injected into a mass spectrometer， detected by ESI and multiple reaction monitoring mode （MRM）， and quantified by matrix external standard. The linear relationship between the standard curves of the nine mycotoxins was good （R2 > 0.995）. The detection limits were 0.04 to1.43 μg/kg， and the quantification limits were 0.12 to 4.75 μg/kg. The recoveries of high， medium and low concentrations were 77.8% to 113.6%. The relative standard deviation of the results was 0.2% to17.7%. The method was applied to the simultaneous detection of mycotoxins in 72 batches of Angelica sinensis samples. Mycotoxins were detected in 2 batches of Angelica sinensis samples， with a detection rate of 2.8%. The main mycotoxins in Angelica sinensis samples were AFTB1， AFTB2 and AFTG1. The method established in this study has the advantages of simple pretreatment and economy， and is suitable for the rapid detection of 9 mycotoxins in Angelica sinensis samples.

Key words： Angelica sinensis; Chinese medicinal material; Mycotoxin; Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Method validation

收稿日期：2024 - 08 - 16

基金項目：甘肅省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項（2020GAAS15）；甘肅省自然科學基金計劃項目（22JR5RA764）。

作者簡介：李玉芳（1964 — ），女，甘肅武威人，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制與檢測技術研究工作。Email： 1292153904@qq.com。

通信作者：焦 潔（1983 — ），女，甘肅通渭人，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術工作。Email： 14199634@qq.com。

當歸為傘形科植物Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，具有較高的藥用價值，故有“十方九歸”的美譽［1 ］。當歸具有補血活血、潤腸通便、調(diào)經(jīng)止痛等多重功效，能夠有效促進血液循環(huán)，緩解疼痛，并對腸道功能有良好的調(diào)節(jié)作用［2 ］?，F(xiàn)代藥理研究表明，當歸多糖、阿魏酸和當歸揮發(fā)油是當歸發(fā)揮造血、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、肝保護、神經(jīng)保護等作用的主要標志化合物。這些化合物的藥理作用機制已經(jīng)得到充分研究和證實，并在功能食品開發(fā)、藥物創(chuàng)新研發(fā)方面具有較大潛力［3 - 4 ］。當歸在甘肅省種植歷史久遠、品質(zhì)卓越，近年來種植面積穩(wěn)定在2.3萬hm2以上，當歸產(chǎn)業(yè)發(fā)展占全國出口總量的90%以上，形成了較為完善的產(chǎn)業(yè)鏈和銷售渠道。當歸在種植、采集、加工、儲藏及運輸?shù)亩鄠€環(huán)節(jié)極易遭受真菌污染，真菌在當歸內(nèi)部滋生繁衍，不僅可能破壞其珍貴的功效成分，還可能產(chǎn)生多種真菌毒素污染，進而對中藥的整體質(zhì)量和療效造成嚴重影響［5 - 7 ］。為有效管控中藥真菌毒素污染，部分國家和地區(qū)對中藥材真菌毒素的含量實施了強制性規(guī)定，并設立了嚴格的限量標準［8 - 9 ］。

近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）在中藥材真菌毒素檢測技術領域取得了顯著進展，并得到了廣泛應用［10 - 14 ］。該方法不僅提升了檢測的靈敏度和準確性，還顯著提高了分析效率，滿足現(xiàn)代社會對中藥材安全快速、準確檢測的需求。本研究同時提取當歸樣品中9種真菌毒素，采用固相萃取柱富集凈化，正離子和負離子切換模式和多反應監(jiān)測（MRM）模式進行檢測，建立了UPLC-MS/MS同時檢測當歸中9種真菌毒素的方法，以期為客觀評價甘肅省當歸藥材的安全性提供技術支持和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（1290系列液相色譜儀、6470系列三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司）；電噴霧電離源（Electrospray ionization，ESI）；渦旋儀（XW-80A，上海瀘西分析儀器廠）；純水系統(tǒng)（PALL/CascadaI，美國PALL公司）；氮吹儀（HGC-24A，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；超聲波清洗器（KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司）；HLB固相萃取柱（TC-MT3000，德國拜發(fā)公司）；HLB固相萃取柱［3 mL/200 mg，微純生物科技（廣州）有限公司］；分析天平（AS220-R2，蘇州培科實驗室儀器科技有限公司）。

1.1.2 試劑 黃曲霉毒素B1（AFTB1）、黃曲霉毒素B2（AFTB2）、黃曲霉毒素G1（AFTG1）、黃曲霉毒素G2（AFTG2）均購自美國Sigma-Aldrich公司，質(zhì)量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON，100 μg/mL）購自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；伏馬毒素B1（FB1，100μg/mL）、伏馬毒素B2（FB2，100 μg/mL）、赭曲霉毒素A（OTA， 100 μg/mL）、玉米赤霉烯酮（ZEN，100 μg/mL）均購自天津阿爾塔科技有限公司。甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；甲酸（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；乙酸銨（分析純，西隴科學股份有限公司）。

