［摘要］目的探討氫嗎啡酮（HM）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞高爾基體應(yīng)激的影響及其機制。

方法以10 mg/L LPS處理小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系MH-S，構(gòu)建肺泡巨噬細(xì)胞高爾基體應(yīng)激模型。將細(xì)胞隨機分為Control組（A組，正常培養(yǎng)）、LPS組（B組，給予10 mg/L的LPS）、LPS+HM組（C組，給予1 μmol/L HM和10 mg/L LPS）、Nrf2 siRNA+LPS+HM組（D組，Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后給予1 μmol/L HM和10 mg/L LPS）和NC siRNA+LPS+HM組（E組，NC siRNA轉(zhuǎn)染后給予1 μmol/L HM和10 mg/L LPS）。采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素6（IL-6）含量；檢測丙二醛（MDA）含量與超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用Western blot法檢測核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、高爾基體基質(zhì)蛋白130（GM130）、高爾基體蛋白97（Golgin-97）、甘露糖苷酶Ⅱ（Mannosidase Ⅱ）、鈣轉(zhuǎn)運ATP酶2C型成員1（ATP2C1）蛋白表達水平；透射電鏡下觀察細(xì)胞高爾基體形態(tài)學(xué)改變。

結(jié)果與A組比較，B組IL-1β、IL-6、MDA含量顯著升高及Nrf2、HO-1蛋白表達上調(diào)，SOD活性顯著降低及GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白的表達下調(diào)（F=2.33～47.61，P＜0.05）；與B組比較，C組IL-1β、IL-6、MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）；與C組比較，D組IL-1β、IL-6、MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達下調(diào)（P＜0.05）。透射電鏡顯示，C組細(xì)胞高爾基體損傷、空泡化與碎片化較B組減輕；D組細(xì)胞高爾基體損傷、空泡化與碎片化較C組加重。

結(jié)論HM通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞高爾基體應(yīng)激，減輕細(xì)胞炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)。

［關(guān)鍵詞］氫嗎啡酮；脂多糖類；巨噬細(xì)胞，肺泡；高爾基體；氧化性應(yīng)激；血紅素加氧酶-1；小鼠

［中圖分類號］R965

［文獻標(biāo)志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0523-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.135

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240927.1331.002;2024-09-2908：36：49

Effect of hydromorphone on Golgi stress in lipopolysaccharide-attacked mouse alveolar macrophages

LI Shaona， JIA Changxin， WU Xiuyun， ZHU Youzhuang， ZHAO Qin， XU Yexiang

（Department of Anesthesiology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266000， China）

; ［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of hydromorphone （HM） on Golgi stress in lipopolysaccharide （LPS）-attacked mouse alveolar macrophages and its mechanism.

MethodsThe mouse alveolar macrophage cell line MH-S was attacked with 10 mg/L LPS to establish a model of Golgi stress， and then the cells were randomly divided into control group （group A， normal culture）， LPS group （group B treated with 10 mg/L LPS）， LPS+HM group （group C treated with 1 μmol/L HM and 10 mg/L LPS）， Nrf2 siRNA+LPS+HM group （group D treated with 1 μmol/L HM and 10 mg/L LPS after Nrf2 siRNA transfection）， and NC siRNA+LPS+HM group （group E treated with 1 μmol/L HM and 10 mg/L LPS after NC siRNA transfection）. ELISA was used to measure the content of interleukin 1β （IL-1β） and interleukin 6 （IL-6） in cell supernatant; the content of malondialdehyde （MDA） and the activity of superoxide dismutase （SOD） were measured; Western blot was used to measure the protein expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， Golgi Matrix Protein of 130 （GM130）， Golgin-97， Mannosidase Ⅱ， and ATP2C1; transmission electron microscopy was used to observe the morphological changes of Golgi apparatus.

