摘要：【目的】篩選靈芝中具有保護神經(jīng)元活性的化合物，并探究其相應的作用機理，為研發(fā)具有預防和治療阿爾茨海默?。ˋD）功效的靈芝功能性食品、保健品和藥品提供科學依據(jù)。【方法】基于β-淀粉樣蛋白（Aβ）誘導的氧化損傷建立細胞模型，對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、鐵離子還原/抗氧化能力檢測法和2，2-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除法初步評估得到的抗氧化活性較強的靈芝醇提物進行篩選，并對其神經(jīng)元保護活性進行評價。進一步利用靈芝醇提物中與抗氧化有關的4種三萜類化合物，驗證其活性并通過表面等離子共振技術探究其相關作用機理?！窘Y(jié)果】DPPH、ABTS自由基清除及鐵離子還原/抗氧化能力等體外理化初篩與細胞水平篩選試驗結(jié)果表明，6種靈芝醇提物（108、161、106-2、171、173和109）抗氧化保護神經(jīng)元活性較強，其中108、109和106-2樣品對大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞（PC12細胞）氧化應激損傷的保護效果最好；靈芝醇提物可通過緩解細胞周期紊亂、抑制細胞早期凋亡、提高超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量，抑制丙二醛（MDA）含量上升來發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。靈芝醇提物108、106-2和109中4種三萜類化合物（靈芝醛A、靈芝酸B、靈芝酸C2和靈芝酸LM2）的平均含量占比相對較高?；钚则炞C表明4種化合物對細胞氧化應激損傷均有明顯修復效果，其中靈芝醛A與Aβ1 42具有較強的親和力，其KD值為15.62μmol/L，可通過與Aβ1 42競爭性結(jié)合來抑制Aβ1 42與RAGE結(jié)合?！窘Y(jié)論】靈芝醇提物的抗氧化神經(jīng)元活性通過靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸LM2和靈芝醛A 4種化合物的協(xié)同效應來實現(xiàn)。靈芝醛A能通過與RAGE競爭性結(jié)合來減輕或抑制Aβ1 42細胞毒性作用。靈芝具有開發(fā)防治AD功能性產(chǎn)品的潛力。

關鍵詞：靈芝醇提物；淀粉樣β蛋白肽；靈芝三萜；自由基；阿爾茨海默病

中圖分類號：S567.310.99文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）07-1935-14

In vitro screening and mechanism study of Ganodermalucidumcompounds with protective activity against neuronaloxidative stress injury

MAYing-chun ZHANG Jing-song JIA Wei YU Zi-hang 3，YANG Yan 3，LIU Yan-fang ZHANG He-nan TANG Chuan-hong ZHANG Ya-ping WANG Wen-han

（1College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003，China；2Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Edible Fungal Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture and Rural Affairs/National Engineering Research Center of Edible Fungi/Key Laboratory of AgriculturalGenetics and Breeding of Shanghai，Shanghai 201403，China；3College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract：【Objective】Screening for compounds in Ganoderma lucidum that had neuroprotective activity and explo-ring their corresponding mechanisms of action，to provide scientific basis for the research and development of functional foods，health products and drugs with the effects of preventing and treating Alzheimer disease（AD）.【Method】This study established a cellular model based onβ-amyloid protein（Aβ）induced oxidative damage，and screened the antioxi-dant activity of G.lucidum alcohol extracts preliminarily assessed by the 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH）free radical scavenging method，iron ion reduction/antioxidant capacity test，and 2，2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt（ABTS）free radical scavenging method，and evaluated their neuronal protective activity.Furthermore，the 4 triterpenoids compounds related to antioxidants in G.lucidum alcohol extracts were used to verify their activity and to explore their related mechanisms through surface plasma resonance technology.【Result】The results of in vitro physicochemical primary screening and cellular level screening experiments on DPPH and ABTS free radical scavenging，iron ion reduction/antioxidant capacity indicated that 6 G.lucidum alcohol extracts（108，16 106- 17 173 and 109）had strong antioxidant protective activity for neurons，among which samples 108，109 and 106-2 showed the best protective effects against oxidative stress damage in rat adrenal pheochromocytoma（PC12）cells.The G.lu-cidum alcohol extracts could exert neuroprotective effects by alleviating cell cycle disruption，inhibiting early cell apopto-sis，enhancing superoxide dismutase（SOD）activity and glutathione（GSH）content，and suppressing the increase of malondialdehyde（MDA）content.The average contents of 4 triterpenoids（ganoderal A，ganoderic acid B，ganoderic acid C and ganoderic acid LM2）in G.lucidum alcohol extracts numbered 108，106-2 and 109 were relatively high.Ac-tivity validation demonstrated that these 4 compounds all exhibited obvious reparative effects against cellular oxidative stress damage.Among them，ganoderalA and Aβ1-42 showed strong affinity，with a KD value of 15.62μmol/L，and could inhibit the binding of Aβ1-42 to RAGE through competitive binding with Aβ1-42.【Conclusion】The antioxidant neuronal ac-tivity of G.lucidum ethanol extracts is achieved through the synergistic effects of 4 compounds：ganoderic acid C ganoderic acid B，ganoderic acid LM2 and ganoderalA.GanoderalA can alleviate or inhibit the cytotoxic effects of Aβ1-42 by competitively binding with RAGE.G.lucidum has the potential for developing into a functional product for the preven-tion and treatment of AD.

