背景：敲減核糖體RNA加工蛋白15（RRP15）可抑制肝細(xì)胞癌（HCC）增殖和生長(zhǎng)，但其與HCC對(duì)索拉非尼敏感性之間的關(guān)系尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。目的：探討RRP15是否參與調(diào)節(jié)HCC對(duì)索拉非尼的敏感性及其可能機(jī)制。方法：采用real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)人肝癌細(xì)胞株中的RRP15表達(dá)。通過(guò)感染敲減或過(guò)表達(dá)慢病毒調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞RRP15表達(dá)水平，以CCK?8實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RRP15表達(dá)改變對(duì)肝癌細(xì)胞索拉非尼敏感性的影響；通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、Fe2+、脂質(zhì)過(guò)氧化物、還原型谷胱甘肽等鐵死亡標(biāo)志物水平探究RRP15表達(dá)改變對(duì)鐵死亡的影響。以鐵死亡抑制劑Ferrostatin?1聯(lián)合敲減RRP15驗(yàn)證RRP15對(duì)索拉非尼敏感性和鐵死亡的調(diào)節(jié)作用。以裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確RRP15表達(dá)與索拉非尼敏感性的關(guān)系。結(jié)果：索拉非尼能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞RRP15表達(dá)上調(diào)。肝癌細(xì)胞的RRP15表達(dá)水平與其對(duì)索拉非尼的敏感性呈負(fù)相關(guān)，敲減RRP15可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性和索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡，表現(xiàn)為肝癌細(xì)胞活性和集落形成能力進(jìn)一步降低，細(xì)胞內(nèi)ROS、Fe2+和脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，F(xiàn)errostatin?1處理則能有效逆轉(zhuǎn)敲減RRP15的上述作用。機(jī)制研究表明敲減RRP15系通過(guò)抑制p62?KEAP1?NRF2信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡和索拉非尼增敏。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明敲減RRP15聯(lián)合索拉非尼處理能更有效地抑制裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)。結(jié)論：抑制RRP15可增強(qiáng)HCC對(duì)索拉非尼的敏感性，其機(jī)制可能與促進(jìn)鐵死亡相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)可能為提高HCC患者對(duì)索拉非尼的治療反應(yīng)提供了一種新的策略。

關(guān)鍵詞 核糖體RNA加工蛋白15； 癌，肝細(xì)胞； 索拉非尼； 鐵死亡

RRP15 Regulates Sensitivity of Hepatocellular Carcinoma to Sorafenib Through Ferroptosis ZHAO Saili1， WANG Zhangding2， WANG Fenglan2， WANG Lei2， ZHANG Bin2， ZOU Xiaoping1，2，3. 1Department of Gastroenterology， Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College， Xuzhou Medical University， Nanjing （210008）; 2Department of Gastroenterology， Nanjing Drum Tower Hospital， the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing; 3Department of Gastroenter?ology， Taikang Xianlin Drum Tower Hospital， the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School， Nanjing

Correspondence to： ZOU Xiaoping， Email： zouxiaoping795@hotmail.com

Background： Knockdown of ribosomal RNA processing 15 homolog （RRP15） inhibited the proliferation and growth of hepatocellular carcinoma （HCC）， but its relationship with the sensitivity of HCC to sorafenib has not been reported. Aims： To elucidate the role of RRP15 in modulating the sensitivity of HCC to sorafenib and to unravel the underlying mechanisms. Methods： The constitutive expression of RRP15 in human HCC cell lines was assessed using real?time PCR and Western blotting， and then manipulated via infection with either RRP15 knockdown or overexpression lentivirus. The impact of RRP15 expression on sorafenib sensitivity of HCC cells was investigated by CCK?8 and colony formation assays. Changes in ferroptosis markers， including reactive oxygen species （ROS）， Fe2+， lipid peroxide， reduced glutathione， etc in HCC cells were measured to determine the effect of RRP15 on ferroptosis. The combination of the ferroptosis inhibitor Ferrostatin?1 and RRP15 knockdown was used to verify the modulatory effect of RRP15 on sorafenib sensitivity and ferroptosis. Furthermore， xenograft tumor in nude mice was used to confirm the relationship between RRP15 and sorafenib sensitivity. Results： Sorafenib treatment induced RRP15 expression in HCC cells. The expression levels of RRP15 in HCC cells were negatively associated with the sensitivity to sorafenib. RRP15 knockdown enhanced the sorafenib sensitivity and sorafenib?induced ferroptosis in HCC cells， presenting as reduced cell viability， decreased colony formation ability， and increased intracellular ROS， Fe2+， and lipid peroxidation. Treatment with Ferrostatin?1 effectively compromised the increased ferroptosis and sorafenib sensitivity caused by RRP15 downregulation. Mechanistically， inactivation of p62?KEAP1?NRF2 pathway was involved in the RRP15 depletion?mediated ferroptosis and sorafenib sensitization in HCC cells. In in vivo study， RRP15 knockdown combined with sorafenib treatment notably inhibited the subcutaneous xenograft tumor growth in nude mice. Conclusions： This study demonstrates that inhibition of RRP15 significantly enhances the sensitivity of HCC to sorafenib， potentially through the promotion of ferroptosis. These findings may provide new strategies for improving the therapeutic response of HCC to sorafenib treatment.