ResultsCompared with group A， group B had significant increases in the content of IL-1β， IL-6， and MDA and the protein expression levels of Nrf2 and HO-1 and significant reductions in the activity of SOD and the protein expression levels of GM130， Golgin-97， Mannosidase Ⅱ， and ATP2C1 （F=2.33-47.61，P<0.05）. Compared with group B， group C had significant reductions in the content of IL-1β， IL-6， and MDA and significant increases in the activity of SOD and the protein

expression levels of Nrf2， HO-1， GM130， Golgin-97， Mannosidase

Ⅱ， and ATP2C1 （P<0.05）. Compared with group C， group D had significant increases in the content of IL-1β， IL-6， and MDA and significant reductions in the activity of SOD and the protein expression levels of Nrf2， HO-1， GM130， Golgin-97， Mannosidase Ⅱ， and ATP2C1 （P<0.05）. Transmission electron microscopy showed that compared with group B， group C had alleviation of 76S6jeEz77S5xcTvvFmbFA==the damage， vacuolization， and fragmentation of Golgi apparatus， and compared with group C， group D had aggravation of the da-

mage， vacuolization， and fragmentation of Golgi apparatus.

ConclusionHM inhibits Golgi stress in LPS-attacked alveolar macrophages by regulating the Nrf2/HO-1 signaling pathway， thereby alleviating cellular inflammation and oxidative stress response.

［Key words］hydromorphone; lipopolysaccharides; macrophages， alveolar; Golgi apparatus; oxidative stress; heme oxyge-

nase-1; mice

內(nèi)毒素急性肺損傷（ALI）是一種由膿毒癥誘發(fā)的嚴(yán)重且難以控制的肺部炎癥反應(yīng)，目前尚無特效的臨床治療方法，是重癥監(jiān)護室病人死亡的主要原因之一[1]。肺泡巨噬細(xì)胞作為肺組織抵御致病微生物和外源性顆粒的第一道防線，在維持機體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和調(diào)控炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。高爾基體是肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的一個細(xì)胞器，主要參與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)運輸。高爾基體應(yīng)激反應(yīng)可影響肺組織細(xì)胞的功能狀態(tài)，從而對ALI的發(fā)病和病程產(chǎn)生重要影響[3]。作為機體重要的內(nèi)源性保護機制之一，核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）信號通路的激活可抑制過度的高爾基體應(yīng)激反應(yīng)，從而為ALI提供保護[4]。氫嗎啡酮（HM）是嗎啡的衍生物，由于其作用強于嗎啡且起效快，近年來被廣泛用于各種急慢性疼痛的綜合治療。研究證實，HM對ALI有保護作用[5]，但其作用機制尚不清楚。本研究旨在探討HM是否能通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路減輕肺泡巨噬細(xì)胞的高爾基體應(yīng)激反應(yīng)，從而為ALI的臨床治療提供新的依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細(xì)胞株本實驗所用小鼠肺泡巨噬細(xì)胞系MH-S，購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.1.2藥品與試劑鹽酸HM注射液（宜昌人福藥業(yè)有限公司）；脂多糖（LPS，Sigma公司）；白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒與超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Nrf2抗體和高爾基體基質(zhì)蛋白130（GM130）抗體（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）；HO-1抗體和高爾基體蛋白97（Golgin-97）抗體（北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司）；鈣轉(zhuǎn)運ATP酶2C型成員1（ATP2C1）和甘露糖苷酶Ⅱ（Mannosidase Ⅱ）抗體（上海拓然生物科技有限公司）；Nrf2 siRNA、Negative Control siRNA（NC siRNA，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen公司）。

1.1.3儀器電泳儀和轉(zhuǎn)膜槽（北京六一生物科技有限公司）；全自動化學(xué)/熒光/凝膠成像分析系統(tǒng)（中國雪科電器有限公司）；H-7500型透射電鏡（日本HITACHI公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和建模根據(jù)文獻方法[6]，用MH-S細(xì)胞培養(yǎng)液在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)MH-S細(xì)胞。選擇生長狀態(tài)良好的MH-S細(xì)胞，用10 mg/L LPS處理細(xì)胞，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞模型。