Key words：Ganoderma lucidum ethanol extract；amyloidβ-protein peptide；Ganoderma lucidum triterpenes；free radical；Alzheimer disease

Foundation items：Shanghai Modern Agricultural Industry Technology System（HNKCZ〔2023〕9）；Excellence Team Construction Plan Project of Shanghai Academy of Agricultural Sciences（Hunongkezhuo〔2022〕003）

0引言

【研究意義】在氧化應激狀態(tài)下，過量活性氧（ROS）會破壞細胞蛋白、脂質(zhì)和DNA，導致細胞致命損傷，進而涉及多種病理現(xiàn)象出現(xiàn)，例如衰老、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和糖尿病等（Hajam et al.，2022）。阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征為癡呆、記憶喪失和認知障礙。社會老齡化導致AD發(fā)病率不斷上升，AD影響全球約5000萬人，預計到2050年增至1.52億人，中國約有1000萬人患有AD，到2050年將超4000萬人（Nichols et al.，2019）。突觸功能障礙是AD的一個關鍵早期病理特征，與認知障礙的出現(xiàn)和發(fā)展相關（DeKosky and Scheff，1990；Terry et al.，1991；Masliahetal.，1994）。有研究發(fā)現(xiàn)，額葉皮層的突觸損傷是AD的早期事件（Masliahetal.，2001）；AD早期階段已發(fā)生突觸喪失和輕度認知障礙（Scheffetal.，2007）。這些研究均表明腦內(nèi)大量神經(jīng)元突觸丟失在AD初期階段已發(fā)生，提示在初期階段β-淀粉樣蛋白（β-amyloid pro-tein，Aβ）已與某些通道蛋白的某個位點結(jié)合，而結(jié)合位點相應細胞內(nèi)的信號通路也隨之被激活，最終通過氧化應激神經(jīng)元細胞毒級聯(lián)反應誘發(fā)神經(jīng)功能障礙（Yan et al.，2007）。Aβ可通過誘導ROS表達升高，不僅使得在神經(jīng)細胞膜系統(tǒng)中的質(zhì)膜所含雙鍵受到ROS攻擊、同時蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致其活性喪失，進而影響下游功能變化，還使得DNA復制時的準確度受影響，導致DNA分子也被損害（Wang et al.，2009；Hiramatsu et al.，2010；Huang et al.，2012）。Aβ誘導的氧化應激使ROS過量產(chǎn)生，壓制內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)，破壞細胞氧化還原平衡，導致細胞凋亡和死亡發(fā)生，因此，抑制Aβ誘導的氧化應激可為神經(jīng)元提供保護?！厩叭搜芯窟M展】已有不少學者對靈芝提取物的活性及作用進行相關研究。Mau等（2005）研究表明，靈芝三萜和多糖具有較強的抗氧化活性，可清除羥基自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基。Ajith等（2009）發(fā)現(xiàn)靈芝提取物可顯著提高線粒體中丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸琥珀酸脫氫酶復合物I和II的活性，降低脂質(zhì)過氧化水平。Hasnat等（2013）在體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)靈芝可通過抗氧化活性發(fā)揮神經(jīng)元保護作用，利用發(fā)芽糙米培育的靈芝可顯著提高小鼠血清、肝臟和大腦中抗氧化酶活性。Lin等（2015）采用超臨界二氧化碳分離靈芝提取物，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力與總?cè)?、總多酚呈正相關。Wang等（2019）在體外測試靈芝子實體中分離的化合物對已進行H2O2和老化Aβ誘導SH-SY5Y細胞的抗氧化能力與神經(jīng)保護活性，結(jié)果表明靈芝及其代謝產(chǎn)物（尤其是亞萜類化合物）可能是抗氧化和預防神經(jīng)源性疾病的潛在功能性食品成分。Kolniak-Ostek等（2022）對靈芝子實體的抗癌和抗氧化活性及生物活性化合物進行評估，結(jié)果表明靈芝提取物中富含酚類化合物和三萜類化合物等生物活性成分，靈芝提取物在抗氧化應激相關疾病如癌癥的治療中可能具有一定作用。為了確定從靈芝中提取的三萜類化合物的抗氧化活性，Dong等（2019）使用分離出的部分三萜類化合物清除DPPH自由基和2，2-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基，其中靈芝E和靈芝F通過ABTS方法表現(xiàn)出抗氧化活性。Zheng等（2020）使用乙醇浸提法提取靈芝三萜類化合物，并利用DPPH方法評估其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)該方法依賴于萜類化合物的濃度。靈芝對AD的預防作用涉及多種機制，包括通過抑制星形膠質(zhì)細胞活性、降低促炎細胞因子水平、改善線粒體功能、提高抗氧化活性和調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)來防止有害的Aβ過度積累（Su?kowska-Ziajaetal.