1.1.3 樣品 來自甘肅省當歸主產(chǎn)區(qū)岷縣、隴西縣、卓尼縣、漳縣、宕昌縣、臨潭縣等地的農(nóng)戶、生產(chǎn)合作社、生產(chǎn)企業(yè)和中藥材市場采集的當歸樣品，共計72批次。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 取粉碎后過二號篩（850±29 μm）的當歸粉末5.00 g，加入70%甲醇溶液50.0 mL，超聲處理30 min后離心。吸取上清液5.00 mL，緩緩通過已提前依次用甲醇和3 mL水預活化的HLB柱，直至柱中空氣通過，收集洗脫液。再以3 mL甲醇進行第二次洗脫，并收集洗脫液，將2次洗脫所得的液體合并，于40 ℃下利用氮氣將其緩慢吹至剩余2 mL，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾后得到上機液。取未經(jīng)真菌毒素污染的當歸樣品，按供試樣品前處理方法制備當歸空白基質(zhì)溶液。

1.2.2 標準溶液 對照品儲備溶液的制備：分別精密吸取AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、DON、FB1、FB2、OTA、ZEN標準溶液各1.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度并混勻，置于-20 ℃避光條件下保存?；旌蠈φ掌啡芤旱闹苽洌悍謩e精密量取AFTB1 10.00 mL、AFTB2 10.00 mL、AFTG1 10.00 mL、AFTG2 10.00 mL、DON 0.10 mL、FB1 0.10 mL、FB2 0.10 mL、OTA 0.20 mL、ZEN 0.05 mL至20 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度后混勻?；旌蠘藴嗜芤褐懈鹘M分濃度為AFTB1 25.00 ng/mL、AFTB2 7.25 ng/mL、AFTG1 25.00 ng/mL、AFTG2 7.25 ng/mL、DON 500.00 ng/mL、FB1 50.00 ng/mL、FB2 60.00 ng/mL、OTA1 15.00 ng/mL、ZEN 30.00 ng/mL，-20 ℃避光條件下保存。混合對照溶液標準曲線的制備：分別精密量取混合對照品溶液0.16、0.20、0.32、0.40、0.80、1.00 mL，氮氣吹干，加當歸空白基質(zhì)溶液1.0 mL，混勻后即得AFTG1、AFTB1（4、5、8、10、20、25 ng/mL），AFTG2、AFTB2（1.16、1.45、2.32、2.90、5.80、7.25 ng/mL），DON（80、100、160、200、400、500 ng/mL），F(xiàn)B1（8、10、16、20、40、50 ng/mL），F(xiàn)B2（9.6、12.0、19.2、24.0、48.0、60.0 ng/mL），OTA（18.4、23.0、36.8、46.0、92.0、115.0 ng/mL），ZEN（4.8、6.0、9.6、12.0、24.0、30.0 ng/mL）的系列標準曲線。

1.2.3 液相色譜條件 參考劉笑笑等［15 ］的方法，液相色譜柱為Hypersil GOLDTMaQ色譜柱；流動相A：2 mmol/L甲酸銨0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇；流速：0.3 mL/min，進樣體積：5 μL；柱溫：25 ℃；流動相梯度洗脫程序見表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件 采用直接進樣技術，對9種目標化合物進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。分別在電噴霧離子化正模式（ESI+）和電噴霧離子化負模式（ESI-）下，對這9種真菌毒素的保留時間和峰形進行全面掃描。參考劉笑笑等［15 ］、李鳳華等［16 ］的方法，檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）；ESI掃描方式為正、負離子掃描。離子源溫度：正離子模式650 ℃、負離子模式600 ℃；氣簾氣：40 psi；電噴霧電壓：正離子模式4 000，負離子模式-4 000；柱流速0.3 mL/min，對照品溶液和當歸樣品溶液進樣量均為5 μl；9種真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.2.5 流動相 參考2020版《中華人民共和國藥典》［17 ］、劉笑笑等［15 ］對比兩組流動相對9種真菌毒素出峰的影響情況。

1.2.6 凈化條件優(yōu)化 分別使用微純生物科技有限公司和德國拜發(fā)公司的HLB固相凈化柱，對9種真菌毒素3個水平濃度的樣品進行凈化處理，每個濃度重復3次，比較9種毒素加標樣品的回收率。

1.2.7 方法學驗證 以1.2.2中混合對照品系列標準曲線濃度樣品，按照1.2.3和1.2.4測定法進樣測定，以平均峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。據(jù)《中華人民共和國藥典》2020版四部通則9101分析方法驗證指導原則要求，把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠檢測出的被測物質(zhì)最低濃度或量。以信噪比為3∶1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限；以信噪比為10∶1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限。

1.2.8 方法精密度和回收率 分別取當歸空白基質(zhì)溶液，添加定量限、2倍定量限和4倍定量限3個水平的9種真菌毒素混合標準溶液，進行前處理，測定其回收率和相對標準偏差（RSD），重復6次。

1.2.9 實際樣品的檢測 使用優(yōu)化后的條件，對采集的72批當歸樣品9種真菌毒素同時進行檢測。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件

