收稿日期：2024-04-10；修回日期：2024-05-15

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2017BY082）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2019M660877）；國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目（32192463）資助

作者簡(jiǎn)介：郭艷萍（1986-），女，漢族，河北邯鄲人，博士，助研，主要從事草地管理、草種質(zhì)資源研究，E-mail：guoyp@caf.ac.cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：luohailing@cau.edu.cn

摘要：準(zhǔn)確獲取食草動(dòng)物食性數(shù)據(jù)有助于了解草地放牧家畜的營(yíng)養(yǎng)狀況，同時(shí)也對(duì)掌握草地植物群落的動(dòng)態(tài)變化具有重要意義。本研究通過(guò)從灘羊糞便樣本中提取DNA，利用ITS2條形碼和糞便DNA宏條形碼技術(shù)（fDNA metabarcoding），基于出現(xiàn)頻率（Frequency of occurrence，F(xiàn)O）和相對(duì)序列豐度（Relative read abundance，RRA）兩個(gè)指標(biāo)快速分析獲得糞便中的物種組成。分析獲得的灘羊食物組成包含28個(gè)植物類群，主要有藜屬（Chenopodium sp.）、苜蓿屬（Medicago sp.）、蒿屬（Artemisia sp.）等隸屬于13科23屬，其中27個(gè)鑒定到種水平，物種鑒定分辨率高達(dá)96%。藜屬FO和RRA均最高，分別為100.0%和31.5%，其次為紫花苜蓿（Medicago sativa），分別為100.0%和26.9%?；趦煞N算法分析得到的食物比例具有差異性和一致性，其中紫花苜蓿是放牧灘羊的主要采食來(lái)源，但攝入比例需要校正。研究證明了基于ITS2片段的糞便DNA宏條形碼技術(shù)在食草家畜快速準(zhǔn)確食性分析中的可行性，為此類研究提供了有力借鑒。建議采用該技術(shù)時(shí)應(yīng)完善潛在攝食植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，準(zhǔn)確分析目標(biāo)家畜在特定區(qū)域內(nèi)的采食種類。

關(guān)鍵詞：綿羊；食性；DNA宏條形碼；ITS2;物種鑒定

中圖分類號(hào)：S541 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）10-3043-09

Fecal DNA Metabarcoding-based Diet Composition Research of Grazing Lambs on Artificial Pasture

GUO Yan-ping^1，2， WANG Yue-jun¹， PENG Si-jia¹， ZUO Shu-xian¹， ZHANG Ying-jun³， LUO Hai-ling^1*

（1. State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding， College of Animal Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China; 2. Research Institute of Forestry， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China; 3. College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract：Acquiring accurate dietary composition information of herbivores is a valuable tactic in understanding their nutritional level and the function of the grassland ecosystem. This study collected Tan lambs fecal samples from three treatment groups：artificial pasture grazing（G），artificial pasture grazing with the indoor feeding group （GF），and the indoor feeding group （F）. DNA was then extracted from the samples and the species were identified based on the ITS2 gene and DNA mebarcoding technique. Frequency of occurrence （FO） and Relative read abundance （RRA） were used to determine the diet composition. Using fecal DNA metabarcoding，we conducted diet analysis for the lambs and found 28 different plant operational taxonomics unites （OTUs） belonging to 13 families and 23 genera，of which 27 were identified to the species level，and the species identification resolution was 96%. The predominant categories were Chenopodium sp.，Medicago sp.，and Artemisia sp.. Chenopodium sp. had the highest relative FO （100.0%） and RRA （31.5%） among all the ingested foods，followed by Medicago sativa （100.0% and 26.9%，respectively）. Therefore，to some extent the proportion obtained by frequency of occurrence and relative read abundance showed consistent tendencies but also generated differences. The results revealed that M.sativa was the main diet component of lambs，however its accurately proportion needs further correction. In addition，we suggested that the usage of fecal DNA barcode analysis approach should consider feeding range，targeted herbivores，and improved barcode database，which favorable to accurately determination of species and ingestion proportion. Our study highlights the utilization of fecal DNA metabarcoding based ITS2 gene in fast and high-throughput diet analysis，and provides a technical guidance for future herbivore livestock nutrition surveys and food-web studies.