，2023）。Ahmad等（2023）選取靈芝提取物中5種化合物，利用分子動力學模擬和分子力學廣義Born表面積（MMGBSA）自由能計算等進行預測，發(fā)現(xiàn)靈芝酸A和靈芝酸B可能是2種有前途的靈芝化合物，可對抗微管蛋白親和力調(diào)節(jié)激酶4（MARK4）。Li等（2024）分離出6個β-淀粉樣蛋白42（Aβ42）原纖維分解劑，包括靈芝三醇、靈芝酸DM、靈芝三醇F、靈芝醇B、靈芝油酚和麥角甾醇；通過體外神經(jīng)保護評估發(fā)現(xiàn)麥角甾醇和靈芝酸DM不僅能顯著緩解Aβ42誘導體內(nèi)認知功能障礙和海馬神經(jīng)元丟失，還可顯著抑制Aβ42誘導的神經(jīng)元凋亡和核因子E2相關因子2（Nrf2）介導的體外與體內(nèi)神經(jīng)元氧化應激?！颈狙芯壳腥朦c】雖有研究表明靈芝具有保護神經(jīng)元功效，但其發(fā)揮作用的活性化合物及相關作用機理尚不明確。大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞（PC12細胞）是研究神經(jīng)元細胞信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)元分化和神經(jīng)退行性疾病的常用神經(jīng)元細胞（Vaudryetal.，2002）。在模擬神經(jīng)分泌過程中PC12細胞與其他常用的神經(jīng)元細胞（SH-SY5Y和Neuro-2a細胞）相比，具有較大的量子尺寸和可釋放囊泡數(shù)量多等優(yōu)點，在胞吐作用和神經(jīng)毒理學等研究方面有獨特的應用價值（Westerink and Ewing，2008；Xie et al.，2023）。同時，PC12細胞模型可用于抗AD或抗衰老藥物的開發(fā)（Li and Buccafusco，2003）。Aβ25 35可誘導PC12細胞的氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡，從而模擬AD的病理特征（Shi et al.，2021）。Aβ25 35是Aβ的一個片段，該片段由25～35個氨基酸殘基組成，在體外顯示出神經(jīng)毒性作用，能激活tau蛋白激酶I/糖原合成酶激酶-3β（TPKI/GSK-3β），降低細胞存活率，且能增加興奮性反應的幅度（Song et al.，2018）。Aβ25 35在AD病理學的研究中被廣泛使用，尤其是在研究AD的治療策略和藥物篩選方面。因此，可用Aβ25 35建立神經(jīng)元退行性疾病細胞模型，對靈芝醇提取物保護神經(jīng)元免受氧化應激損傷的活性成分進行篩選，并探究其作用機理?！緮M解決的關鍵問題】利用Aβ誘發(fā)神經(jīng)元氧化應激損傷理論建立的細胞水平模型，對靈芝醇提物進行抗氧化活性篩選，并對篩選得到的與神經(jīng)元保護活性密切相關的4種化合物進行藥效物質(zhì)基礎驗證和相關作用機理研究，明確靈芝中真正起抗氧化作用的活性成分及其如何發(fā)揮抗氧化功效，為研發(fā)具有預防和治療AD功效的靈芝功能性食品、保健品和藥品提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所實驗室前期制備了64種靈芝子實體醇提物，并測定每種醇提物的DPPH清除率（楊妍等，2020）；本研究從中選取18種DPPH清除率高于30%的靈芝子實體來制備醇提物。18種靈芝子實體的菌株樣品號及其來源：12號（河南省西峽縣食用菌科研中心）；17號（河南省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所）；22號（福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所）；47號（河北省微生物研究所）；54號（江蘇省高郵市科學食用菌研究所）；94號（河南省西峽縣食用菌研究所）；102號、106-2號（湖北嘉魚縣環(huán)宇食用菌研究所）；108號、109號、110號（山東省金鄉(xiāng)縣菇豐食用菌研究所）；126號（吉林敖東食用菌研究所）；160號（貴州省習水縣習酒鎮(zhèn)食用菌研究中心）；161號、170號、171號、173號、176號（山東光大食用菌科研中心）。

PC12細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、二甲基亞砜（DMSO）、DPPH和2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ）均購自美國Sigma公司；0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；alamarBlueTM細胞活力檢測試劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術股份有限公司；生物傳感器芯片CM5購自Cytiva公司；Aβ25 35（用于構(gòu)建PC12細胞損傷模型）和Aβ1 42（用于分子間相互作用位點的探究）購自北京博奧森生物技術有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設備：BD Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）；IX2-ILL100倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Biacore X-100生物分子相互作用分析系統(tǒng)（美國GE Healthcare公司）。