Key words Ribosomal RNA Processing 15 Homolog; Carcinoma， Hepatocellular; Sorafenib; Ferroptosis

肝癌是威脅人類健康的重要疾病，其發(fā)病率和病死率在全球癌癥統(tǒng)計(jì)中分居第6和第3位[1]。肝癌患者早期癥狀不明顯，確診時(shí)多已處于中晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，如不予積極治療，自然生存期僅3～4個(gè)月[2]。多激酶抑制劑索拉非尼（sorafenib）作為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）的經(jīng)典分子靶向藥物，目前已廣泛應(yīng)用于臨床，然而患者在使用索拉非尼約6個(gè)月后常出現(xiàn)耐藥性[3]，從而嚴(yán)重限制了進(jìn)展期HCC患者的治療效果。

核糖體RNA加工蛋白15（ribosomal RNA pro?cessing 15 homolog， RRP15）是一種參與核糖體生物合成、核糖體RNA轉(zhuǎn)錄、核糖體應(yīng)激、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控的多功能核仁蛋白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RRP15在HCC中高表達(dá)，并與腫瘤的惡性生物學(xué)行為和預(yù)后不良顯著相關(guān)；敲減RRP15可通過(guò)核糖體應(yīng)激或糖代謝重構(gòu)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡或衰老，抑制HCC增殖和生長(zhǎng)[4?5]。近期本課題組又發(fā)現(xiàn)RRP15在胰腺癌中高表達(dá)，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良顯著相關(guān)；敲減RRP15可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能抑制胰腺癌細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)自噬性死亡[6]。國(guó)內(nèi)兩個(gè)團(tuán)隊(duì)也先后獨(dú)立報(bào)道了RRP15在結(jié)直腸癌中高表達(dá)并與腫瘤TNM分期和預(yù)后不良相關(guān)，敲減RRP15可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、遷移、侵襲能力以及上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7?8]。最近還有研究[9]發(fā)現(xiàn)，RRP15可通過(guò)激活PATZ1相關(guān)LAMC2/ITGB4/FAK信號(hào)通路促進(jìn)HCC遷移。上述研究結(jié)果表明RRP15可能是一個(gè)新的癌基因，參與促進(jìn)腫瘤增殖、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而，關(guān)于RRP15是否參與調(diào)節(jié)HCC對(duì)索拉非尼的敏感性及其可能機(jī)制，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究對(duì)該問(wèn)題進(jìn)行探討，以期為增強(qiáng)HCC對(duì)索拉非尼的敏感性提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

人肝癌細(xì)胞株Huh7、Hep3B、PLC5、HepG2均由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)行細(xì)胞傳代處理。4～5周齡雄性BALB/c nude裸鼠購(gòu)自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司。

敲減慢病毒和過(guò)表達(dá)慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，RRP15 shRNA敲減慢病毒序列sh1： GGG AUG GAU GGA AGU ACA ATT; sh2： GGA AAG UGA UGG GCC AGA UTT。TRIzol 試劑（Invitrogen， Thermo Fisher Scientific）；HiScript Q RT SuperMix、ChamQ SYBR qPCR Master Mix、CCK?8試劑（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；活性氧（reactive oxygen species， ROS）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；亞鐵離子含量檢測(cè)試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）含量檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物檢測(cè)試劑盒[東仁化學(xué)科技（上海）有限公司]；丙二醛（malondialdehyde， MDA）測(cè)試盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；鐵死亡抑制劑Ferrostatin?1（MedChemExpress LLC）；RRP15抗體（Sigma?Aldrich， Merck KGaA）；p62抗體（杭州景杰生物科技股份有限公司）；Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch?like ECH?associated protein 1， KEAP1）、鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain 1， FTH1）抗體（愛(ài)博泰克生物科技有限公司）；核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2?related factor 2， NRF2）抗體（Thermo Fisher Scientific）；β?actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

