摘要：研究溫度影響種子吸脹過(guò)程中抗氧化生理的變化規(guī)律，對(duì)于揭示種子的萌發(fā)機(jī)制具有積極意義。本研究以老芒麥（Elymus sibiricus）種子為材料，探索在不同溫度（10℃，25℃和30℃）下種子萌發(fā)特性和吸脹過(guò)程中抗氧化生理變化。結(jié)果表明，與25℃相比，在10℃和30℃脅迫下，老芒麥種子的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)以及幼苗根長(zhǎng)均顯著降低（P<0.05）。10℃對(duì)種子的影響更大，種子中過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）、谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroascorbate reductase，MDHAR）活性和線粒體氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）含量下降，發(fā)芽被抑制，萌發(fā)時(shí)間延遲。而30℃下種子中過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、POD，GR的活性和線粒體抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、GSSG含量升高，繼而保證了種子的正常萌發(fā)進(jìn)程。試驗(yàn)結(jié)果為掌握種子吸脹過(guò)程中抗氧化生理的變化規(guī)律提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：老芒麥；溫度；種子吸脹；線粒體；抗氧化系統(tǒng)

中圖分類號(hào)：S543.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）10-3151-08

Study on Germination Characteristics and Antioxidant Physiology of Siberian wildrye Seeds under Different Temperature Conditions

SHI Jin-yu， SUN Shou-jiang， MA Wen， MAO Pei-sheng^*

（College of Grass Science and Technology， China Agricultural University， Key Laboratory of Pratacultural Science，Beijing 100193， China）

Abstract：Study the effects of temperature on the antioxidant physiology of seed imbibition has a positive significance in revealing the seed imbibition and germination mechanism. The experiment used Siberian wildrye （Elymus sibiricus） seeds as materials to explore the changes in seed germination characteristics and antioxidant indexes during the imbibition process under different temperature conditions （10℃，25℃ and 30℃）. The results showed that compared to 25℃，the seed germination percentage，germination index and root length of Siberian wildrye seedlings under 10℃ and 30℃ stress were decreased significantly （P <0.05）. 10℃ had a greater impact on seeds. The activities of peroxidase （POD），monodehydroascorbate reductase （MDHAR），glutathione reductase （GR） and the content of mitochondrial oxidized glutathione （GSSG） in Siberian wildrye seeds were decreased at 10℃，while the germination was inhibited and the germination time was delayed. The activities of catalase （CAT），POD，GR and the contents of mitochondrial ascorbic acid （AsA），glutathione （GSH） and GSSG were increased at 30℃treatment，which maintained the normal process of seed germination. The results of our experiment provide a basis for further understanding the changes of antioxidant physiology during seed imbibition，and have reference value.

Key words：Siberian wildrye;Temperature;Seed imbibition;Mitochondria;Antioxidant system

收稿日期：2024-02-22；修回日期：2024-04-26

基金項(xiàng)目：鄉(xiāng)土草種種子干燥、引發(fā)、包衣、丸?；夹g(shù)研究（SJCZFY2022-4）資助

作者簡(jiǎn)介：

石金玉（2001-），女，漢族，河北保定人，碩士研究生，主要從事草類種子生理與生產(chǎn)研究，E-mail：s20233243639@cau.edu.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：maops@cau.edu.cn

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最基本的生產(chǎn)資料，是作物、牧草、草坪草種植生產(chǎn)的基礎(chǔ)條件。在植物的整個(gè)生命周期中，種子萌發(fā)是一個(gè)非常關(guān)鍵的階段，涉及多種形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、生理生化以及基因調(diào)控等代謝活動(dòng)。通常將種子萌發(fā)分為3個(gè)階段。階段I是吸脹作用，種子迅速進(jìn)行物理吸水，并開(kāi)始修復(fù)線粒體等細(xì)胞器和生物大分子。階段II是萌動(dòng)階段，種子重新啟動(dòng)水代謝進(jìn)程，吸收的速度放緩甚至停止，通過(guò)生物大分子的修復(fù)和細(xì)胞器的激活，種胚細(xì)胞重新生長(zhǎng)，在此過(guò)程中，種子的含水量相對(duì)穩(wěn)定。階段III是種子發(fā)芽階段，這時(shí)種胚細(xì)胞的分裂和分化速度顯著增加，胚根從種皮伸出，加速吸收水分^［1］。