9種真菌毒素優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2。優(yōu)化時9種真菌毒素的濃度見表3，MRM色譜圖見圖1。可以看出，OTA、ZEN在ESI-掃描模式下響應更好，其余7種真菌毒素采用ESI+模式進行掃描。

2.2 流動相

由圖2可知，A組流動相（10 mmol/L醋酸銨溶液-甲醇）9種真菌毒素中FB2不出峰，其余成分均可正常出峰；B組流動相（0.1%甲酸的2 mmol/L甲酸銨-甲醇）9種真菌毒素均可正常出峰。因此，本方法選擇B組流動相。

2.3 凈化條件

通過HLB柱（拜發(fā)）凈化的樣品較為澄清，通過HLB柱（微純生物）凈化的樣品略渾濁，說明HLB柱（拜發(fā)）的凈化效果略優(yōu)于HLB柱（微純生物）。從圖3可以看出，F(xiàn)B1和FB2的檢測受基質(zhì)效應影響，通過HLB柱（微純生物）凈化的樣品加標回收率略高于HLB柱（拜發(fā)），其余7個成分的兩組樣品加標回收率相近，符合2020版《中國藥典》第四部通則9101分析方法驗證指導原則要求，加樣回收率為70%～125%。兩種HLB柱都可以用于當歸9種毒素的測定，HLB柱（拜發(fā)）是毒素專用凈化柱，用于少量樣品的檢測；HLB柱（微純生物）成本相對較低，可用于大批量樣品的快速篩查和風險監(jiān)測。

2.4 方法學驗證

2.4.1 工作曲線和檢出限、定量限 由表4可以看出，在各自的線性范圍內(nèi)，9種真菌毒素具有良好的線性關系，相關系數(shù)R2均大于0.995 0。方法的檢出限在0.04～1.43 μg/kg，定量限在0.12～4.75 μg/kg，均低于《中華人民共和國藥典》真菌毒素的限量標準［17 ］，滿足限量檢出要求。

2.4.2 方法精密度和回收率 由表5可以看出，9種真菌毒素的加標回收率為77.8%～113.6%，測定值的相對標準偏差（RSD）為0.2％～17.7％，表明所建立的方法準確可靠。

2.5 樣品的檢測

通過對采集的72批當歸樣品檢測發(fā)現(xiàn)，有2批當歸樣品檢出真菌毒素，檢出率為2.8%，當歸中主要的污染毒素為AFTB1、AFTB2、AFTG1。2批次毒素檢出AFTB1濃度分別為3.3、3.4 μg/kg，AFTB2分別為7.2、7.1 μg/kg，AFTG1分別為10.4、9.6 μg/kg。2批次當歸AFT總量大于10 μg/kg，超出中藥材AFT總量≤10 μg/kg的限量。

3 討論與結論

在電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）技術中，電離過程的溶液環(huán)境特性對分析結果的影響不容忽視［18 - 19 ］。首先，不同的溶劑系統(tǒng)可能會改變化合物在色譜柱上的吸附和解吸行為，從而影響其在色譜圖上的保留時間。其次，流動相的配比也會對峰形產(chǎn)生顯著影響。流動相中不同組分的比例變化可能會改變色譜柱的洗脫能力，進而影響目標化合物在色譜圖上的峰形。在電噴霧電離過程中，溶劑的極性和溶劑化能力對離子的形成和穩(wěn)定至關重要。極性溶劑通常有助于形成更多的離子，而溶劑化能力的增強則有助于穩(wěn)定這些離子，從而提高離子化效率。本研究通過樣品凈化條件，樣品前處理方法、色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了一種利用固相萃取柱凈化、UPLC-MS/MS同時測定當歸中9種真菌毒素的方法。與《中華人民共和國藥典》和傳統(tǒng)方法中使用免疫親和柱相比，可較大程度降低檢測成本。樣品采用電噴霧電離源（ESI）和多反應監(jiān)測模式（MRM），基質(zhì)匹配外標法定量。9種真菌毒素標準曲線線性關系良好（R2 > 0.995 0），方法的檢出限為0.04～1.43 μg/kg，定量限為0.12～4.75 μg/kg，高、中、低3個濃度加標回收率為77.8%～113.6%，測定結果的相對標準偏差為0.2%～17.7%。該方法操作簡便，具有較好的凈化效果、良好的加標回收率、較高的準確度和可靠性，可滿足當歸中真菌毒素的大通量快速篩查和準確定量，也為其他中藥基質(zhì)中多種真菌毒素含量的同時檢測提供技術借鑒。我們采用此方法對甘肅省72份不同來源的當歸中藥材樣本進行了系統(tǒng)檢測，通過檢測和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)其中有2.8%的樣本存在真菌毒素污染，且主要污染的真菌毒素為黃曲霉毒素類（AFTB1、AFTB2、AFTG1）。這一結果表明，盡管大多數(shù)中藥材在采集和加工過程中能夠保持良好的衛(wèi)生標準，但仍有部分樣本存在潛在的真菌毒素污染風險，本研究也為甘肅省當歸中真菌毒素污染狀況的調(diào)查提供了數(shù)據(jù)支持。

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