二、方法

1. 公共數(shù)據(jù)庫(kù)信息分析：從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus， GEO; https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）GSE192771數(shù)據(jù)集中提取人肝癌細(xì)胞株RRP15 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2. 慢病毒感染：Huh7或PLC5細(xì)胞接種于6孔板，24 h后細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%，根據(jù)相應(yīng)試劑說(shuō)明書感染RRP15敲減慢病毒或過(guò)表達(dá)慢病毒，24 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3. Real?time PCR：TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度；參照試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行real?time PCR擴(kuò)增，PCR引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。β?actin（內(nèi)參）引物： F 5′?AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT?3′， R 5′?GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT?3′; RRP15引物： F 5′?CTG GGC AGA TGC TAT GGC TAA A?3′， R 5′?GGA CAA CAT CTG GCT TTA CTC TG?3′。2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：PBS洗滌細(xì)胞，加入RIPA裂解液，研磨、離心后將上清液移入新EP管中，BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品定至同一濃度。使用SDS?PAGE膠以90 V 30 min， 120 V 45 min分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)200 mA 120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h后洗膜，一抗4 ℃孵育過(guò)夜；次日充分洗滌后二抗室溫孵育2 h，再次洗滌后以ECL發(fā)光液處理，電荷耦合器件（CCD）成像儀成像，ImageJ軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

5. 半數(shù)抑制濃度（IC50）測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以3 000個(gè)/孔接種于96孔板，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；次日以不同濃度索拉非尼處理細(xì)胞，48 h后棄上清液，加入CCK?8工作液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；分光光度計(jì)測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

6. 集落形成實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以1 000個(gè)/孔接種于6孔板，次日以指定濃度索拉非尼處理細(xì)胞；14 d后細(xì)胞形成集落，以甲醇固定細(xì)胞15 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞成像系統(tǒng)采集圖像。

7. 鐵死亡標(biāo)志物檢測(cè)：將細(xì)胞接種于6孔板，次日以指定濃度索拉非尼處理細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，使用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、Fe2+、脂質(zhì)過(guò)氧化物、還原型GSH、MDA含量。

8. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵守南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物倫理要求。12只4～5周齡雄性裸鼠于恒溫37 ℃、通風(fēng)良好、潔凈的環(huán)境中適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。每只裸鼠皮下注射2×106 Huh7細(xì)胞，每3～4 d測(cè)量1次腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積[V=（W2×L）/2，W為短徑，L為長(zhǎng)徑]。待腫瘤體積達(dá)到50 mm3時(shí)，予30 mg·kg－1·d－1索拉非尼灌胃處理14 d。1個(gè)月后斷頸處死動(dòng)物，取出皮下腫瘤并測(cè)量體積。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。應(yīng)用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s描述，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞RRP15表達(dá)上調(diào)

對(duì)提取自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE192771數(shù)據(jù)集的RRP15 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示經(jīng)索拉非尼處理的人肝癌細(xì)胞株中RRP15 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（圖1A）。為驗(yàn)證這一結(jié)果，本研究使用不同濃度的索拉非尼處理人肝癌細(xì)胞株Huh7 48 h，以real?time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RRP15表達(dá)變化，結(jié)果證實(shí)RRP15 mRNA（圖1B）和蛋白（圖1C、1D）表達(dá)均顯著上調(diào)。