溫度、水分以及光照等環(huán)境因素都會(huì)對(duì)種子的萌發(fā)造成一定的影響^［2］。其中，溫度條件是影響種子萌發(fā)的各項(xiàng)因素中最重要的外部因素之一^［3］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分牧草種子在低于15℃或高于35℃時(shí)都不能很好地萌發(fā)^［4］。當(dāng)溫度變化造成脅迫時(shí)，種子的萌發(fā)會(huì)受到影響，細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的平衡也會(huì)被打破，導(dǎo)致ROS過(guò)度積累。ROS作為信號(hào)分子在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)生物/非生物脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用^［5］。但是，當(dāng)ROS過(guò)量積累且不能被及時(shí)清除的時(shí)候，就會(huì)形成氧化損傷，阻礙正常的細(xì)胞功能，破壞碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等生物分子，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡^［6］。種子細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)可以有效清除細(xì)胞內(nèi)多余的ROS，降低和消除氧化脅迫，從而保證種子的正常萌發(fā)。植物抗氧化系統(tǒng)大致可分為兩類：第一類是抗氧化劑，例如抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等；第二類是抗氧化酶，例如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）等?？寡趸改軌?qū)ν獠棵{迫環(huán)境或內(nèi)部ROS的損害作出反應(yīng)^［7］，并且影響和調(diào)節(jié)抗氧化劑的含量，是調(diào)節(jié)種子細(xì)胞內(nèi)ROS平衡的主要因素。但不同溫度條件下種子吸脹過(guò)程中抗氧化生理變化規(guī)律仍不清楚。

老芒麥（Elymus sibiricus）是禾本科披堿草屬多年生草本植物，具有抗寒、抗旱、耐鹽、高產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)^［8-9］，廣泛種植于我國(guó)東北、華北、西北和西南地區(qū)^［10］，多在春秋播種，時(shí)常遇到溫度脅迫。低溫脅迫和高溫脅迫均會(huì)對(duì)種子出苗率以及幼苗生長(zhǎng)造成不利影響，進(jìn)而降低老芒麥品質(zhì)造成減產(chǎn)，在草地退化改良、生態(tài)環(huán)境建設(shè)和畜牧業(yè)發(fā)展等方面造成經(jīng)濟(jì)損失。但是目前的研究多關(guān)注種子萌發(fā)后期，鮮有報(bào)道溫度對(duì)種子吸脹期的影響。本試驗(yàn)以老芒麥種子為材料，通過(guò)發(fā)芽能力、抗氧化酶的活性、ROS和抗氧化物的含量，解析老芒麥種子萌發(fā)期間抗氧化系統(tǒng)各指標(biāo)對(duì)低溫和高溫脅迫的變化規(guī)律，以期改善牧草種子的田間出苗狀況，促進(jìn)幼苗和植株正常生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試種子為‘同德’老芒麥，種子發(fā)芽率為89%。篩選大小相近、均勻飽滿的種子貯藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種子實(shí)驗(yàn)室，以備后續(xù)試驗(yàn)使用，貯藏平均溫度為25℃，平均濕度為35%。

1.2 種子吸脹曲線制作

根據(jù)《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》^［11］（International Rules for Seed Testing，2023）種子發(fā)芽測(cè)定的方法進(jìn)行種子吸脹。以培養(yǎng)溫度25℃為對(duì)照，設(shè)置低溫（10℃）和高溫（30℃）處理。選取大小均勻并且飽滿無(wú)病害的老芒麥種子，置于11.5 cm×11.5 cm發(fā)芽盒中，鋪三層濾紙，加入蒸餾水，放在光照培養(yǎng)箱中，分別在10℃，25℃和30℃且黑暗條件下，吸脹不同時(shí)間（0，4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 h）后取出種子，用濾紙吸干種子表面的水分，準(zhǔn)確稱重并統(tǒng)計(jì)計(jì)算種子的吸水率。每個(gè)吸脹時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。計(jì)算方法：種子吸水率=［（吸水后種子質(zhì)量-吸水前種子質(zhì)量）/吸水前種子質(zhì)量］×100%。

