文章編號(hào)：1005-5630（2024）05-0017-07 DOI：10.3969/j.issn.1005-5630.202310180118

摘要：近年來(lái)胰腺癌的高發(fā)病率與高致死率引起了人們的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有的檢測(cè)手段成本高昂且操作復(fù)雜，難以推廣應(yīng)用至社區(qū)家庭中。而成本較低的傳統(tǒng)的免疫層析試紙條難以有效檢測(cè)血液樣本中的標(biāo)志物。為此，研究設(shè)計(jì)了一種針對(duì)腫瘤標(biāo)志物CA199的微流控?免疫層析試紙條復(fù)合結(jié)構(gòu)，借助光學(xué)顯微鏡，通過(guò)芯片實(shí)驗(yàn)觀察到微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)可以有效分離血液樣本中的紅細(xì)胞，并不會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。利用透射電子顯微鏡與多功能酶標(biāo)儀分析了量子點(diǎn)熒光納米微球的物理特性，表明其具有良好的穩(wěn)定性與分散性。與未經(jīng)濾紅樣本的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示了濾紅結(jié)構(gòu)對(duì)于血液樣本中CA199熒光信號(hào)的增強(qiáng)作用，系統(tǒng)檢測(cè)限為4.2 U/mL。微流控?免疫層析試紙條成本低廉，操作簡(jiǎn)單且安全穩(wěn)定，為胰腺癌的家庭化篩查提供了一種新的思路。

關(guān)鍵詞：微流控芯片；免疫層析技術(shù)；腫瘤標(biāo)志物；胰腺癌

中圖分類號(hào)：TB 39文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Home-based pancreatic adenocarcinoma test chip based on microfluidic chip and immunofluorescence chromatography

CHEN Jingwei，ZHENG Lulu

（School of Optical-Electrical and Computer Engineering，University of Shanghai for Science andTechnology，Shanghai 200093，China）

Abstract：The high incidence and mortality of pancreatic adenocarcinoma have attracted widespread attention in recent years.However，the existing detection methods are costly and complex to operate，which makes it difficult to extend their use to households in the community.On the other hand，the lower-cost traditional immunochromatographic test strips are difficult to detect the markers in blood samples effectively.A microfluidic-immunochromatographic test strip for tumor marker CA199 was designed.With the aid of the optical microscope，the microarray structure could effectively separate red blood cells in sample solution without destroying the cellular structure.The physical properties of the quantum dot fluorescent microspheres were analyzed by a transmission electron microscope and a multifunctional enzyme marker.The studyshows that the quantum dot fluorescent microspheres have good stability and dispersity.By comparison with unfiltered samples，the enhancement of microfluidic structures for CA199 fluorescent signals in samples was demonstrated.The detection limit of the system is 4.2 U/mL.The microfluidic-immunochromatographic test strips are low-cost，simple-to-operate，safe and stable.It provides a new strategy for home-based screening for pancreatic adenocarcinoma.

Keywords：microfluidicchip;immunochromatography;tumor marker;pancreatic adenocarcinoma

引言

胰腺癌作為21世紀(jì)消化道中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的三大原因之一[1]。在中國(guó)，胰腺癌發(fā)病率位居惡性腫瘤前十。根據(jù)《柳葉刀》雜志相關(guān)報(bào)道，胰腺癌確診后五年內(nèi)的生存率約為十分之一[2]。為此，開(kāi)展大面積的人口篩查與防治工作便尤為重要。

迄今為止，常見(jiàn)的胰腺癌檢測(cè)方法如超聲、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）與磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）在臨床診斷上表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確性[3]，但受高昂的檢測(cè)費(fèi)用以及復(fù)雜繁瑣的檢驗(yàn)流程限制難以推廣至社區(qū)家庭。此外，由于需專業(yè)人員操控設(shè)備與分析結(jié)果，患者往往不能在第一時(shí)間拿到檢測(cè)結(jié)果，在篩查進(jìn)程中占用很大的時(shí)間成本。