二、RRP15調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性

為了探究肝癌細(xì)胞中的RRP15表達(dá)是否與其對(duì)索拉非尼的敏感性相關(guān)，本研究首先使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了多株人肝癌細(xì)胞株（Huh7、Hep3B、PLC5、HepG2）中的RRP15蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示HepG2、Hep3B細(xì)胞RRP15蛋白表達(dá)水平較高，Huh7、PLC5細(xì)胞RRP15蛋白表達(dá)水平較低（圖2A）。進(jìn)一步使用CCK?8實(shí)驗(yàn)測(cè)定索拉非尼對(duì)不同肝癌細(xì)胞的IC50以評(píng)估藥物敏感性，結(jié)果顯示RRP15高表達(dá)的HepG2、Hep3B細(xì)胞IC50分別為11 μmol/L和17 μmol/L，而RRP15低表達(dá)的Huh7、PLC5細(xì)胞IC50分別為6.5 μmol/L和5.83 μmol/L（圖2B），選擇索拉非尼敏感的Huh7、PLC5細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK?8實(shí)驗(yàn)還表明，敲減RRP15和索拉非尼處理均可抑制肝癌細(xì)胞活性，兩者聯(lián)用抑制作用更為顯著（圖2C）。集落形成實(shí)驗(yàn)表明敲減RRP15可增強(qiáng)索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞集落形成能力的抑制作用（圖2D）；相反，過(guò)表達(dá)RRP15則可逆轉(zhuǎn)索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用（圖2E）。上述結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞的RRP15表達(dá)水平與其對(duì)索拉非尼的敏感性呈負(fù)相關(guān)，抑制RRP15表達(dá)可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。

三、RRP15通過(guò)鐵死亡調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性

有研究[10]顯示，相較于索拉非尼激酶抑制活性的促凋亡效應(yīng)，其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鐵死亡的效應(yīng)更為顯著，由此推測(cè)RRP15可能通過(guò)鐵死亡調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，與未予任何處理的對(duì)照組相比，單純索拉非尼處理組Huh7細(xì)胞內(nèi)FITC?A標(biāo)記的ROS熒光強(qiáng)度、脂質(zhì)過(guò)氧化物熒光強(qiáng)度和Fe2+水平升高（圖3A?3C），還原型GSH水平降低（圖3D），MDA產(chǎn)生增加（圖3E）；以相同濃度索拉非尼處理，敲減RRP15后，細(xì)胞內(nèi)ROS、Fe2+、脂質(zhì)過(guò)氧化物、MDA水平較單純索拉非尼處理組進(jìn)一步升高（圖3A?3C、3E），還原型GSH水平進(jìn)一步降低（圖3D）。相反，在PLC5細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RRP15并使用索拉非尼處理，與單純索拉非尼處理組相比，細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平降低（圖3F）、還原型GSH水平升高（圖3G）、MDA產(chǎn)生減少（圖3H）。上述結(jié)果表明，抑制RRP15表達(dá)可增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡，而過(guò)表達(dá)RRP15則能減輕索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡。

四、鐵死亡抑制劑Ferrostatin?1逆轉(zhuǎn)敲減RRP15誘導(dǎo)的索拉非尼敏感性增加

在Huh7細(xì)胞中敲減RRP15后，予索拉非尼單獨(dú)或與Ferrostatin?1聯(lián)合處理細(xì)胞48 h，CCK?8實(shí)驗(yàn)表明加入Ferrostatin?1后，細(xì)胞死亡受到明顯抑制，存活率較敲減RRP15僅聯(lián)合索拉非尼處理組明顯升高（Plt;0.001；圖4A）。進(jìn)一步檢測(cè)各組鐵死亡相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示Ferrostatin?1的加入可使細(xì)胞內(nèi)MDA、Fe2+水平降低（P均lt;0.001；圖4B、4C），還原型GSH水平升高（P均lt;0.001；圖4D）。上述結(jié)果提示抑制鐵死亡能有效抑制由敲減RRP15誘導(dǎo)的索拉非尼敏感性增加，并進(jìn)一步證實(shí)抑制RRP15表達(dá)系通過(guò)促進(jìn)鐵死亡進(jìn)程增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。

五、RRP15通過(guò)p62?KEAP1?NRF2信號(hào)通路調(diào)節(jié)鐵死亡

有研究[11]表明，p62?KEAP1?NRF2信號(hào)通路在鐵死亡調(diào)控過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。為驗(yàn)證RRP15是否系通過(guò)該通路影響肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，本研究在敲減RRP15聯(lián)合索拉非尼處理的Huh7細(xì)胞中檢測(cè)了該信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，索拉非尼單獨(dú)處理可抑制p62表達(dá)，從而誘導(dǎo)KEAP1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而下調(diào)NRF2和FTH1表達(dá)，聯(lián)合敲減RRP15時(shí)，上述蛋白表達(dá)變化更為顯著（圖5A）。相反，在PLC5細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RRP15并聯(lián)合索拉非尼處理，與單獨(dú)索拉非尼處理組相比，p62表達(dá)上調(diào)，KEAP1表達(dá)下調(diào)，NRF2、FTH1表達(dá)上調(diào)（圖5B）。上述結(jié)果表明抑制RRP15表達(dá)可通過(guò)抑制p62?KEAP1?NRF2信號(hào)通路誘導(dǎo)鐵死亡，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。

