摘 要：以頂壇花椒花為試驗材料，使用Eclipse E200生物顯微鏡和EM-30 Plus型掃描電鏡對其花樣品進行形態(tài)學(xué)觀察和花粉活力分析，旨在為頂壇花椒雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，頂壇花椒出現(xiàn)雌雄同株的現(xiàn)象，花粉成熟后花藥呈鮮黃色，花粉粒為長球形，表面具細網(wǎng)狀紋飾。不同單株花粉粒直徑存在顯著差異，其中1號單株的花粉粒直徑最大（522.32 μm），3號單株的花粉粒直徑最?。?79.50 μm）?；ǚ鄣臉O軸長、赤道軸長、花粉大小及網(wǎng)孔直徑的平均長度分別為26.76、16.39、442.56和0.81 μm。花粉活力測試結(jié)果表明，1號和2號單株的花粉活力較高，亞歷山大染色率分別為44.37%和48.57%，但植株長勢較弱；5號單株的花粉活力較弱，亞歷山大染色率僅有6.67%，但整個植株長勢正常，無衰弱跡象。研究結(jié)果可為頂壇花椒繁殖策略的制定提供生物學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：頂壇花椒；形態(tài)構(gòu)造；花粉粒大??；花粉活力

中圖分類號：S573+.9 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）10-0118-06

收稿日期：2023-05-10；修回日期：2024-08-21

基金項目：貴州省科技廳中藥現(xiàn)代化項目（黔科合ZY字〔2012〕3002號）；貴州省林業(yè)廳項目（黔林科合2018〔01〕）；貴州省科技廳成果轉(zhuǎn)化項目（黔科合成果〔2019〕4233號）；貴州省科技廳優(yōu)秀青年科技人才項目（黔科合平臺人才[20195643]）；貴州省科技廳科技支撐項目（黔科合支撐〔2021〕222號，黔科合支撐〔2022〕一般118號）

作者簡介：羅 輝，男，高級工程師，主要從事經(jīng)濟林栽培研究。E-mail：785486162@qq.com

通信作者：王 港，男，副研究員，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：417328697@qq.com

Scanning electron microscopic observation and viability test of pollen grains of Zanthoxylum planispinum var. dintanensis

LUO Hui1， ZENG Qinmeng2， LU Zhongke2， HOU Na2， LOU Li2， WANG Gang2

（1. Guizhou Extension Station of Forestry Science and Technology， Guiyang 550001， Guizhou， China; 2. Guizhou Academy of Forestry Sciences， Guiyang 550005， Guizhou， China）

Abstract： The morphological observation and， pollen vitality analysis of the Zanthoxylum planispinum var. dintanensis flower were conducted using an Eclipse E200 biological microscope and an EM-30 Plus scanning electron microscope. This study aimed to provide a scientific basis for the hybrid breeding of Zanthoxylum bungeanum. The results showed that there was a phenomenon of monoecious growth in the Zanthoxylum planispinum var. dintanensis. Upon maturation， the anthers turned bright yellow， and the pollen grains were elongated spheres with fine mesh patterns on the surface. Significant variations were observed among different individual plants， specifically， the pollen grain diameter of No. 1 was the largest（522.32 μm）， while that of No. 3 was the smallest（279.50 μm）. The average length of the polar axis， equatorial axis， pollen size， and mesh diameter of the pollen were 26.76， 16.39， 442.56， and 0.81 μm， respectively. Pollen vitality tests revealed that No. 1 and No. 2 exhibited high vitality， with Alexander staining rate of 44.37% and 48.57%， respectively， although their associated plant growth was relatively weak. Conversely， the pollen vitality of Individual No. 5 was low， with an Alexander staining rate of only 6.67%， while the overall growth of the plant appeared normal with no signs of weakening. These research findings provide a biological basis for understanding the reproductive strategy of the Zanthoxylum planispinum var. dintanensis.