以種子吸脹時(shí)間為橫坐標(biāo)，種子吸水率為縱坐標(biāo)，建立三條吸脹曲線：正常條件吸脹曲線、高溫條件吸脹曲線和低溫條件吸脹曲線。根據(jù)種子吸脹的階段性變化規(guī)律，分別在快速吸水階段、緩慢吸水階段和露白階段選擇3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

1.3 種子發(fā)芽能力的測(cè)定

根據(jù)《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》^［11］（2023），選擇100粒大小一致、飽滿、無(wú)病害的老芒麥種子，置于11.5 cm×11.5 cm發(fā)芽盒中，鋪三層濾紙。將發(fā)芽盒置于光照培養(yǎng)箱（GXZ-380B-LED）中，分別在10℃，25℃和30℃，光照8 h黑暗16 h條件下培養(yǎng)。每個(gè)溫度均設(shè)置4次重復(fù)。每24 h統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況，以胚根突破種皮2 mm為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算種子萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間；在第12 d從每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取20根正常種苗測(cè)量苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)。公式如下：

萌發(fā)率（%）=（胚根突破種皮2 mm種子數(shù)÷全部種子數(shù)）×100%。

發(fā)芽指數(shù)=∑（G/t），G為第t天胚根突破種皮2 mm的種子總數(shù)，t為發(fā)芽天數(shù)。

平均發(fā)芽時(shí)間=∑n/∑n，n為第t天胚根突破種皮2 mm的種子數(shù)，t為發(fā)芽天數(shù)。

1.4 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 提取液的制備 分別在10℃，25℃和30℃條件下，取吸脹時(shí)間分別為12 h，24 h和36 h的種子各0.2 g，在液氮中研磨粉碎，加入1.6 mL 1% 三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）振蕩均勻，12 000 g 4℃離心15 min，上清液記為種子提取液，用于測(cè)定抗氧化酶活性和活性氧含量。

1.4.2 線粒體提取與純化 分別在10℃，25℃和30℃條件下，取吸脹時(shí)間分別為12 h，24 h和36 h的種子各5 g。將其放入預(yù)冷的研缽中，加入研磨液，在冰浴上研磨成勻漿。再轉(zhuǎn)入10 mL預(yù)冷的離心管中，在2500 g 4℃條件下離心8 min。將上清液轉(zhuǎn)入新的預(yù)冷離心管中，在17 500 g 4℃條件下離心20 min。倒掉上清，用毛筆將沉淀輕輕打散，用吸管把沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入稀釋1倍的洗滌液［pH值為7.5，含0.6 mol·L^-1蔗糖，0.2% 牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），20 mmol·L^-1 N-三羥甲基甲基-2-氨基乙磺酸］，在2500 g 4℃條件下離心8 min。將上清液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的新的離心管中，在17 500 g 4℃條件下離心20 min。倒掉上清，用毛筆將沉淀輕輕打散，并用稀釋1倍的洗滌液（含BSA）沖洗毛筆。將得到的懸浮液輕輕加到梯度液上，配平，在40 000 g 4℃條件下離心40 min（離心機(jī)無(wú)制動(dòng)停下）。吸走上部分溶液，留取底部的線粒體，加入稀釋1倍的洗滌液（不含BSA），在31 000 g 4℃條件下離心15 min。吸走上清液，留沉淀，加入稀釋1倍的洗滌液（不含BSA），在31 000 g 4℃條件下離心15 min。吸走上清液，將純化的線粒體收集到1.5 mL離心管，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于測(cè)定抗氧化劑。

1.4.3 抗氧化酶活性測(cè)定 可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法，SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法，POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定^［12］。參照相關(guān)方法測(cè)定谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroascorbate reductase，MDHAR）活性^［13］。