六、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲減RRP15可增強(qiáng)索拉非尼的抗肝癌效果

將經(jīng)不同處理的Huh7細(xì)胞接種至裸鼠皮下構(gòu)建異種移植瘤模型，結(jié)果顯示，與僅予對(duì)照shRNA處理相比，無(wú)論是敲減RRP15還是索拉非尼灌胃處理均可抑制移植瘤生長(zhǎng)，兩者聯(lián)合使用抑制作用更明顯（圖6），在體內(nèi)水平證明抑制RRP15表達(dá)能顯著增強(qiáng)肝癌對(duì)索拉非尼治療的敏感性。

lt;F：＼排版文件＼胃腸病學(xué)＼胃腸病學(xué)2024年＼胃腸病學(xué)202402期＼趙賽利-5.tifgt;

注：RRP15為核糖體RNA加工蛋白15；KEAP1為Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1；NRF2為核因子E2相關(guān)因子2；FTH1為鐵蛋白重鏈1；β?actin為β?連環(huán)蛋白

A：敲減RRP15聯(lián)合索拉非尼（5 μmol/L）處理后Huh7細(xì)胞p62?KEAP1?NRF2通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化（蛋白質(zhì)印跡法）；B：過(guò)表達(dá)RRP15聯(lián)合索拉非尼（5 μmol/L）處理后PLC5細(xì)胞p62?KEAP1?NRF2通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化（蛋白質(zhì)印跡法）

圖5 RRP15通過(guò)p62?KEAP1?NRF2信號(hào)通路調(diào)節(jié)鐵死亡

并調(diào)控肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性

討 論

本研究針對(duì)RRP15是否會(huì)影響肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性展開探討，并揭示了RRP15影響肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性的分子機(jī)制，為HCC的治療以及藥物增敏提供了新的理論依據(jù)。索拉非尼作為治療HCC的一線靶向藥物，可有效抑制腫瘤生長(zhǎng)和血管生成，顯著提高了不可切除的進(jìn)展期HCC患者的總生存率[3，12]。盡管索拉非尼已被廣泛應(yīng)用于臨床，但其治療效果短暫，幾乎所有患者均在用藥數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)耐藥性[13]。因此，迫切需要探究導(dǎo)致HCC對(duì)索拉非尼耐藥的影響因素及其分子機(jī)制，以期為提高索拉非尼對(duì)HCC的療效提供理論依據(jù)和應(yīng)對(duì)策略。

鐵死亡是一種鐵代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞程序性死亡方式，與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)，鐵死亡的激活或抑制可能作為調(diào)節(jié)患者對(duì)化療藥物治療反應(yīng)的潛在策略[14]。索拉非尼可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，ROS在線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中過(guò)度積聚，造成細(xì)胞膜氧化性損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡[15]。索拉非尼耐藥也與鐵死亡密切相關(guān)，有研究[11]表明索拉非尼耐藥與p62?KEAP1?NRF2信號(hào)通路激活增加肝癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的抗性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)索拉非尼可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞RRP15表達(dá)上調(diào)，而肝癌細(xì)胞的RRP15本底表達(dá)水平本身又與其對(duì)索拉非尼的敏感性呈負(fù)相關(guān)，由此推測(cè)RRP15可能參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。本研究細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲減RRP15聯(lián)合索拉非尼處理較兩者單用能更有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖能力。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)敲減RRP15系通過(guò)抑制p62?KEAP1?NRF2信號(hào)通路誘導(dǎo)鐵死亡，從而顯著增強(qiáng)索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力。相反，過(guò)表達(dá)RRP15則部分抵消了索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡，進(jìn)而抑制索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力。本研究還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)在體內(nèi)敲減RRP15可顯著增強(qiáng)肝癌對(duì)索拉非尼治療的敏感性，提高藥物的抗腫瘤效果。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了RRP15與HCC索拉非尼耐藥之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明，RRP15與HCC對(duì)索拉非尼耐藥密切相關(guān)，抑制RRP15可增強(qiáng)HCC對(duì)索拉非尼的敏感性，其機(jī)制可能與促進(jìn)鐵死亡相關(guān)。RRP15不僅可作為索拉非尼耐藥性的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)，還有望成為提高耐藥患者對(duì)索拉非尼敏感性的治療靶點(diǎn)，但目前尚缺乏索拉非尼敏感與耐藥HCC患者的RRP15表達(dá)數(shù)據(jù)，RRP15與鐵死亡標(biāo)志物之間的相關(guān)性亦尚未得到驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)可能為提高HCC患者對(duì)索拉非尼的治療反應(yīng)提供了一種新的策略。未來(lái)研究需要更翔實(shí)的體內(nèi)外數(shù)據(jù)驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)，并探索通過(guò)抑制RRP15提高索拉非尼對(duì)HCC患者治療效果的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。此外，考慮到鐵死亡參與了多種類型腫瘤的進(jìn)展和治療應(yīng)答，本研究發(fā)現(xiàn)也可能對(duì)其他類型腫瘤的診治具有借鑒意義。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] SUNG H， FERLAY J， SIEGEL R L， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin， 2021， 71 （3）： 209?249.