在RMPI 1640基礎培養(yǎng)基中加入10%（v/v）FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，配制成完全培養(yǎng)基，用于細胞傳代和保種。在RMPI 1640基礎培養(yǎng)基中加入1%（v/v）FBS，配制成試驗培養(yǎng)基。

1.2靈芝乙醇提取物制備

參照徐錦等（2020）的方法，略有改進。18種靈芝子實體各取100 g，按照料液比1∶10加入1 L 95%乙醇，熱回流提取30 min，將得到的液體進行抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65℃減壓蒸餾至一定體積，凍干后得到靈芝醇提物。

1.3利用Aβ25 35建立PC12細胞損傷模型

使用超純水將5 mg Aβ25 35配制成1 mmol/L儲備液，在37℃下培養(yǎng)7 d以誘導聚集。參考徐賓（2019）的方法，將對數(shù)生長期的PC12細胞接種至96孔板中，每孔加入濃度為3×104個細胞/mL的細胞懸液100μL，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后吸去培養(yǎng)基，在陰性對照組中加入100μL RPMI1640培養(yǎng)基（含1%FBS），模型組建立包括5個損傷濃度梯度，分別在100μL RPMI 1640培養(yǎng)基（含1%FBS）中加入10、50、100、180和360μmol/LAβ25 35，每組6個重復，在37℃下培養(yǎng)48h。

1.4 alamarBlueTM檢測靈芝醇提物對PC12細胞增殖的影響

根據(jù)汪雯翰等（2018）的方法測定細胞活性，細胞接種數(shù)參照方法1.3。靈芝醇提物對PC12細胞的毒副作用試驗分組：模型組（100μmol/LAβ25 35）、6個樣品組（5、50、500、5000、50000、500000 ng/mL靈芝醇提物）和陰性對照組（5‰DMSO）。各試驗組在37℃下培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，加入無色RPMI 1640培養(yǎng)基和200μL 0.0075 mg/mL alamarBlueTM試劑，在570和600 nm處測吸光度。根據(jù)公式計算靈芝醇提物對PC12細胞的增殖率：

增殖率（%）=［117216×A570nm（樣品）-80586×A600nm（樣品）］/［117216×A570 nm（對照）-80586×A600 nm（對照）］×100

1.5靈芝醇提物對PC12細胞抗氧化指標的影響

1.5.1 SOD活性測定將細胞懸液密度調(diào)整為1×105個細胞/mL，以每孔1 mL接種至12孔板中。24 h后吸去培養(yǎng)基，加入1 mL 50μmol/LAβ25 35繼續(xù)培養(yǎng)48 h，復制體外AD細胞模型。試驗設模型組（50μmol/LAβ25 35）、3個樣品組（50、500和5000 ng/mL靈芝醇提物）、陰性對照組（5‰DMSO）和陽性對照組（20μmol/L維生素E），每組4個重復，每孔100μL。胰蛋白酶消化收集PC12細胞，裂解細胞后，4℃下3000 r/min離心10 min，取上清液，使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，并使用SOD檢測試劑盒測定SOD活性（Cao et al.，2015）。

1.5.2 MDA和GSH含量測定試驗分組同1.5.1。采用硫代巴比妥酸顯色法和比色法，按照檢測試劑盒說明書分別測定MDA和GSH含量。

1.6細胞凋亡試驗

參考李傳華等（2016）的方法，試驗分組同1.5.1。用預冷的PBS洗滌2次，加入100μL結(jié)合緩沖液（Annexin V Binding Buffer）與細胞混合，再加入5μL Annexin V和5μL碘化丙啶（PI），在4℃下黑暗孵育15 min。使用流式細胞儀計數(shù)10000個細胞，并用FlowJo_V10進行分析。

1.7細胞周期試驗

參考汪雯翰等（2017）的方法，試驗分組同1.5.1。PC12細胞經(jīng)試驗處理后消化收集，用PBS清洗，1000 r/min離心10 min，棄上清液，用預冷的75%乙醇固定過夜，1000 r/min離心10 min，PBS重懸細胞并進行清洗，離心10min后棄上清液，細胞在室溫下用500μL PI/RNase染色液孵育15 min，使用流式細胞儀進行檢測，計數(shù)10000個細胞，用FlowJo_V10識別細胞各個階段，包括G0/G1期（第一間隙期，DNA含量不變）、S期（合成期，DNA含量增加）、G2期（第二間隙期）和M期（有絲分裂期），觀察細胞阻滯情況。

1.8靈芝三萜化合物活性驗證

本研究團隊前期基于遺傳算法與偏最小二乘法（GA-PLS）建立了靈芝子實體三萜類化合物抗氧化活性譜效關系研究模型，通過此模型發(fā)現(xiàn)靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸LM2和靈芝醛A是靈芝醇提物有抗氧化作用的主要活性成分（楊妍等，2020）。本研究利用抗氧化能力檢測方法（DPPH自由基清除法、鐵離子還原/抗氧化能力檢測法和ABTS自由基清除法）篩選出抗氧化活性較強的靈芝醇提物樣品，比較各樣品中靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸LM2和靈芝醛A 4種成分的含量占比。在此基礎上，進一步利用細胞模型和表面等離子共振（SPR）技術驗證結(jié)果。