CA199作為一種與胰腺癌密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物[4]，對(duì)胰腺癌敏感性最高。其存在于胰、胃、肺等組織結(jié)構(gòu)中[5]。在外周血液中，CA199濃度在37 U/mL以下浮動(dòng)變化。另一方面，CA199在胰腺癌的診斷上有較高的特異性，在鑒別良性與惡性病變方面表現(xiàn)良好[6]。

免疫層析試紙條可利用免疫學(xué)原理，通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)和鑒定樣本中的目標(biāo)標(biāo)志物[7]。其較低的檢測(cè)成本與快速便攜的特點(diǎn)，使得面向家庭的篩查成為可能。此外，借助量子點(diǎn)熒光納米微球作為熒光探針標(biāo)記腫瘤標(biāo)志物，可以使得免疫層析試紙條的結(jié)果檢測(cè)將不再依賴于大型且專業(yè)的檢測(cè)設(shè)備[8]。

然而，由于免疫層析試紙條容易受到復(fù)雜的體液樣本基質(zhì)干擾，尤其是全血樣本中的紅細(xì)胞會(huì)將紙基材料染成紅色，強(qiáng)烈的可見(jiàn)干擾致使檢測(cè)結(jié)果存在較大的誤差[9]。此外，血液中的黃疸、溶血酶等物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光[10]，降低傳感信號(hào)質(zhì)量，嚴(yán)重影響檢測(cè)靈敏度。因此對(duì)于全血檢測(cè)，有必要在液體到達(dá)免疫層析試紙條中的檢測(cè)區(qū)域之前從全血樣本基質(zhì)中去除紅細(xì)胞。從全血中分離血漿的傳統(tǒng)方法，如離心、電滲流、介電泳和磁相互作用等[11]，只能在配備精密儀器與專業(yè)人員的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，無(wú)法滿足全血即時(shí)檢測(cè)的需求。

微流控芯片又被稱為微全分析系統(tǒng)，可以將生物、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)集成在芯片上實(shí)現(xiàn)微流體操縱[12-13]。由于其設(shè)計(jì)靈活且結(jié)構(gòu)精細(xì)，在細(xì)胞分選、化學(xué)分析與檢測(cè)領(lǐng)域微流控芯片有極大的發(fā)揮空間。因此，基于微流控芯片設(shè)計(jì)的微陣列過(guò)濾結(jié)構(gòu)[14-16]，不僅可以物理隔離樣本中的紅細(xì)胞，且不影響紅細(xì)胞狀態(tài)，從而避免了溶血的發(fā)生。

本研究設(shè)計(jì)了一種新型的微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)用于濾除血液樣本中的紅細(xì)胞，并與免疫層析試紙條相結(jié)合，可有效識(shí)別量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記的CA199檢測(cè)抗體。表征驗(yàn)證了量子點(diǎn)熒光納米微球的穩(wěn)定性與特異性，并進(jìn)一步分析了微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用效果，為胰腺癌的家庭化篩查提供了一種全新的策略。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)中所用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)于中國(guó)北京索萊寶公司。三甲基氯硅烷、N?羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽（磺基-NHS）與1?乙基?3?（3?二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1?ethyl?3?（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）購(gòu)置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。磷酸鹽緩沖溶液（peptonebuffered sbolution，PBS）購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司。量子點(diǎn)熒光納米微球?625由珈源量子點(diǎn)提供。樣品墊與結(jié)合墊購(gòu)于上海杰一生物技術(shù)有限公司，吸水墊與PVC底板由南京微測(cè)生物科技有限公司提供，硝酸纖維素膜購(gòu)于上海賽多利斯公司。

實(shí)驗(yàn)中所用的主要儀器有蘇斯MJB4光刻機(jī)（德國(guó)），Millipore超純系統(tǒng)（德國(guó)），Beckman Coulter高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)），超聲波儀器（中國(guó)），Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士）。