Key words：Sheep;Diet analysis;DNA metabarcoding;ITS2;Species identification

食草家畜食性研究是掌握草地放牧家畜營(yíng)養(yǎng)狀況的基礎(chǔ)，也是監(jiān)測(cè)草地植物群落動(dòng)態(tài)變化的重要載體，對(duì)于開(kāi)展草地精細(xì)化管理、家畜高效飼養(yǎng)策略、畜產(chǎn)品提質(zhì)增效等具有重要意義^［1-2］。準(zhǔn)確獲取放牧家畜的采食組分及采食量，是探究放牧家畜生長(zhǎng)水平及其差異性形成原因的關(guān)鍵，同時(shí)也能反映出其選擇性采食對(duì)草原生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的影響^［3］。然而放牧家畜的牧食行為較為復(fù)雜，采食數(shù)據(jù)獲取難度大^［4］。傳統(tǒng)的草食家畜食性研究方法有很多，主要包括模擬采食法、牧草采食法、食道瘺管法、瘤胃內(nèi)容物法、糞便顯微分析法、植物蠟層指示劑法和近紅外光譜法等^［5-7］。

自90年代以來(lái)，以飽和鏈烷為代表的植物蠟層指示劑法使用范圍最廣^［8-14］。牧草中的鏈烷、長(zhǎng)鏈脂肪酸和長(zhǎng)鏈醇以及其他碳同位素組分可以作為“植物指紋”來(lái)直接估測(cè)放牧家畜的0uv8M8yxVYMJVCErQ9WqF2Jz8NXVU7ANwUAd0VzadhU=采食成分及采食量，對(duì)日糧組成簡(jiǎn)單的家畜食譜的估測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠^［15-16］。盡管該方法具有準(zhǔn)確度高、低成本、易操作、非損傷性采樣等優(yōu)點(diǎn)，但如果飼草中的鏈烷濃度較低，或者物種間鏈烷模式相似時(shí)，隨著自由采食家畜的食物組分復(fù)雜化，準(zhǔn)確性會(huì)明顯下降，而且植物飽和鏈烷的濃度模式會(huì)因季節(jié)波動(dòng)差異較大，需要在不同季節(jié)反復(fù)取樣監(jiān)測(cè)，過(guò)程繁瑣，這也是植物蠟層成員的共有缺陷。

伴隨著分子生物學(xué)研究的逐步深入和高通量測(cè)序（High-throughput sequencing，HTS）技術(shù)的快速發(fā)展，糞便DNA宏條形碼技術(shù)（fDNA metabarcoding）的出現(xiàn)為動(dòng)物食性研究提供了一種更高效、更準(zhǔn)確的手段^{［2，17-19］}。DNA宏條形碼是利用高通量測(cè)序手段獲得樣本中多個(gè)物種DNA條形碼片段，通過(guò)生物信息學(xué)手段實(shí)現(xiàn)物種鑒定的技術(shù)^［20］。該技術(shù)不受物種的個(gè)體形態(tài)及發(fā)育時(shí)期限制，對(duì)于高度降解的食物殘?jiān)舾行愿?，能夠快速獲取更高通量的物種信息，同時(shí)也避免了傳統(tǒng)方法的主觀誤差^［21-22］。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食草動(dòng)物和食肉動(dòng)物的食性研究領(lǐng)域中，如軟體動(dòng)物^［23］、節(jié)肢動(dòng)物^［24］、爬行動(dòng)物^［25］、鳥(niǎo)類^［26］和哺乳動(dòng)物^［27-28］等。