1.2.2細(xì)胞的分組與處理將培養(yǎng)的MH-S肺泡巨噬細(xì)胞分為Control組（A組）、LPS組（B組）、LPS+HM組（C組）、Nrf2 siRNA+LPS+HM組（D組）和NC siRNA+LPS+HM組（E組）。A組細(xì)胞正常培養(yǎng)，C組在實驗前2 h加入1 μmol/L HM，D組和E組肺胞巨噬細(xì)胞在實驗前48 h分別轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA和NC siRNA，并在實驗前2 h加入1 μmol/L HM。B、C、D、E組分別在實驗0 h加入10 mg/L LPS建立LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞模型。經(jīng)LPS作用24 h后，收集各組細(xì)胞及其上清液進行相關(guān)實驗檢測。

1.2.3ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6含量根據(jù)文獻方法[7]，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min離心15 min。采用ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6的含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IL-1β和IL-6的含量。

1.2.4細(xì)胞MDA含量與SOD活性檢測收集各組細(xì)胞，用PBS沖洗，1 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，留取細(xì)胞沉淀，加入等滲PBS制備細(xì)胞懸液，用二奎琳甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，應(yīng)用MDA試劑盒和SOD試劑盒測定細(xì)胞中MDA含量和SOD活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5Western blot法測定蛋白表達將RIPA裂解液加入含有細(xì)胞的六孔板中，用刮刀輕輕刮掉細(xì)胞并吸入離心管內(nèi)，置于冰上裂解15 min。將離心管上下混勻，置于離心機內(nèi)低溫（4 ℃）12 000 r/min離心20 min，去上清液用BCA法測定蛋白濃度，計算上樣量。每份樣品取40 μg，95 ℃變性10 min，加入凝膠孔中，將電壓調(diào)至60 V進行電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將反應(yīng)膜置于封閉液中，37 ℃封閉1 h，然后將反應(yīng)膜分別放入稀釋后的一抗中，4 ℃反應(yīng)過夜。用TBST洗滌3次以清除游離的一抗，每次洗滌10 min，再放入稀釋的二抗中緩慢搖動60 min，用TBST洗滌3次以清除游離的二抗。將反應(yīng)膜浸于ECL發(fā)光液中，室溫下反應(yīng)3 min。使用全自動化學(xué)/熒光/凝膠成像分析系統(tǒng)成像并用Image J軟件對條帶進行灰度值分析，計算目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值，對各組目的蛋白的表達情況進行統(tǒng)計分析。

1.2.6透射電鏡觀察細(xì)胞高爾基體的形態(tài)學(xué)變化

根據(jù)文獻方法[8]，將各組細(xì)胞用刮刀刮下，置于離心機中1 000 r/min離心10 min，棄上清液，留取細(xì)胞沉淀，加入25 g/L戊二醛固定，將細(xì)胞制片，將切片浸入醋酸鈾中染色20 min，隨后浸入枸櫞酸鉛中繼續(xù)染色5 min，將染色后的切片置于單口銅網(wǎng)中，在透射電鏡下觀察細(xì)胞高爾基體形態(tài)學(xué)變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所得計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組MH-S細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6含量比較

本文5組IL-1β和IL-6含量比較，差異均有顯著性（F=2.33、2.60，P＜0.05）。與A組比較，B組IL-1β和IL-6含量顯著增加（P＜0.05）；與B組比較，C組IL-1β和IL-6含量顯著降低（P＜0.05）；與C組比較，D組IL-1β和IL-6含量顯著增加（P＜0.05）；C組與E組比較，IL-1β和IL-6含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2各組MH-S細(xì)胞MDA含量和SOD活性比較

本文5組MDA含量和SOD活性比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.57、3.25，P＜0.05）。與A組比較，B組細(xì)胞MDA含量顯著增加，SOD活性顯著下降（P＜0.05）；與B組比較，C組細(xì)胞MDA含量顯著降低，SOD活性顯著上升（P＜0.05）；與C組比較，D組細(xì)胞MDA含量顯著增加，SOD活性顯著下降（P＜0.05）；C組與E組比較，MDA含量與SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3各組MH-S細(xì)胞Nrf2、HO-1及高爾基體應(yīng)激相關(guān)蛋白表達比較

本文5組細(xì)胞Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.54～47.61，P＜0.05）。與A組比較，B組細(xì)胞Nrf2、HO-1蛋白的表達顯著上調(diào)，GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05）；與B組比較，C組細(xì)胞Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；與C組相比較，D組細(xì)胞Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；C組與E組比較，Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