在細胞水平上對4種靈芝三萜化合物活性驗證：試驗設模型組（100μmol/LAβ25 35）、樣品組（0.1、0.2、1、2、10μmol/L靈芝三萜化合物）、陰性對照組（5‰DMSO）和陽性對照組（20μmol/L維生素E），每組4個重復，每孔100μL。各試驗組在37℃下培養(yǎng)48h后，吸去培養(yǎng)基，加入無色RPMI 1640培養(yǎng)基和200μL 0.0075 mg/mL alamarBlueTM試劑，在570和600 nm處測吸光度，計算靈芝樣品對PC12細胞的增殖率，計算公式同1.4。

SPR技術對4種靈芝三萜化合物活性驗證：采用氨基偶聯(lián)的方法將Aβ1 42肽固定在CM5芯片上，晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE蛋白，His-Tag）作為分析物流經(jīng)Aβ1 42的表面進行結(jié)合分析，然后將靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸LM2和靈芝醛A混合到RAGE蛋白中，流過Aβ表面，分析結(jié)合情況。通過擬合結(jié)合曲線獲得樣品與蛋白之間的親和力，親和力大小用KD表示。

1.9統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較通過單因素方差分析（One-way ANOVA）中多重比較完成。

2結(jié)果與分析

2.1靈芝醇提物對PC12細胞增殖的影響

在預試驗中，通過考察DPPH自由基清除能力、鐵離子還原/抗氧化能力及ABTS自由基清除能力，對18種靈芝醇提物進行初步評估，選擇在3種檢測方法中抗氧化活性較強的6種靈芝醇提物（108、109、106-2、161、171和173）進行細胞水平檢測。如圖1-A所示，與模型組相比，6種樣品均對氧化應激損傷的PC12細胞具有極顯著的修復作用（P<0.0 下同），且108、109和106-2樣品的修復效果更佳。細胞毒副作用試驗結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)，在50～5000 ng/mL濃度范圍內(nèi)，108、109和106-2樣品不影響PC12細胞增殖（圖1-B），表明對神經(jīng)元細胞無明顯的毒副作用，因而在后續(xù)試驗中選用50、500和5000 ng/mL作為樣品工作濃度。

2.2靈芝醇提物對PC12細胞抗氧化指標的影響

如圖2-A所示，模型組SOD活性較陰性對照組顯著下降66.6%（P<0.05，下同），表明在PC12細胞損傷模型中，Aβ25 35誘導的損傷能顯著抑制SOD活性；與模型組相比，108樣品在3個濃度下顯著或極顯著提高SOD活性，500 ng/mL 109樣品極顯著提高SOD活性，但106-2樣品在3個濃度下對SOD活性變化均無顯著影響（P>0.05，下同）。如圖2-B所示，模型組GSH含量較陰性對照組顯著下降45.8%；500 ng/mL 106-2樣品對GSH含量有顯著促進作用，較模型組提高84.1%，500 ng/mL 108樣品的GSH含量較模型組極顯著提高221.0%，而109樣品在3個濃度下均未表現(xiàn)出顯著促進GSH含量提高的作用。如圖2-C所示，模型組MDA含量較陰性對照組極顯著提高52.0%；而3個樣品均在一定程度上抑制Aβ25 35引起的MDA含量上升，其中108和109樣品在3個濃度下和106-2樣品在50 ng/mL濃度下均表現(xiàn)出極顯著影響。

2.3靈芝醇提物對PC12細胞凋亡的影響

如圖3-A所示，Aβ25 35可明顯誘導PC12細胞早期凋亡（Q3象限），樣品組均可一定程度緩解細胞凋亡情況發(fā)生。其中，模型組凋亡率較陰性對照組極顯著增加567.7%；106-2、108和109樣品在3個濃度下均極顯著降低早期細胞凋亡率；與模型組相比，106-2和108樣品在500 ng/mL時對早期細胞凋亡抑制效果最好，能使PC12細胞凋亡率分別降低64.7%和64.1%，而109樣品在50 ng/mL時抑制早期凋亡效果最好，可使PC12細胞凋亡率降低68.2%（圖3-B）。

2.4靈芝醇提物對PC12細胞周期的影響

如圖4所示，Aβ25 35處理將細胞周期阻滯在G2/M期。具體表現(xiàn)為模型組較陰性對照組G2/M期比例增加151.5%；與模型組相比，5000 ng/mL 106-2、50 ng/mL 108和500 ng/mL 109可顯著降低G2/M期比例，分別降低11.5%、22.4%和25.5%（表1）。表明靈芝醇提物對Aβ25 35引起的細胞周期紊亂有一定的恢復作用。