Key words： Zanthoxylum planispinum var. dintanensis; Morphological structure; Pollen size; Pollen vitality

頂壇花椒（Zanthoxylum planispinum var. dintanensis）是竹葉椒（Zanthoxylum planispinum）的一個變種[1]，為蕓香科花椒屬植物，單性花，花序上所有小花均為雌花，無雄花，大多為純雌株。頂壇花椒在貴州當(dāng)?shù)貜V為栽培，已成為重要的經(jīng)濟林木，對當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境修復(fù)發(fā)揮著重要作用[2]。近年來，許多學(xué)者對頂壇花椒開展了深入研究，主要集中在營養(yǎng)元素[3]、生理[4]、土壤養(yǎng)分[5]等領(lǐng)域，但對頂壇花椒花粉活力方面的研究較少?；ǚ凼侵参锏奶赜衅鞴?，是植物種質(zhì)保存、雜交育種及交換的重要材料[6]。不同植物的花粉經(jīng)過演化和發(fā)展形成了獨特的形態(tài)特征，即便是在同一種內(nèi)的花粉，其生活力和形態(tài)也具有多樣性[7]。花粉的形態(tài)特征主要受內(nèi)環(huán)境的影響，通常由基因控制，具有較強的遺傳穩(wěn)定性及保守性[8]，可為系統(tǒng)發(fā)育、識別和植物種類的鑒定提供科學(xué)依據(jù)，并在分類學(xué)及遺傳學(xué)中廣泛應(yīng)用[9]。

無融合生殖是一種特殊的無性繁殖方式，在不經(jīng)過雌雄配子融合的情況下產(chǎn)生種子，并能培育為成熟個體。這種生殖方式能夠使植物的基因型保持不變，從而固定雜種優(yōu)勢，對作物育種具有極其重要的意義。無融合生殖在植物中的表現(xiàn)形式多樣，包括營養(yǎng)的無融合生殖、無融合結(jié)子等類型，其遺傳機制復(fù)雜，受多種途徑調(diào)控[10]?；ń穼僦参锲毡榫哂幸粋€重要的生物學(xué)特性——無融合生殖，即雌性植株不需要經(jīng)過受精，直接由珠心細胞發(fā)育成胚，進而繁殖后代[11]。劉映紅等[12]研究表明，野花椒有正常的花粉，且花粉具有活力；葉萌等[13]對青花椒進行6年的觀察，發(fā)現(xiàn)四川金陽地區(qū)的青花椒均為純雌株，無雄花，而四川峨眉山市、洪雅縣、雅安市雨城區(qū)有極少的藤椒存在雄花；李立新等[14]對花椒進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)由于花椒是無融合生殖方式，因此種群內(nèi)變異較小。Fei等[15]通過細胞學(xué)觀察、分子標(biāo)記以及倍性鑒定等手段，進一步證明了花椒具有無融合生殖特性，并篩選出參與無融合胚胎發(fā)生的候選基因。此外，Wang等[11]對花椒無融合生殖的分子機制提出了新的見解，并基于基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組技術(shù)對花椒屬植物的兩種生物堿的生物合成、無融合生殖及其抗旱特性進行了深入研究。

雌雄同株是指一個植物體上既有雌花又有雄花的現(xiàn)象，雌雄同株的植物可以自花授粉，也可以異花授粉，這種特性在植物繁殖策略中具有一定的優(yōu)勢[16]。筆者在進行頂壇花椒種質(zhì)資源調(diào)查和品種選育的過程中，連續(xù)6年進行觀察，發(fā)現(xiàn)頂壇花椒大多為純雌株，部分頂壇花椒園中存在5%～10%著生雄花的植株，且出現(xiàn)雌雄同株的現(xiàn)象，同時花粉具有活力，這與上述學(xué)者的研究結(jié)果有所不同。鑒于此，筆者連續(xù)2年在頂壇花椒花期采集樣品，采用生物學(xué)顯微鏡、掃描電鏡及TTC染色法對具有代表性的頂壇花椒單株雄花形態(tài)構(gòu)造、花粉形態(tài)指標(biāo)及花粉活力等進行研究，以期為頂壇花椒的發(fā)育生物學(xué)理論及雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于貴州省貞豐縣北盤江鎮(zhèn)，地處珠江水系西江上源北盤江畔，屬喀斯特地貌地區(qū)，海拔550～1470 m，該地區(qū)屬北亞熱帶高原季風(fēng)濕潤氣候，氣候溫和，年均溫16.4 ℃，全年無霜期335 d，雨量充沛，年均降水量1300 mm，雨熱基本同季，年均日照時數(shù)1549 h，年均相對濕度81%，土壤以石灰土為主。