灘羊作為寧夏優(yōu)質(zhì)綿羊品種，因其肉質(zhì)鮮嫩、膻味小、風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。隨著灘羊市場(chǎng)需求的加大和緩解天然草場(chǎng)放牧壓力的客觀需求，養(yǎng)殖模式逐漸由傳統(tǒng)的天然草場(chǎng)放牧向規(guī)?；犸暬蛉斯げ輬?chǎng)放牧轉(zhuǎn)變。前期研究發(fā)現(xiàn)不同飼養(yǎng)方式會(huì)影響羊肉的色澤、口感及營(yíng)養(yǎng)成分^［29］，然而采食組分?jǐn)z入與灘羊肉品質(zhì)形成之間的關(guān)系尚不清晰。本研究以灘羊糞便為實(shí)驗(yàn)材料，利用DNA宏條形碼技術(shù)探討其食物組成，為開(kāi)展不同飼養(yǎng)方式下灘羊采食組分差異研究提供方法基礎(chǔ)，進(jìn)而為灘羊精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)和實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)點(diǎn)概況

試驗(yàn)樣地為人工混播草地，位于寧夏回族自治區(qū)固原市原州區(qū)頭營(yíng)鎮(zhèn)馬園村（106°26′E，36°14′N，平均海拔1600 m）。樣地設(shè)置4個(gè)放牧小區(qū)，面積為516 m²?；觳ゲ莸胤N植紫花苜蓿（Medicago sativa）、草地早熟禾（Poa pratensis）、草地雀麥（Bromus riparius）的組合比例為15%，35%及50%，畝播量為4.5 kg。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2019年7—10月進(jìn)行。選擇體重（19.76±0.29）kg相近的3月齡斷奶灘羊公羔33只，隨機(jī)分為3組，每組11只。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理組，分別為舍飼組（F）、人工草場(chǎng)限時(shí)放牧補(bǔ)飼組（GF）和人工草場(chǎng)放牧組（G）。F組每天飼喂兩次，時(shí)間分別為7：30和17：30，并保證活動(dòng)時(shí)間1～2 h；GF組每天7：00—11：00進(jìn)行放牧，歸牧后進(jìn)行補(bǔ)飼，試驗(yàn)日糧同舍飼組；G組每天7：00—19：00進(jìn)行放牧，不補(bǔ)飼。G組和GF組的灘羊采取輪牧形式，放牧試驗(yàn)結(jié)束后，所有羊只歸圈。飼養(yǎng)試驗(yàn)期間自由飲水。試驗(yàn)日糧依據(jù)NRC（2007）肉用綿羊的營(yíng)養(yǎng)需求，按照體重30 kg，日增重200 g的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平詳見(jiàn)表1所示。

1.3 樣品采集和保存

分別從3個(gè)處理組中隨機(jī)挑選5只羔羊用于采集新鮮糞便樣品。具體采集方法為：采樣期間，灘羊在歸牧后單獨(dú)置于圍欄內(nèi)，并在欄底鋪上干凈塑料布，在次日清晨飼喂或放牧之前收集糞樣，并迅速置于-20℃保存。將連續(xù)收集三天的新鮮糞便樣本均勻混合為15份，置于-20℃冰箱低溫保存，用于后續(xù)分析采食組分。

1.4 糞便DNA提取和PCR擴(kuò)增

將采集的糞便樣品迅速粉碎，稱取200 mg放入2 mL微量離心管內(nèi)，將離心管置于冰上。使用糞便基因組DNA提取試劑盒（Omega Biotek，Norcross，GA）提取灘羊糞便總DNA，提取方法參考試劑盒詳細(xì)說(shuō)明。將所得DNA溶液收集到離心管后，-20℃保存。