2.5靈芝三萜對Aβ25 35誘導PC12細胞氧化應激損傷的影響

利用3種抗氧化方法篩選出抗氧化活性較強的靈芝醇提物108、109、106-2、161、171和173，測定這6種醇提物中三萜類化合物靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸LM2和靈芝醛A的峰面積，以峰面積表示其相對含量，比較6種醇提物中4種化合物的相對含量占比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靈芝醇提物108、106-2和109中4種化合物的平均含量占比相對較高（表2），表明這3種靈芝醇提物抗氧化能力較強。在此基礎上，進一步利用細胞損傷模型和SPR技術驗證此結(jié)果，并探討其作用機理。

2.5.1靈芝三萜對Aβ25 35誘導PC12細胞損傷的修復作用如圖5所示，與陰性對照組相比，模型組的細胞增殖率極顯著下降53.4%；在0.1～1μmol/L濃度范圍內(nèi)，靈芝酸B和靈芝酸LM2對Aβ25 35誘導PC12細胞損傷的修復作用呈劑量依賴性，且在1μmol/L濃度下的修復效果最佳，細胞增殖率分別較模型組顯著提高50.1%和49.6%；在0.1～10μmol/L濃度范圍內(nèi)，靈芝酸C2和靈芝酸A對Aβ25 35誘導PC12細胞損傷的修復作用呈劑量依賴性，且在10μmol/L濃度下的修復效果最佳，細胞增殖率分別較模型組顯著提高58.9%和59.7%。

2.5.2靈芝三萜對Aβ1 42與RAGE結(jié)合的抑制作用試驗設計如圖6-A所示，利用靈芝三萜對Aβ1 42與RAGE結(jié)合進行阻礙，并探究靈芝三萜的阻礙作用位點。如圖6-B1和圖6-B2所示，Aβ1 42與RAGE可緊密結(jié)合，KD值為91.74 nmol/L；在靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸LM2和靈芝醛A這4種三萜類化合物中，只有靈芝醛A與Aβ1 42具有較強的親和力（圖6-C1和圖6-C2），其KD值為15.62μmol/L（圖6-D2）；進一步研究發(fā)現(xiàn)，靈芝醛A還可通過與Aβ1 42結(jié)合來抑制Aβ1 42與RAGE的結(jié)合（圖6-D1和圖6-D3），從而表明靈芝醛A通過與RAGE競爭性結(jié)合來減輕或抑制Aβ1 42細胞毒性作用。

3討論

靈芝中存在著一些具有良好抗氧化活性的化合物，如三萜、多糖和多酚等，這些化合物在減少氧自由基生成、提高抗氧化酶活性和抑制氧化應激反應等方面發(fā)揮著重要作用。靈芝醇提物能防止心臟和大腦線粒體中與年齡相關的抗氧化狀態(tài)下降，從而保護老年小鼠降低ROS水平，延緩衰老過程（Sud-heeshetal.，2010），同時可增加線粒體電子傳遞復合物和錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等活性，以及提高DPPH和ABTS自由基清除劑的活性（Sud-heeshetal.，2009）。Smina等（2011）評估了靈芝總?cè)频捏w內(nèi)外抗氧化活性，表明總?cè)颇苡行宄蹶庪x子自由基。靈芝三萜類藥物可增加肝臟和腦組織中SOD和CAT活性，保護身體免受氧化應激誘導的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化損傷（Smina et al.，2016）。在小鼠帕金森病模型中，靈芝多糖可調(diào)節(jié)細胞凋亡相關蛋白表達，抑制氧化應激誘導的神經(jīng)元凋亡，并在小腦顆粒細胞中具有顯著的保護作用（Sun et al.，2017）。本研究在預試驗的3種抗氧化活性測評模型中，靈芝所有樣品對DPPH自由基清除效果最好，而在鐵離子還原/抗氧化能力模型中抗氧化作用表現(xiàn)較弱，表明同一樣品在不同的抗氧化試驗中表現(xiàn)的活性靈敏度并不一致，可能與其含有的成分密切相關；之后將篩選的化合物進行比對，挑選出在3種抗氧化活性測評模型中抗氧化效果均具優(yōu)勢的靈芝醇提物，在建立的Aβ引起氧化應激細胞模型中做進一步篩選，明確了3種修復氧化應激損傷效果較好的醇提物，分別為106-2、108和109。探究這3種樣品對PC12細胞的毒性作用，以及對已被Aβ25 35誘導損傷的PC12細胞的修復作用濃度，并檢測3種樣品對Aβ25 35所致PC12細胞損傷模型的ROS釋放、細胞凋亡及周期的變化情況。經(jīng)體外生化反應與細胞水平的篩選，發(fā)現(xiàn)靈芝醇提物可一定程度修復氧化應激損傷。

Aβ是誘導神經(jīng)元細胞凋亡的主要因素之一，其可破壞腦內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡，促使神經(jīng)元凋亡，甚至導致腦部病理損傷（Varadarajan et al.，2000）。在多項研究中已有使用11基酸片段的Aβ25 35替