1.4.4 抗氧化劑含量以及活性氧含量測(cè)定 AsA、氧化型抗壞血酸（Oxidized ascorbic acid，DHA）、GSH、氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）和過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide，HO）的測(cè)定均參考蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理使用WPS Office軟件，分析使用SPSS 27軟件，指標(biāo)相關(guān)性聚類分析使用TBtools-Ⅱ軟件，作圖使用GraphPad Prism 9.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)老芒麥種子吸脹和發(fā)芽特性的影響

繪制老芒麥種子的吸脹曲線（圖1A），25℃條件下，老芒麥種子吸脹0～20 h時(shí)處于快速吸水階段，20～28 h時(shí)處于遲滯階段，28 h之后種子開(kāi)始露白，進(jìn)入發(fā)芽階段。在30℃高溫脅迫下，種子的吸水率較正常溫度有所提高，吸脹曲線變化進(jìn)程差別不明顯，吸脹0～20 h時(shí)處于快速吸水階段，20～28 h處于遲滯階段，28 h之后種子開(kāi)始露白，進(jìn)入發(fā)芽階段。而在10℃低溫脅迫下，老芒麥種子的吸水率大幅降低，吸脹曲線變化相對(duì)平緩，0～24 h處于快速吸水階段，24 h之后為遲滯階段。根據(jù)三個(gè)溫度下老芒麥種子階段性吸脹的變化規(guī)律，選取吸脹三個(gè)階段對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)：12 h，24 h和36 h。

不同溫度處理對(duì)老芒麥種子的發(fā)芽情況造成不同程度的影響，與25℃相比，10℃和30℃下種子的萌發(fā)率均降低，且10℃下老芒麥種子的萌發(fā)能力被大幅抑制，萌發(fā)時(shí)間嚴(yán)重推后（圖1B）。與25℃相比，30℃下老芒麥種子的平均發(fā)芽時(shí)間無(wú)顯著差異，種子發(fā)芽指數(shù)顯著降低（P＜0.05），幼苗的苗長(zhǎng)顯著增加（P＜0.05），根長(zhǎng)顯著降低（P＜0.05）；10℃下老芒麥種子的發(fā)芽能力被大幅抑制，平均發(fā)芽時(shí)間顯著增加（P＜0.05），發(fā)芽指數(shù)顯著降低（P＜0.05），幼苗的根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)顯著降低（P＜0.05）（圖1 C-F）。

2.2 不同溫度處理下老芒麥種子抗氧化酶活性的變化

不同溫度條件下，老芒麥種子在不同吸脹時(shí)間點(diǎn)的CAT和POD活性變化趨勢(shì)基本相同。當(dāng)種子吸脹12 h時(shí)，三個(gè)溫度下POD和CAT活性均無(wú)顯著變化；吸脹24 h時(shí)，10℃下POD活性顯著低于25℃和30℃（P＜0.05），而30℃下CAT活性顯著高于25℃和10℃（P＜0.05）；吸脹36 h時(shí)，30℃下POD和CAT活性均顯著高于25℃和10℃（P＜0.05），25℃下POD和CAT活性均顯著高于10℃（P＜0.05）（圖2A-B）。當(dāng)種子吸脹12 h時(shí)，30℃下SOD活性顯著高于25℃和10℃（P＜0.05）；吸脹24 h時(shí)，10℃下SOD活性顯著低于30℃（P＜0.05）。當(dāng)種子吸脹12 h時(shí)，25℃下GR活性顯著高于10℃（P＜0.05）；吸脹36 h時(shí)，30℃下GR活性顯著高于25℃和10℃（P＜0.05），25℃下GR活性顯著高于10℃（P＜0.05）。當(dāng)種子吸脹12 h時(shí)，25℃下MDHAR活性顯著高于30℃和10℃（P＜0.05）；吸脹36 h時(shí)，10℃下MDHAR活性顯著低于25℃和30℃（P＜0.05）（圖2 C-E）。

2.3 不同溫度處理下老芒麥種子ROS含量的變化

不同溫度條件下，老芒麥種子在吸脹期間HO含量呈不同的變化趨勢(shì)。隨著吸脹時(shí)間的增加，HO含量在25℃下基本穩(wěn)定，而在10℃和30℃下呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)種子吸脹12 h時(shí)，30℃下HO含量顯著高于10℃和25℃（P＜0.05）；吸脹24 h時(shí)，30℃下HO含量顯著低于25℃（P＜0.05）；吸脹36 h時(shí)，10℃下HO含量顯著低于25℃和30℃（P＜0.05）（圖2F）。