以上述DNA為模板，基于文獻(xiàn)報(bào)道^［30］和前期研究^［31］，選用引物對(duì)rD5-ITS2（5′-barcode-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和rb1-ITS2f （5′-CGATACTTGGTGTGAATTGCAG-3′）進(jìn)行糞便中植物DNA核基因ITS2片段的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為350 bp。在引物5′端增加由8個(gè)特異性堿基序列組合而成的“barcode”標(biāo)簽，擴(kuò)增同一樣品的一對(duì)引物使用相同標(biāo)簽，以區(qū)分后續(xù)混合樣品高通量測(cè)序結(jié)果中的序列來(lái)源。

PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括樣品DNA 10 ng dNTPs （2.5 mmol·L^-1） 2.0 μL，5×FastPfu buffer 4.0 μL、5×FastPfu聚合酶0.4 μL，正反引物各0.8 μL （5 μmol·L^-1），牛血清蛋白（BSA）0.2 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸60 s，循環(huán)45次；72℃延伸10 min。

1.5 高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)處理

PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶大小，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化，應(yīng)用QuantiFluor-ST （Promega，U.S.）進(jìn)行定量，將擴(kuò)增子等量混合，構(gòu)建文庫(kù)，使用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)完成雙端測(cè)序（Paired-end sequencing），由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

測(cè)序完成后，用QIIME（version1.17）軟件對(duì)原始fastq文件進(jìn)行嚴(yán)格的過(guò)濾和質(zhì)控處理，并形成一個(gè)新的帶有標(biāo)簽的序列文件。使用Usearch軟件，按照97%相似性對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，過(guò)程中使用UCHIME軟件識(shí)別并去除嵌合體序列，得到OTU代表序列。將所有優(yōu)化序列匹配至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。

對(duì)OTU進(jìn)行多樣性分析，以評(píng)估測(cè)序結(jié)果。利用MOTHUR（version1.30.1）軟件進(jìn)行物種覆蓋程度和Alpha多樣性分析，包括Good′s coverage指數(shù)、物種豐富度估計(jì)（Chao，ACE），物種多樣性統(tǒng)計(jì)（香農(nóng)指數(shù)Shannon index、辛普森指數(shù)Simpson index）。利用QIIME程序進(jìn)行主成分分析（Principal-component analysis，PCA），用R語(yǔ)言（version3.2.1）中的VEGAN程序包繪圖。

利用Blastn工具，將上述OTU代表序列與NCBI中的NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)OTU的物種注釋。按照序列同源性最高原則，對(duì)每一個(gè)代表性O(shè)TU序列進(jìn)行分類學(xué)注釋。同時(shí)需要綜合考慮其他因素，結(jié)合本地物種分布信息，如匹配物種所在特定地域的多樣性，對(duì)物種進(jìn)行最終注釋，確保結(jié)果可靠^［33］。物種注釋的原則為：在種水平上，相似性閾值設(shè)定為不低于95%；最匹配序列只對(duì)應(yīng)到單一植物物種，若該物種在當(dāng)?shù)赜蟹植?，則認(rèn)定序列屬于該物種；最匹配序列對(duì)應(yīng)到多個(gè)物種時(shí)，首先考慮排除在當(dāng)?shù)責(zé)o分布的物種，若仍對(duì)應(yīng)兩種以上，則在更高分類單元水平上（屬或科水平）對(duì)該序列進(jìn)行分類注釋。

1.6 采食數(shù)據(jù)分析

進(jìn)一步對(duì)注釋后的植物類群進(jìn)行篩選與整理，從OTU表格中剔除真菌及動(dòng)物自身的干擾序列，去除占比小于0.1%的序列，統(tǒng)計(jì)每份樣品中食物種類及其對(duì)應(yīng)的序列條數(shù)，然后進(jìn)行采食組分分析。用出現(xiàn)頻率（Frequency of occurrence，F(xiàn)O）和相對(duì)序列豐度（Relative read abundance，RRA）兩個(gè)指標(biāo)估計(jì)灘羊羔羊的食性構(gòu)成^［34］。