代全長肽Aβ1 42用于AD毒理學研究的相關報道，因為Aβ25 35能模擬天然全長肽的毒理作用和氧化應激特性，且合成相對簡單、成本較低（Varadarajanet al.，2001）。本研究在體外經(jīng)生化反應證實了靈芝醇提物具有良好的抗氧化能力，但考慮到生物體內(nèi)部的復雜性，在樣品抗氧化活性評價試驗中，選用細胞模型來評價樣品的相關活性，以便對樣品活性有更客觀的評價。細胞周期、細胞凋亡與氧化應激是細胞生物學研究中重要的3個方面。細胞周期的調(diào)控是細胞保持正常功能的重要機制之一。研究表明，靈芝三萜提取物可將細胞周期停滯在G1期（Jedinak et al.，2011；Wu et al.，2012）。除了使細胞周期停滯于G1期外，三萜提取物還能抑制處于G2/M期的細胞（Lin etal.，2003）。Hsu等（2002）報道，靈芝能增強人原代中性粒細胞的吞噬活性和遷移，并在體外主要通過激活Akt調(diào)節(jié)的信號通路來抑制自發(fā)和Fas誘導的中性粒細胞凋亡。靈芝水提取物通過抑制突觸素轉(zhuǎn)運、JNK和p38信號通路以拮抗神經(jīng)元細胞凋亡（Lai et al.，2008）。Lee等（2016）還發(fā)現(xiàn)靈芝醇提物通過激活Nrf2/HO-1增強細胞抗氧化防御能力，從而保護C2C12成肌細胞免受H2O2誘導的氧化細胞毒性。本研究通過分析細胞凋亡、細胞周期、氧化還原相關酶活性和MDA含量，發(fā)現(xiàn)Aβ25 35處理的模型組使細胞凋亡率增加，并將細胞周期阻滯在G2/M期。3種靈芝醇提物（108、109和106-2）具有減緩氧化應激損傷，緩解細胞周期紊亂，抑制細胞早期凋亡的作用；3種醇提物均能提高SOD活性，說明其能催化超氧陰離子自由基的歧化反應，生成O2和H2O 同時提高GSH含量，抵抗氧化損傷，減少自由基產(chǎn)生，降低細胞液中MDA含量。在提高SOD活性和GSH含量方面，3種靈芝醇提物均有一定的顯著作用，說明這3種靈芝醇提物均能發(fā)揮良好的神經(jīng)元保護能力。針對這一結(jié)果，本研究利用團隊前期通過譜效方程預測得到的靈芝抗氧化活性成分（靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸LM2和靈芝醛A），分析3種靈芝醇提物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)4種成分含量占比高的醇提物，其抗氧化活性也較強，與前期預測結(jié)果相一致，進一步驗證了該預測結(jié)果的準確性和可靠性。

許多患者大腦中Aβ沉積是AD發(fā)生的標志性特征，而RAGE是介導Aβ細胞毒性的重要受體（Yan et al.，2012），RAGE與Aβ相互作用會導致神經(jīng)元損傷和血腦屏障功能障礙（Kook et al.，2012）。也有研究表明抗AD活性物質(zhì)可通過RAGE靶點發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。Onyange等（2005）發(fā)現(xiàn)RAGE蛋白與Aβ神經(jīng)毒性密切相關，因而推測具有抑制Aβ1 42與RAGE結(jié)合的活性小分子有助于防治AD。Cui等（2017）利用微量熱涌動試驗評估RAGE與苦參堿的結(jié)合親和力，發(fā)現(xiàn)matrine可阻斷RAGE配體結(jié)合部位，減少促炎細胞因子和Aβ沉積，減輕AD轉(zhuǎn)基因小鼠記憶障礙，表明matrine可通過阻斷RAGE V結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合而下調(diào)Aβ/RAGE信號通路。Guan等（2022）利用siRNA干擾試驗發(fā)現(xiàn)si-RAGE能明顯減輕薯蕷皂苷對氧化應激和炎癥的抑制作用，表明薯蕷皂苷可通過調(diào)節(jié)RAGE/NOX4介導的氧化應激和炎癥途徑發(fā)揮抗AD活性。本研究為進一步探討靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸LM2和靈芝醛A的神經(jīng)元保護機制，利用SPR技術來驗證這4種三萜類化合物相關抗氧化活性是否與RAGE靶點相關，同時考慮到RAGE蛋白與Aβ的相互作用時可能會涉及到較多結(jié)合位點，因而選用全長肽Aβ1 42進行試驗。研究發(fā)現(xiàn)靈芝醛A能通過與Aβ1 42競爭性結(jié)合來阻礙Aβ1 42與RAGE結(jié)合，預示靈芝醛A能有效抑制Aβ1 42通過RAGE受體進入血腦屏障的累積，從而改善Aβ累積造成的氧化應激。楊妍等（2020）利用譜效關系模型預測了靈芝醇提物抗氧化活性與靈芝酸B、靈芝酸C2、靈芝酸LM2和靈芝醛A存在密切聯(lián)系，而本研究結(jié)果表明這4種化合物通過其良好的抗氧化活性賦予了靈芝醇提物緩解Aβ神經(jīng)毒性和保護神經(jīng)元的功效，其中靈芝醛A是通過阻礙Aβ與RAGE結(jié)合來減少Aβ的累積。本研究結(jié)果可為開發(fā)靈芝防治AD相關小分子抑制劑及保健品和功能食品提供數(shù)據(jù)支撐。有研究表明，通過動物模型抑制RAGE或敲除RAGE基因，均可促進神經(jīng)退行性疾病治療過程中獲得更好結(jié)果（Deane et al.，2012；Deane，2012）。目前還未有針對AD患者的臨床RAGE抑制劑，需要更多的體內(nèi)研究和臨床試驗，以確保使用新的RAGE拮抗劑對AD動物模型和AD患者進行慢性治療的有效性。