1.2 樣品采集及保存

2021年3月至2022年3月，選擇具有代表性的5株雌雄同株（編號1～5號）頂壇花椒，從樹冠的不同方向采集正處于頂壇花椒盛花期的成熟花朵。將樣品放置于恒溫箱中干燥3 h，散粉后取下花粉，放置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗地頂壇花椒不同單株見圖1，其中1～4號（圖1-A～D）單株的樹齡為12年生，5號（圖1-E）的樹齡為2年生，在連續(xù)兩年的觀察中發(fā)現(xiàn)都有少數(shù)的雄花出現(xiàn)，且均為雌雄同株。1號頂壇花椒的植株長勢較弱，表現(xiàn)出衰弱跡象，2號頂壇花椒一半有雄花，一半無雄花，同時發(fā)現(xiàn)開雄花的枝條長勢比無雄花的枝條長勢弱，3號和4號也出現(xiàn)同樣的情況，但5號頂壇花椒幼株，開完雄花后植株長勢正常。

1.3 研究方法

1.3.1 顯微鏡及掃描電鏡觀察 采用Eclipse E200生物學(xué)顯微鏡對花朵進行形態(tài)觀察。將保存?zhèn)溆玫臉悠酚密浢⑤p微蘸取微量花粉，輕掃于電鏡的固定液中，搖勻，在室溫下固定2 h，再放置于4 ℃冰箱保存。固定好之后，使用0.1 mol·L-1的PB（磷酸）緩沖液清洗3次，每次15 min；依次經(jīng)過不同濃度（φ，后同）的酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）進行脫水，再放置于干燥器皿內(nèi)干燥，將干燥后的樣品在ETD-900M磁控離子濺射儀中噴金30 s左右，置于EM-30 Plus超高分辨率臺式掃描電鏡下，選擇有代表性的視野觀察花粉的形態(tài)特征，隨機選取10?；ǚ圻M行測量。

1.3.2 花粉活力檢測 采用亞歷山大染色法進行花粉活力檢測[17]。使用毛筆將花粉粒輕輕刷到載玻片上，并用滴管滴加亞歷山大染料溶液染色5～10 h，然后在顯微鏡下觀察、統(tǒng)計，原生質(zhì)呈現(xiàn)紅色且花粉壁呈現(xiàn)綠色的花粉具有活力，均呈現(xiàn)綠色的則為無活力或發(fā)育不良花粉。觀察2～3張片子，每片取5個視野，統(tǒng)計花粉活力?；ǚ刍盍?%=紅色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行統(tǒng)計分析，用AutoCAD 2022測量花粉的形態(tài)指標(biāo)，包括極軸長（P）、赤道軸長（E）、極赤比（P/E）和網(wǎng)孔直徑，P×E為花粉的大小；參照《孢粉學(xué)概論》[6]，0.88＜P/E＜1.14為圓球形，1.14≤P/E＜1.33為近長球形，1.33≤P/E＜2.00為長球形，P/E≥2.00為超長球形。利用Origin 2020b軟件進行形態(tài)指標(biāo)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂壇花椒花的形態(tài)構(gòu)造及花粉粒大小

利用Eclipse E200生物顯微鏡對采集的樣品進行觀察，結(jié)果如圖2所示。雌花的花小，花被片一輪，平均直徑為3 mm，淺綠色（圖2-A）；子房上位有明顯的花盤，花盤上著生2個離生心皮組成的雌蕊；子房為淺綠色，外側(cè)向外凸起，且下部內(nèi)側(cè)相貼，呈花瓶狀；花柱為閉合型，平均長620 μm，淺黃綠色，外傾且柱頭二裂（圖2-C）。雄花的大小與雌花相似，花被片一輪，8～10枚，綠色，有退化的雌蕊著生于花被片的內(nèi)側(cè)，6枚，花藥背側(cè)著生，為橢圓形，花粉成熟后的花藥呈鮮黃色，花粉為黃色（圖2-B、2-D～E）。

2.2 頂壇花椒花粉形態(tài)掃描電鏡特征及分析

利用EM-30 Plus型掃描電鏡對頂壇花椒不同單株的花粉形態(tài)進行觀察，結(jié)果如圖3和表1所示。花粉為長球形，偶有特殊的花粉形態(tài)，如圖3-E，花粉的極面觀為3裂的橢圓形，具孔溝，細長，勾線形，表面具有細網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)孔呈不規(guī)則狀。2號和5號單株的極軸長差異較小，顯著高于其他單株，3號單株的極軸長最小，為19.60 μm；1號單株的赤道軸長為18.50 μm，顯著高于其他單株。3號單株的花粉直徑為279.50 μm，顯著小于其他單株；1號單株的花粉直徑最大，為522.32 μm。頂壇花椒5個單株花粉形狀的P/E 值存在顯著差異，但1.33＜P/E＜2.00，均為長球形。5號單株的網(wǎng)孔直徑最大，為1.01 μm，顯著大于其他單株；3號單株的網(wǎng)孔直徑最小，為0.59 μm，顯著小于其他單株。