FO是含某一植物類別的樣品數(shù)占總樣品數(shù)的百分比，計(jì)算公式如下：

式中，N表示出現(xiàn)i類食物的樣品數(shù)，N是有效樣品總數(shù)。當(dāng)一份樣品中存在一種以上食物時(shí)，全部食物類別的FO之和大于100%。

RRA是某一植物類別的序列數(shù)在該樣品總植物序列的百分比，反映了相對(duì)生物量，計(jì)算公式如下：

式中，T是植物類別數(shù)，N是有效樣品總數(shù)，S是植物類別i在樣品j中的序列數(shù)。由公式可知，全部食物類別的RRA之和為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量和測(cè)序質(zhì)量

本研究從人工草場(chǎng)放牧組、限時(shí)放牧補(bǔ)飼組、舍飼組三個(gè)處理組中共采集灘羊糞便樣品15份，ITS2目標(biāo)區(qū)域全部擴(kuò)增成功。15份寧夏灘羊糞便樣品PCR產(chǎn)物高通量測(cè)序結(jié)果表明，所有樣品均擴(kuò)增到有效的食性數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、質(zhì)控之后，共收集到1 401 086條有效ITS2基因序列（valid sequences），每份樣品中含有的平均序列數(shù)為93 406條（70 046～121 613條），序列平均長(zhǎng)度為315 bp。

本試驗(yàn)中，在97%相似度水平進(jìn)行聚類分析共獲得835個(gè)OTUs。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU有效代表序列進(jìn)行分類學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，然后在各個(gè)水平分析灘羊糞便中物種多樣性和豐度指數(shù)等主要指標(biāo)。通過(guò)對(duì)Good’s coverage指數(shù)分析，數(shù)據(jù)顯示各個(gè)樣本的測(cè)序覆蓋率均超過(guò)了99%以上，說(shuō)明本次研究測(cè)序的ITS2有效序列代表了各個(gè)樣本99.9%以上的物種種類，足以覆蓋灘羊糞便中飼糧情況。

2.2 基于OTU水平的多樣性分析

對(duì)舍飼對(duì)照組（F）、限時(shí)放牧補(bǔ)飼組（GF）與放牧組（G）糞便樣本中的植物群落豐富度及多樣性指數(shù)進(jìn)行了比較分析（表2）。結(jié)果表明，三組樣本檢測(cè)到的OTU豐富度（Chao指數(shù)）沒(méi)有顯著差異。然而，三組糞便樣本之間的群落多樣性包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)具有顯著差異（P<0.01）。如圖1所示，通過(guò)Shannon指數(shù)組間差異分析發(fā)現(xiàn)，灘羊改變?nèi)占Z組成后，糞便植物種群多樣性降低，放牧比舍飼的物種多樣性明顯減少（P<0.05）。

圖2不同顏色圖例分別代表不同飼養(yǎng)模式灘羊的糞便樣本。通過(guò)PCA分析發(fā)現(xiàn)，三個(gè)不同飼養(yǎng)模式灘羊的糞便樣本植物群落組成具有明顯差異，說(shuō)明植物群落隨灘羊日糧組成的變化而呈明顯的梯度變化，舍飼組（F）和放牧組（GF和G）的群落組成具有明顯差異。PC1軸和PC2軸對(duì)結(jié)果的解釋度分別為42.53%和27.34%。