2.4 不同溫度處理下老芒麥種子線粒體抗氧化物含量的變化

隨著吸脹時(shí)間的增加，10℃和30℃條件下老芒麥種子線粒體中AsA，DHA，GSH，GSSG含量基本呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而25℃條件下老芒麥種子線粒體中AsA，DHA，GSH，GSSG含量基本保持穩(wěn)定。

當(dāng)種子吸脹12 h時(shí)，10℃和30℃下線粒體中AsA和DHA含量均顯著高于25℃（P＜0.05），10℃下AsA/DHA比值顯著低于25℃（P＜0.05）；吸脹24 h時(shí)，30℃下AsA含量和AsA/DHA比值均顯著高于25℃和10℃（P＜0.05）；吸脹36 h時(shí)，30℃下DHA含量顯著低于10℃（P＜0.05），而AsA/DHA比值顯著高于25℃和10℃（P＜0.05）（圖3 A-C）。當(dāng)種子吸脹12 h時(shí)，10℃和30℃下線粒體中GSH和GSSG含量均顯著高于25℃（P＜0.05）；吸脹24 h時(shí)，30℃下GSH含量顯著高于10℃和25℃（P＜0.05），GSSG含量隨著吸脹溫度的增加顯著增加（P＜0.05）；吸脹36 h時(shí)，10℃下GSSG含量顯著低于25℃和30℃（P＜0.05）。隨著吸脹時(shí)間的增加10℃下GSH/GSSG比值顯著增長(zhǎng)（P＜0.05），且在吸脹24 h和36 h時(shí)顯著高于30℃和25℃（P＜0.05）（圖3D-F）。

2.5 抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)聚類分析

通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)（圖4），10個(gè)老芒麥種子抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)主要分為3組：Ⅰ包括GSSG含量和HO含量；Ⅱ包括AsA含量、GSH含量和DHA含量；Ⅲ包括SOD活性、MDHAR活性、CAT活性、POD活性和GR活性。從熱圖中可以明顯看出，Ⅰ中GSSG含量和HO含量在30℃吸脹早期較大，在10℃吸脹后期較小，說(shuō)明高溫和低溫脅迫均影響了GSSG含量和HO含量；Ⅱ中AsA含量、GSH含量和DHA含量在10℃和30℃吸脹早期均較大，而在25℃條件下吸脹早期較小，說(shuō)明高溫和低溫脅迫均影響了AsA含量、GSH含量和DHA含量;Ⅲ中SOD活性、MDHAR活性、CAT活性、POD活性和GR活性在10℃均較小，在30℃吸脹后期較大，說(shuō)明低溫脅迫影響了SOD活性、MDHAR活性、CAT活性、POD活性和GR活性，降低了種子的抗氧化能力，而高溫脅迫提高了MDHAR活性、CAT活性、POD活性和GR活性，增加了種子的抗氧化能力。

3 討論

3.1 溫度對(duì)老芒麥種子發(fā)芽特性的影響

溫度條件是影響種子萌發(fā)的各項(xiàng)因素中最重要的外部因素之一^［3］，種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)都對(duì)外界溫度條件有一定的要求。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老芒麥種子在溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)均下降，這與野生大豆（Glycine soja）在不同溫度下的萌發(fā)情況相似^［14］。溫度過(guò)高時(shí)，老芒麥幼苗的根長(zhǎng)也顯著下降，這與榔榆（Ulmus parvifolia）種子在不同溫度下幼苗的生長(zhǎng)情況相似^［15］。而30℃時(shí)，老芒麥種子的平均發(fā)芽時(shí)間比25℃時(shí)有所提前，苗長(zhǎng)略高，推測(cè)這與30℃時(shí)種子吸水率高于25℃吸水率有關(guān)。10℃時(shí)，種子發(fā)芽時(shí)間大幅增長(zhǎng)，生長(zhǎng)進(jìn)程減緩，根長(zhǎng)苗長(zhǎng)大幅縮短，這與西藏野生型老芒麥對(duì)溫度和水分的響應(yīng)結(jié)果相似^［16］。推測(cè)原因是低溫時(shí)種子吸水緩慢，多種酶活性受到抑制，代謝速度較慢。