2.3 頂壇花椒花粉活力檢測

花粉活力是影響經(jīng)濟樹種初始坐果率及產(chǎn)量的重要因素，頂壇花椒5個單株的花粉活力差異顯著。從圖4和圖5可以看出，1號和2號頂壇花椒花粉活力經(jīng)亞歷山大溶液染色后呈紅色的較多，分別為44.37%和48.57%，顯著高于其他單株；5號頂壇花椒花粉亞歷山大溶液染色后呈綠色的較多，花粉活力僅為6.67%。以上結(jié)果說明1號和2號頂壇花椒花粉活力較強，發(fā)育良好，而5號頂壇花椒多為發(fā)育不良或活力較弱的花粉。

3 討論與結(jié)論

在《四川植物志》[18]、《貴州植物志》[19]和《浙江植物志》[20]等各地植物志中均寫到竹葉花椒為單性花，在《福建植物志》[21]、《云南植物志》[22]和《中國植物志》[23]中描述了竹葉花椒的雌花和雄花。頂壇花椒是竹葉花椒的變種，均為無融合生殖；劉映紅等[12]發(fā)現(xiàn)，北京栽培的花椒未找到雄株，也未見雄花，而野花椒為雌雄異株；而葉萌等[13]發(fā)現(xiàn)，栽培的竹葉花椒兩個品種（藤椒和金陽青花椒）為雌花，具有無融合生殖特點，峨眉山市的藤椒園有雄花出現(xiàn)，但未做深入研究。筆者連續(xù)6年觀察到試驗地的頂壇花椒開出大量的“黃花”，且有雌雄同株的現(xiàn)象，這與劉映紅等[12]的研究結(jié)果不一致。通過對頂壇花椒的實地及顯微鏡觀察，并對花粉活力檢測，發(fā)現(xiàn)1號和2號頂壇花椒單株的花粉活力最強，但其植株長勢較弱，特別是1號頂壇花椒單株整株長勢弱，有枯死跡象，而2號頂壇花椒單株左側(cè)的枝條開雄花，右側(cè)的枝條無雄花，發(fā)現(xiàn)無雄花的枝條長勢比開雄花的枝條強，有可能是因為開雄花的枝條養(yǎng)分消耗較多，而無法正常供應(yīng)整個枝條正常生長，導(dǎo)致植株長勢衰弱，3號和4號頂壇花椒也表現(xiàn)出同樣的現(xiàn)象。5號頂壇花椒整株開雄花后，整個植株長勢正常，無衰弱跡象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因為5號頂壇花椒單株是幼株，其生長能力旺盛，養(yǎng)分充足，且開出的雄花花粉活力差，因此開雄花對5號幼株的長勢影響較小。

筆者對不同頂壇花椒單株的花粉形態(tài)指標(biāo)進行測定，極軸長為19.60～30.13 μm，赤道軸長為14.27～18.50 μm，花粉直徑為279.50～522.32 μm，這與劉炳倫[24]研究的花椒屬的形態(tài)特征相似。開雄花的植株會出現(xiàn)植株生長衰弱的現(xiàn)象，但幼株并沒出現(xiàn)這一現(xiàn)象。目前尚不清楚其發(fā)生原因，后續(xù)將進一步觀察頂壇花椒產(chǎn)生雄花的現(xiàn)象是否與環(huán)境有關(guān)，對頂壇花椒雄花現(xiàn)象的深入研究對完善花椒的生殖發(fā)育理論和生產(chǎn)應(yīng)用具有重要價值。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)頂壇花椒出現(xiàn)雌雄同株現(xiàn)象，通過掃描電鏡觀察得出頂壇花椒花粉為長球形，偶有特殊形態(tài)，花粉的極面觀為3裂的橢圓形，表面具有細網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)孔呈不規(guī)則狀。不同頂壇花椒單株的花粉活力存在差異，1號和2號單株的花粉活力較高，但植株長勢較弱；5號單株的花粉活力較弱，但植株正常生長。

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