2.3 灘羊食物組成

對(duì)15份糞便樣品中的ITS2有效食性數(shù)據(jù)進(jìn)一步人工篩選和處理，去除序列占比小于0.1%的物種，并剔除真菌和動(dòng)物自身的干擾序列，剩余有效序列注釋后共鑒定出的牧草隸屬于13科23屬28種不同的物種類別，其中27種鑒定到種水平，1種鑒定到屬水平（表3和表4）。13種科分別是豆科（Fabaceae）、莧科（Amaranthaceae）、菊科（Asteraceae）、大麻科（Cannabaceae）、錦葵科（Malvaceae）、蓼科（Polygonaceae）、茄科（Solanaceae）、禾本科（Poaceae）、唇形科（Lamiaceae）、薔薇科（Rosaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、十字花科（Brassicaceae）、?？疲∕oraceae）。23種屬分別是藜屬（Chenopodium L.）、苜蓿屬（Medicago L.）、蒿屬（Artemisia L.）、向日葵屬（Helianthus L.）、驢食豆屬（Onobrychis L.）、大麻屬（Cannabis L.）、莧屬（Amaranthus L.）、棉屬（Gossypium L.）、薊屬（Cirsium L.）、萹蓄屬（Polygonum L.）、茄屬（Solanum L.）、玉蜀黍?qū)伲╖ea L.）、甘草屬（Glycyrrhiza L.）、百里香屬（Thymus L.）、酸模屬（Rumex L.）、毛莓草屬（Sibbaldianthe L.）、大戟屬（Euphorbia L.）、天仙子屬（Hyoscyamus L.）、錦葵屬（Malva L.）、車軸草屬（Trifolium L.）、蕓薹屬（Brassica L.）、桑屬（Morus L.）、漏蘆屬（Rhaponticum L.）。它們?cè)谒袠悠分锌傂蛄袛?shù)為350，542條，占全部序列的74.99%，在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的最高一致度（Identity）均為99%以上。

測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藜屬和苜蓿屬是源于灘羊糞便中最主要的牧草類別，RRA分別為31.5%和26.9%。此外，蒿屬也在灘羊糞便中占有較高的比例，RRA為17.4%。同時(shí)，向日葵屬、驢食豆屬、大麻屬、莧屬等在灘羊糞便中占了較小的比例。各食物類別的FO和RRA存在顯著差異。圖3是舍飼組（F）、限時(shí)放牧補(bǔ)飼組（GF）和放牧組（G）灘羊糞便中的植物組成結(jié)果?？梢钥闯?，與舍飼組相較而言，放牧組的植物物種構(gòu)成更為簡(jiǎn)單。

3 討論與結(jié)論

3.1 ITS2片段用于物種鑒定

得益于分子生物學(xué)研究的進(jìn)步，目前基于糞便DNA獲悉食物組成已成為食性研究領(lǐng)域的主流方法^［35-36］。本研究使用植物ITS2基因作為識(shí)別植物物種的條形碼，共鑒定出28個(gè)植物類群（0.1%以上）。其中27個(gè)鑒定到物種水平，種水平鑒定成功率達(dá)到96%。僅鑒定到屬的1個(gè)類別為蒿屬，猜測(cè)該條形碼在蒿屬中的種間差異較小，物種分辨度有限，與在我國(guó)典型草原開(kāi)展的蒙古綿羊食性鑒定研究結(jié)果類似^［31］。說(shuō)明本研究所用的ITS2區(qū)域通用引物rD5-ITS2/rb1-ITS2f并不是對(duì)所有植物類群都有效，因此需要對(duì)引物是否充分覆蓋研究區(qū)域潛在攝食物種進(jìn)行深入研究。

豆禾混播草地主要組分為紫花苜蓿、草地雀麥和草地早熟禾。紫花苜蓿序列在灘羊糞便中的相對(duì)豐度為26.9%，位居第二，然而兩種禾本科牧草并沒(méi)有成功鑒定出來(lái)。原因可能是存在基因優(yōu)先擴(kuò)增現(xiàn)象，非禾本科植物更容易被優(yōu)先擴(kuò)增^［30］。本次研究中禾本科鑒定成功率較低的另一個(gè)原因可能是糞便樣品保存不當(dāng)引起的DNA降解。目前最新的基于糞便DNA的動(dòng)物食性研究中，多采用兩步法進(jìn)行樣品保存，即采集的新鮮糞便先經(jīng)無(wú)水乙醇浸泡24 h，再加入硅膠置于-20℃保存^［37-38］。經(jīng)兩步法處理后，能從糞便中獲取更高濃度的DNA，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中的成功率也更高^［39］。本研究采集的新鮮糞便樣品直接置于-20℃低溫保存，可能一定程度上會(huì)影響DNA提取和目標(biāo)條帶的擴(kuò)增效果，導(dǎo)致鑒定成功率降低。綜合目前研究，如需對(duì)家畜所采食種類進(jìn)行更精確的判定，一方面通過(guò)優(yōu)化保存方法避免樣品降解，另一方面需要考慮引入其他引物進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增及測(cè)序分析。此外，條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)物種序列信息的完備程度也將影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 采食組成