3.2 溫度對(duì)老芒麥種子吸脹過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)的影響

低溫和高溫等脅迫條件會(huì)導(dǎo)致種子內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的破壞，進(jìn)而引起種子體內(nèi)的代謝紊亂，加劇膜脂過(guò)氧化程度，最終抑制種子的生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)種子也可以通過(guò)調(diào)控體內(nèi)的抗氧化酶活性和抗氧化物含量，形成種子對(duì)逆境脅迫的防御機(jī)制，清除體內(nèi)過(guò)量的ROS^［13］，維持細(xì)胞代謝的穩(wěn)定。

在本研究中，25℃條件下的老芒麥種子內(nèi)HO含量在不同吸脹時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有顯著變化，認(rèn)為種子中的ROS含量基本保持穩(wěn)定，種子生長(zhǎng)狀態(tài)正常。而在老芒麥種子吸脹12 h時(shí)，30℃條件下HO含量顯著高于正常溫度，后又下降達(dá)到新的平衡，說(shuō)明熱脅迫刺激老芒麥種子開(kāi)啟抗氧化防御機(jī)制，調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)含量來(lái)快速清除多余的HO，使其含量維持在一定范圍內(nèi)。這與鰻草（Zostera marina）在30℃下HO含量變化類似^［17］。在吸脹12 h和24 h時(shí)，低溫條件下HO含量和正常溫度下沒(méi)有顯著差異。在吸脹36 h時(shí)，低溫條件下HO含量顯著減少至較低水平，推測(cè)原因是種子吸水速率較慢，受到低溫脅迫時(shí)間較長(zhǎng)，代謝速度減緩，甚至部分死亡，HO產(chǎn)生量減少。與之相比，高溫脅迫初期HO含量顯著增高，后又降低至穩(wěn)定水平，說(shuō)明30℃處理下老芒麥種子內(nèi)部能夠?qū)OS含量控制在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，這可能是其能保持發(fā)芽率不大幅下降的原因之一。

POD，SOD和CAT是植物抗氧化系統(tǒng)里非常重要的酶，通過(guò)協(xié)同作用，使植物體內(nèi)活性氧維持在一個(gè)較低的水平，從而防止植物受到過(guò)氧化損傷^［18-19］。其中，CAT和POD可以共同協(xié)作將HO轉(zhuǎn)化為HO和O，以此完成對(duì)ROS的清除。在本試驗(yàn)中，10℃條件下老芒麥種子的SOD，POD和CAT活性大部分時(shí)間與正常溫度處理無(wú)顯著差異。結(jié)合HO含量分析，推測(cè)原因是10℃時(shí)老芒麥種子吸脹萌發(fā)延緩。這也有可能與老芒麥種子具有一定抗寒性有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)SOD，POD，CAT三種酶在低溫脅迫下活性的變化與植物的抗寒性相關(guān)^［20-21］。而在30℃條件下，CAT和POD活性不斷升高，對(duì)高溫脅迫響應(yīng)較快。有研究發(fā)現(xiàn)，植物為了應(yīng)對(duì)高溫下ROS的過(guò)量產(chǎn)生，啟動(dòng)了熱應(yīng)激響應(yīng)途徑，還誘導(dǎo)了應(yīng)激相關(guān)蛋白和抗氧化蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高了抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Aseorbate peroxidase，APX）、CAT或SOD等抗氧化酶的活性，從而緩解了ROS引起的氧化損傷^［22］。