[ 2 ] 王耀民，李亞玲. 分子靶向藥物治療肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）， 2023， 44 （6）： 915?924.

[ 3 ] CHENG A L， KANG Y K， CHEN Z， et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia?Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma： a phase Ⅲ randomised， double?blind， placebo?controlled trial[J]. Lancet Oncol， 2009， 10 （1）： 25?34.

[ 4 ] 趙典，張斌，鄒曉平. 核糖體RNA加工蛋白15在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)、功能和臨床意義[J]. 胃腸病學(xué)， 2020， 25 （2）： 70?75.

[ 5 ] ZHAO D， QIAN L， ZHUANG D， et al. Inhibition of ribosomal RNA processing 15 homolog （RRP15）， which is overexpressed in hepatocellular carcinoma， suppresses tumour growth via induction of senescence and apoptosis[J]. Cancer Lett， 2021， 519： 315?327.

[ 6 ] LIANG F， LV Y， QIAO X， et al. Cinchonine?induced cell death in pancreatic cancer cells by downregulating RRP15[J]. Cell Biol Int， 2023， 47 （5）： 907?919.

[ 7 ] DENG Z， XU Y， CAI Y， et al. Inhibition of ribosomal RNA processing 15 homolog （RRP15） suppressed tumor growth， invasion and epithelial to mesenchymal transition （EMT） of colon cancer[J]. Int J Mol Sci， 2023， 24 （4）： 3528.

[ 8 ] DONG Z， LI J， DAI W， et al. RRP15 deficiency induces ribosome stress to inhibit colorectal cancer proliferation and metastasis via LZTS2?mediated β?catenin suppression[J]. Cell Death Dis， 2023， 14 （2）： 89.

[ 9 ] PAN T， LI J， ZHANG O， et al. Knockdown of ribosome RNA processing protein 15 suppresses migration of hepatocellular carcinoma through inhibiting PATZ1?associated LAMC2/FAK pathway[J]. BMC Cancer， 2024， 24 （1）： 334.

[10] LOUANDRE C， EZZOUKHRY Z， GODIN C， et al. Iron?dependent cell death of hepatocellular carcinoma cells exposed to sorafenib[J]. Int J Cancer， 2013， 133 （7）： 1732?1742.

[11] SUN X， OU Z， CHEN R， et al. Activation of the p62?Keap1?NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells[J]. Hepatology， 2016， 63 （1）： 173?184.

[12] VOGEL A， SABOROWSKI A. Current strategies for the treatment of intermediate and advanced hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Treat Rev， 2020， 82： 101946.

[13] LADD A D， DUARTE S， SAHIN I， et al. Mechanisms of drug resistance in HCC[J]. Hepatology， 2024， 79 （4）： 926?940.

[14] WANG Y， WU X， REN Z， et al. Overcoming cancer chemotherapy resistance by the induction of ferroptosis[J]. Drug Resist Updat， 2023， 66： 100916.

[15] WANG C， CHENG X， PENG H， et al. NIR?triggered and ROS?boosted nanoplatform for enhanced chemo/PDT/PTT synergistic therapy of sorafenib in hepatocellular carci?noma[J]. Nanoscale Res Lett， 2022， 17 （1）： 92.

（2024?02?07收稿；2024?02?20修回）

（本文編輯：蔣曉玲）