以往關(guān)于動(dòng)物尤其食肉動(dòng)物的食性研究報(bào)道中，通常用應(yīng)用食物出現(xiàn)頻率FO這一指標(biāo)來(lái)定性描述動(dòng)物的食性構(gòu)成。本研究結(jié)果顯示，利用食物出現(xiàn)頻率FO和相對(duì)序列豐度RRA得到的食性結(jié)果差異較為明顯（表3和表4）。比如，桑屬植物其FO高達(dá)80.0%，而RRA僅為0.1%。這是由于FO反映的是某一食物組分出現(xiàn)的頻次，因此會(huì)增加生物量貢獻(xiàn)較低的食物類別所占的比例。而RRA利用食物擴(kuò)增序列數(shù)與原始生物量組成相關(guān)的關(guān)系，反映了相對(duì)生物量，更加接近食物的實(shí)際生物量，對(duì)高通量食性分析提供了更多信息，潛在應(yīng)用價(jià)值更大。

然而，從我們的研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，利用RRA描述家畜的食物組成存在一定誤差。就舍飼組而言，根據(jù)其日糧配方可知，苜蓿（苜蓿干草和苜蓿草粉）所占比例為35.0%，而通過(guò)高通量測(cè)序獲得的相對(duì)比例為25.5%，低估了9.5%。玉米（玉米秸稈和玉米顆粒）所占比例為40.25%，而測(cè)序后的相對(duì)比例僅為0.5%，低估了39.75%。分析原因，除了動(dòng)物本身對(duì)不同屬種牧草的消化率存在差異外，還有一個(gè)誤差可能是因?yàn)镮TS2條形碼的通用引物對(duì)于不同類群的牧草擴(kuò)增效率不同。本研究團(tuán)隊(duì)之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，ITS2基因的通用引物更傾向于擴(kuò)增非禾本科植物，從而會(huì)導(dǎo)致禾本科植物的相對(duì)比例被低估。建議可以從兩個(gè)方面繼續(xù)開(kāi)展研究：首先，通過(guò)飼喂控制試驗(yàn)構(gòu)建定量校正模型，對(duì)目標(biāo)牧草類群的估測(cè)比例進(jìn)行二次校正，對(duì)采食組分估測(cè)結(jié)果加以修正完善。另外有研究證明，相比于單基因片段，復(fù)合條形碼組合能夠明顯提高物種的鑒別效果。因此，可以通過(guò)引入組合條形碼，例如ITS2 + trnH-psbA，matK + rbcL，提高對(duì)禾本科植物的鑒別效率。但是要面臨測(cè)序成本增加、測(cè)序數(shù)據(jù)更加復(fù)雜的挑戰(zhàn)。

綜上，本研究初步利用基于核基因ITS2片段的糞便DNA宏條形碼技術(shù)，對(duì)放牧灘羊的糞便進(jìn)行高通量分子食性分析，表明該條形碼的物種分辨率高達(dá)96%，且驗(yàn)證紫花苜蓿是灘羊的主要食物來(lái)源之一。未來(lái)可結(jié)合飽和烷烴法等經(jīng)典方法，對(duì)測(cè)序結(jié)果加以分析與校正，為糞便DNA宏條形碼技術(shù)在家畜食性鑒定中的應(yīng)用提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）