1.2微流控芯片制備

微流控芯片設(shè)計(jì)基于AutoCAD軟件完成。硅片經(jīng)前烘后，使用光刻機(jī)進(jìn)行曝光。曝光后經(jīng)后烘、顯影流程完成對(duì)硅片圖案化處理。使用三甲基氯硅烷對(duì)硅片表面進(jìn)行修飾，將聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）預(yù)聚物溶液灌注至硅片表面，置于真空箱內(nèi)充分排出預(yù)聚物中氣泡，后轉(zhuǎn)移至烘干箱中完成固化定型。剝離并切割所需PDMS芯片，將切割好的芯片結(jié)構(gòu)置于異丙醇溶液中浸泡去除殘留的三甲基氯硅烷，隨后使用去離子水進(jìn)行超聲清洗。使用直徑4.5 mm的圓沖預(yù)先打孔，使用等離子清洗機(jī)完成微流控芯片與玻璃基板的鍵合。

1.3量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記CA199檢測(cè)抗體

將10μL量子點(diǎn)熒光納米微球分散至MES溶液中，離心后分離上層清液，重新加入MES溶液并進(jìn)行超聲分散。分別配制10 mg/mL的EDC溶液與NHS溶液，加入上述溶液中，充分混合后離心。離心結(jié)束后分離上層清液并加入1 mL抗體稀釋液，與CA199檢測(cè)抗體溶液混合后孵育1.5 h。孵育完成加入20%（質(zhì)量體積比）BSA溶液封閉，再次離心后分離量子點(diǎn)熒光納米微球，并復(fù)溶于含有10%（質(zhì)量體積比）蔗糖、5%海藻糖與1%BSA的混合液中，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4微流控?免疫層析試紙條制備

免疫層析試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、硝酸纖維素膜與PVC底板構(gòu)成。首先將硝酸纖維素膜粘貼在PVC底板上，一端粘貼吸水墊，對(duì)應(yīng)一端粘貼樣品墊與結(jié)合墊。預(yù)先配制好含有0.1%蔗糖的PBS緩沖液稀釋的山羊抗小鼠IgG溶液，使用滑膜噴金標(biāo)機(jī)將上述溶液均勻預(yù)置在硝酸纖維素膜上形成C線，以同樣過(guò)程處理CA199捕獲抗體溶液形成T線。后置于37℃干燥箱中干燥后裁切為寬度均勻的免疫層析試紙條以備使用。將上述免疫層析試紙條插入微流控芯片所預(yù)先裁切留下的插槽中，對(duì)齊使樣品墊與微流控芯片出液口緊密接觸。

1.5交叉反應(yīng)驗(yàn)證

使用同批次免疫層析試紙條分別檢測(cè)同水平下CA199，前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA），甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），糖鏈抗原153（CA153），白細(xì)胞介素?8（interleukin?8，IL?8）與白細(xì)胞介素?10（interleukin?10，IL?10），在365 nm激發(fā)光下記錄檢測(cè)結(jié)果并使用ImageJ軟件完成灰度值分析。

1.6紅細(xì)胞過(guò)濾效果檢驗(yàn)

將稀釋后的老鼠外周血液樣本100μL從入液口加入微流控芯片中，靜置5 min，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察各區(qū)域紅細(xì)胞密度并分析與所通過(guò)條形障礙陣列的數(shù)學(xué)關(guān)系。

1.7微流控芯片對(duì)照實(shí)驗(yàn)

預(yù)先將微流控結(jié)構(gòu)與免疫層析試紙條相結(jié)合，并另取等量免疫層析試紙條作為對(duì)照組。按照0，1 U/mL，2 U/mL，4 U/mL，8 U/mL濃度梯度使用10倍稀釋的血液樣本稀釋CA199抗原。取配制好的上述溶液按照梯度等量滴入對(duì)照組中免疫層析試紙條的樣品墊上，靜置10 min后，在波長(zhǎng)365 nm激發(fā)光下記錄熒光信號(hào)強(qiáng)度。重復(fù)上述步驟，將溶液按梯度滴入微流控-免疫層析試紙條的芯片入液口，10 min后記錄數(shù)據(jù)。使用ImageJ軟件完成灰度值分析。