2.4各組MH-S細(xì)胞高爾基體形態(tài)學(xué)變化比較

A組細(xì)胞高爾基體形態(tài)學(xué)正常，排列致密；其余

4組均可見不同程度的高爾基體損傷、空泡化與碎片化。與B組比較，C組細(xì)胞高爾基體損傷減輕，空泡化與碎片化減輕；與C組比較，D組細(xì)胞高爾基體損傷程度加重，空泡化與碎片化均加重；C組與E組細(xì)胞高爾基體損傷程度類似。見圖2。

3討論

肺泡巨噬細(xì)胞是肺內(nèi)主要的抗原反應(yīng)細(xì)胞，在受到內(nèi)毒素等炎癥介質(zhì)刺激后，會迅速激活一系列信號通路，包括Nrf2/HO-1信號通路、核因子κB和絲裂原激活的蛋白激酶信號通路，進而引發(fā)一系列生化反應(yīng)[9]。高爾基體應(yīng)激是指當(dāng)細(xì)胞在受到外界刺激時，高爾基體功能紊亂，產(chǎn)生大量未折疊蛋白而引發(fā)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[10]。其主要特點包括刺激源多樣、反應(yīng)迅速、涉及多種信號通路等[11]。適當(dāng)?shù)母郀柣w應(yīng)激可通過增加抗氧化酶活性、增加細(xì)胞壁厚度、激活細(xì)胞自噬與凋亡等機制保護細(xì)胞免受內(nèi)毒素?fù)p傷，但是過度的高爾基體應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和降解失衡、物質(zhì)運輸障礙，甚至細(xì)胞死亡，因此對高爾基體應(yīng)激的調(diào)控至關(guān)重要[12]。

GM130是位于高爾基體順面的一種基質(zhì)蛋白[13]；Golgin-97是高爾基體特異性連接蛋白，主要位于高爾基體反面[14]；Mannosidase Ⅱ位于高爾基體中間體，參與糖蛋白的合成[15]；ATP2C1是一種高爾基體特異性Ca2+/Mn2+ATP酶，對維持高爾基體功能至關(guān)重要[16]。因此，本研究選擇GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ、ATP2C1作為高爾基體應(yīng)激的標(biāo)志物。本文研究結(jié)果顯示，給予MH-S肺泡巨噬細(xì)胞10 mg/L LPS刺激24 h后，LPS組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子IL-1β和IL-6的表達水平顯著升高，細(xì)胞MDA含量增加，SOD活性降低，高爾基體應(yīng)激相關(guān)蛋白GM130、Golgin-97、Mannosidase Ⅱ和ATP2C1表達下調(diào)。

Nrf2/HO-1信號通路激活是生物體內(nèi)重要的內(nèi)源性防御機制，有助于細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等刺激時，Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并與DNA上的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進HO-1等抗氧化基因的表達，進而生成一氧化碳、膽綠素和亞鐵離子，發(fā)揮清除氧自由基等抗氧化作用[17]。HM是一種阿片類鎮(zhèn)痛藥，通過作用于阿片受體和抑制疼痛信號傳遞發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[18]。此外，HM還具有抗炎作用，其機制

可能與抑制炎癥因子和前列腺素合成、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活化和增殖有關(guān)，但具體作用機制尚未研究清楚[19]。本文研究結(jié)果顯示，HM抑制了LPS誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞的高爾基體應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)了Nrf2和HO-1的蛋白表達，減輕了細(xì)胞的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)應(yīng)用siRNA技術(shù)敲減Nrf2基因后，HM對肺泡巨噬細(xì)胞的保護作用被部分逆轉(zhuǎn)，并伴隨著細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達的下調(diào)。

綜上所述，HM通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路減輕高爾基體應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕LPS誘導(dǎo)的MH-S肺DoZsDd57xKN584Sbug+J8zoeR/uPfaEtzOqF1Xx4akk=泡巨噬細(xì)胞的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實驗的局限性在于HM對肺泡巨噬細(xì)胞的作用機制僅在離體細(xì)胞水平得到驗證，尚需進一步的動物實驗和臨床試驗研究，從而為HM的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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（本文編輯牛兆山）