MDHAR能夠催化NADH還原單脫氫抗壞血酸（Dehydroascorbic acid，MDHA）生成AsA和NAD⁺，GR能夠催化NADPH將GSSG還原再生成GSH，同時(shí)NADPH脫氫生成NADP⁺。因此，MDHAR和GR是確保AsA和GSH再生的關(guān)鍵酶^［18］，能維護(hù)AsA-GSH循環(huán)的順利進(jìn)程，消除或減輕ROS對(duì)細(xì)胞造成的損害。在本試驗(yàn)中，10℃條件下老芒麥種子的MDHAR和GR活性隨吸脹時(shí)間基本沒(méi)有變化，且常低于25℃條件下的活性。推測(cè)原因是MDHAR和GR活性受到低溫抑制。在30℃條件下，MDHAR和GR活性逐漸增加，這與玉米（Zea mays）在高溫脅迫下AsA-GSH循環(huán)中GR活性的變化相似，MDHAR活性的變化相反^［23］。由于不同植物之間對(duì)低溫以及高溫的耐受程度有所不同，所以抗氧化酶活性對(duì)低溫以及高溫的反應(yīng)結(jié)果也可能不盡相同。

AsA/DHA和GSH/GSSG具有電子受體的作用，是細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原對(duì)。本試驗(yàn)中，10℃和30℃條件下老芒麥種子線粒體中AsA，DHA，GSH，GSSG含量在吸脹12 h時(shí)均顯著高于25℃下含量，30℃條件下AsA/DHA比值顯著高于25℃，10℃條件下GSH/GSSG比值顯著高于25℃。這說(shuō)明AsA，DHA，GSH，GSSG在種子應(yīng)對(duì)低溫脅迫和高溫脅迫時(shí)均有重要作用，而GSH/GSSG在應(yīng)對(duì)低溫脅迫更敏感，AsA/DHA在應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)更敏感。有研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下小麥（Triticum aestivum）幼苗AsA和GSH含量呈上升趨勢(shì)^［24］；在熱脅迫下白三葉（Trifolium repens）幼苗AsA和GSH含量顯著上升^［25］；不同品種的黃瓜（Cucumis sativus）幼苗在38℃下AsA，GSH和GSSG含量均高于28℃^［26］。

3.3 老芒麥種子吸脹過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)對(duì)溫度的響應(yīng)規(guī)律

基于本試驗(yàn)中不同溫度處理對(duì)老芒麥種子吸脹過(guò)程中抗氧化酶活性、抗氧化劑含量和活性氧含量的變化，繪制了老芒麥種子吸脹過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)對(duì)溫度的響應(yīng)規(guī)律示意圖（圖5）。與正常25℃吸脹的種子相比，30℃下老芒麥種子在吸脹過(guò)程中，積極調(diào)動(dòng)抗氧化酶和抗氧化劑及時(shí)清除ROS，隨著吸脹時(shí)間的增加，ROS清除速率大于產(chǎn)生速率，ROS含量逐漸降低，進(jìn)而緩解了高溫脅迫對(duì)老芒麥種子萌發(fā)進(jìn)程的影響。而10℃下老芒麥種子在吸脹過(guò)程中，吸水率較低，多個(gè)抗氧化酶活性降低，不能及時(shí)清除ROS，隨著脅迫時(shí)間的增加，部分種子死亡，萌發(fā)率降低。與10℃相比，30℃下活性增加的酶較多，這可能是老芒麥種子在30℃下萌發(fā)率降低較少，但是10℃下種子發(fā)芽特性嚴(yán)重下降的原因。

4 結(jié)論

與對(duì)照溫度（25℃）相比，低溫脅迫抑制了老芒麥種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為降低種子的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)，增加平均發(fā)芽時(shí)間；通過(guò)降低種子中CAT，POD，MDHAR，GR活性和線粒體內(nèi)GSSG含量，產(chǎn)生嚴(yán)重氧化損傷，繼而延緩了種子萌發(fā)的正常進(jìn)程。而高溫脅迫對(duì)老芒麥種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響較小，主要表現(xiàn)為降低了種子的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)和根長(zhǎng)，增加了苗長(zhǎng)；通過(guò)提高種子中CAT，POD，SOD，GR活性和線粒體中AsA，DHA，GSH和GSSG含量，及時(shí)降低HO含量，從而減少氧化損傷，繼而維持種子萌發(fā)的正常進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）