2結(jié)果與討論

2.1表征分析

使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察量子點(diǎn)熒光納米微球。由圖1可以看出，納米微球由多種量子點(diǎn)納米材料所構(gòu)成，微球的粒徑范圍約為100～200 nm。納米微球在波長(zhǎng)365 nm的激發(fā)光下，可產(chǎn)生波長(zhǎng)625 nm的發(fā)射光（圖2）。為此，量子點(diǎn)熒光納米微球可在紫外光激發(fā)下，觀察到較為明顯的紅光。

此外，標(biāo)記后的納米微球分散性質(zhì)良好，且24 h后無(wú)明顯的顏色或沉淀變化（圖3（a）），說(shuō)明該納米微球懸浮液有較好的膠體穩(wěn)定性。在多批次的量子點(diǎn)熒光納米微球熒光信號(hào)檢測(cè)中，其檢測(cè)信號(hào)發(fā)光效果穩(wěn)定（圖3（b））。多方面證明量子點(diǎn)熒光納米微球可在紫外光下裸眼觀察熒光效果，其穩(wěn)定性良好，可用于免疫層析試紙條的制備。

2.2交叉反應(yīng)

對(duì)于除CA199外不同抗原的結(jié)合位點(diǎn)，CA199捕獲抗體與檢測(cè)抗體表現(xiàn)出良好的特異性結(jié)合效果。如圖4所示，在同濃度下的多種標(biāo)志物溶液中，CA199免疫層析試紙條C線表現(xiàn)出差異性較大且強(qiáng)烈的熒光檢測(cè)信號(hào)，其余樣本溶液中檢測(cè)信號(hào)遠(yuǎn)低于目標(biāo)標(biāo)志物。結(jié)果表明量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記的CA199檢測(cè)抗體不存在明顯的交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于免疫層析試紙條的檢測(cè)。

2.3微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

為防止紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血，致使細(xì)胞中血紅蛋白等溢出，影響抗原抗體非特異性結(jié)合與熒光信號(hào)檢測(cè)，本研究中微流控芯片采用了一種密集排列的條形陣列結(jié)構(gòu)（圖5），陣列間距隨著通道延伸由12μm不斷縮小至8.4μm，采用物理阻隔的方法去除血液樣本中的紅細(xì)胞。此外，由于陣列間距較小，縱橫比高，且微流控芯片整體結(jié)構(gòu)狹窄，毛細(xì)作用力同樣可以促進(jìn)血液樣本向前擴(kuò)散，最終流至與免疫層析試紙條相連接的部分，后續(xù)由吸水墊牽引完成樣本檢測(cè)。

由圖6可以看出，隨著通道的不斷深入，條形陣列對(duì)于紅細(xì)胞的阻隔效果3cec4bc2f60fe060b5afa498c0835631越發(fā)明顯，且未觀察到破損的紅細(xì)胞。經(jīng)過(guò)五道陣列后，紅細(xì)胞基本上已完全去除（圖7），不再觀察到高密度的紅細(xì)胞。微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)可以在5 min內(nèi)完成100μL樣本過(guò)濾且不影響后續(xù)的免疫層析試紙條工作，可以滿足過(guò)濾紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)需求。

2.4微流控芯片?免疫層析試紙條

如圖8和圖9所示，檢測(cè)樣本首先經(jīng)微流控芯片入液口進(jìn)入微流控通道，在毛細(xì)力與壓力作用下，樣本通過(guò)微陣列區(qū)域，紅細(xì)胞由于體積較大難以通過(guò)微流控濾紅結(jié)構(gòu)。在濾除絕大部分紅細(xì)胞后，樣本繼續(xù)前進(jìn)至免疫層析試紙條樣品墊，隨后在結(jié)合墊上，量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記的檢測(cè)抗體與CA199發(fā)生特異性結(jié)合。層析作用下，樣本中標(biāo)記抗體與標(biāo)志物所形成的復(fù)合物被C線上預(yù)置的包被抗體所捕獲，最終形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。在波長(zhǎng)365 nm紫外光照射下，可用肉眼觀察到紅色熒光。若樣本中無(wú)目標(biāo)標(biāo)志物，則C線無(wú)明顯熒光信號(hào)。樣本中剩余的量子點(diǎn)熒光納米微球標(biāo)記的檢測(cè)抗體繼續(xù)前進(jìn)至T線與山羊抗小鼠IgG相結(jié)合，最終可以在T線上觀察到紅色熒光。陽(yáng)性樣本在紫外光照射下最終可在免疫層析試紙條上觀察到兩條明顯的紅色熒光條帶，而陰性樣本僅可觀察到一條熒光條帶。

2.5對(duì)照結(jié)果分析

在免疫層析試紙條與微流控芯片?免疫層析試紙條的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，如圖10（a）所示，對(duì)照組中由于未增加濾紅結(jié)構(gòu)過(guò)濾樣本中的紅細(xì)胞，CA199與抗體結(jié)合效率降低，最終檢測(cè)結(jié)果熒光信號(hào)強(qiáng)度大幅下降。此外，受樣本中紅細(xì)胞影響，免疫層析試紙條的檢測(cè)區(qū)域背景信號(hào)較強(qiáng)，難以區(qū)分有效檢測(cè)信號(hào)。而經(jīng)微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)過(guò)濾后的檢測(cè)樣本（圖10（b）），免疫層析試紙條產(chǎn)生了顯著且強(qiáng)烈的熒光檢測(cè)信號(hào)（圖11）。實(shí)驗(yàn)證明了微流控芯片對(duì)于免疫層析試紙條檢測(cè)結(jié)果有顯著的增強(qiáng)作用。

2.6檢測(cè)限計(jì)算

參照按倍比稀釋的CA199標(biāo)志物濃度所做出的熒光檢測(cè)信號(hào)曲線，使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行Logistic4參數(shù)擬合，擬合曲線如圖12所示。曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，與檢測(cè)結(jié)果吻合良好。

檢測(cè)限又稱檢出限，指的是系統(tǒng)對(duì)所需檢測(cè)樣品所能檢測(cè)出來(lái)的最低濃度或者最小劑量，通常用零濃度下背景強(qiáng)度加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算式為

式中：A，B，C，D為L(zhǎng)ogistic4參數(shù)擬合方程中所用參數(shù)；IBlank與σBlank分別為平均響應(yīng)以及從空白單位收集的背景強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差。

通過(guò)式（1）計(jì)算得出，微流控芯片?免疫層析試紙條對(duì)于CA199的檢測(cè)限為4.2 U/mL，低于臨床檢測(cè)限37 U/mL。檢測(cè)限更低也有助于降低樣本假陽(yáng)性的概率。

3結(jié)論

簡(jiǎn)單高效地構(gòu)建了方便快捷且穩(wěn)定的微流控?免疫層析試紙條，其成本低廉，易于推廣。其中微陣列濾紅結(jié)構(gòu)對(duì)過(guò)濾外周血液樣本中的紅細(xì)胞表現(xiàn)良好，顯著降低了樣本中紅細(xì)胞的密度，且不會(huì)影響紅細(xì)胞形態(tài)，避免了溶血的發(fā)生。量子點(diǎn)納米熒光微球與CA199檢測(cè)抗體結(jié)合所形成的復(fù)合物，仍然保持良好的特異性與穩(wěn)定性，可準(zhǔn)確識(shí)別樣本中的目標(biāo)標(biāo)志物，檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)肉眼在紫外光照下定性判斷。相較于未經(jīng)濾紅的血液樣本，微流控?免疫層析試紙條檢測(cè)出了顯著的熒光信號(hào)，系統(tǒng)檢測(cè)限為4.2 U/mL，低于臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，為早期篩查提供了可能。然而檢測(cè)指標(biāo)單一難以為胰腺癌的診斷提供詳細(xì)且具體的病患情況，與其他標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，將是值得探索且潛力巨大的研究方向。微流控?免疫層析試紙條操作簡(jiǎn)單且便于檢測(cè)，無(wú)需借助專業(yè)的檢測(cè)設(shè)備與工作人員，為胰腺癌普篩的家庭化進(jìn)程提供了新型解決方案。

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（編輯：張磊）