靈芝作為一種傳統(tǒng)的藥用真菌，不僅具有抗氧化作用，還可通過減少促炎因子的釋放減輕神經(jīng)炎癥，同時抑制乙酰膽堿酯酶活性，從而改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能；此外，靈芝還能調(diào)節(jié)神經(jīng)—內(nèi)分泌系統(tǒng)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用（C?r et al.，2014；王穎等，2019）。本研究通過構(gòu)建神經(jīng)元損傷體外模型，對靈芝三萜類化合物的體外抗AD神經(jīng)保護活性以及相關作用機理進行探究，顯示了靈芝的體外抗氧化神經(jīng)保護功效。然而，由于體外試驗的環(huán)境與生物體內(nèi)的復雜條件存在差異，這些試驗結(jié)果可能無法準確預測化合物或治療手段在體內(nèi)的真實效果，因此還需進一步的體內(nèi)試驗來確定其在動物及臨床治療中的有效性和安全性。

4結(jié)論

靈芝醇提物的抗氧化神經(jīng)元活性不依賴于單一化合物，而是通過靈芝酸C2、靈芝酸B、靈芝酸LM2和靈芝醛A 4種化合物的協(xié)同效應來實現(xiàn)。4種三萜類化合物中，靈芝醛A能通過與RAGE競爭性結(jié)合來減輕或抑制Aβ1 42細胞毒性作用。靈芝具有開發(fā)防治AD功能性產(chǎn)品的潛力。

參考文獻（References）：

李傳華，賈薇，楊海芮，孫太萍，莊海寧，陳杰，奚利萍，汪雯翰.2016.人工栽培黑柄炭角菌子實體的生物活性［J］.食用菌學報，23（2）：59-64.［Li C H，Jia W，Yang H R，Sun T P，Zhuang H N，Chen J，Xi L P，Wang W H.2016.Immunological，anti-oxidant and antitumor activity of arti-ficially cultivated Xylaria nigripes fruit body extracts［J］.Acta Edulis Fungi，23（2）：59-64.］doi：10.16488/j.cnki.1005-9873.2016.02.012.

汪雯翰，賈薇，張勁松，楊海芮，楊焱，朱麗娜.2017.猴頭菌子實體提取物對人肺癌細胞SPCA-1的抑制作用［J］.食用菌學報，24（1）：89-92.［Wang W H，Jia W，Zhang J S，Yang H R，Yang Y，Zhu L N.2017.Inhibition of SPCA-1 cell proliferation by extracts of Hericium erinaceus fruit bodies［J］.Acta Edulis Fungi，24（1）：89-92.］doi：10.16488/j.cnki.1005-9873.2017.01.016.

汪雯翰，朱麗娜，張赫男，楊焱，莊海寧，唐傳紅，劉艷芳，徐賓，賈薇，張勁松.2018.抑制前列腺癌的食藥用菌醇提物的篩選及靈芝醇提物對癌細胞的抑制機理［J］.菌物學報，37（6）：782-793.［Wang W H，Zhu L N，Zhang H N，Yang Y，Zhuang H N，Tang C H，Liu Y F，Xu B，Jia W，Zhang J S.2018.Screening of mushroom ethanol extractinhibiting prostate cancer and cancer-inhibitory mecha‐nism of Ganoderma lingzhi extract［J］.Mycosystema，37（6）：782-793.］doi：10.13346/j.mycosystema.180003.

王穎，魏佳韻，吳思佳，章春豪，王興亞.2019.靈芝多糖結(jié)構(gòu)特征及藥理作用的研究進展［J］.中成藥，41（3）：627-635.［Wang Y，Wei J Y，Wu S J，Zhang C H，Wang X Y.2019.Research progress on structure characteristics and pharma‐cological mechanism of Ganoderma lucidum polysaccha‐rides［J］.Chinese Traditional Patent Medicine，41（3）：627-635.］doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2019.03.029.

徐賓.2019.靈芝三萜抑制良性前列腺增生活性及作用機理的研究［D］.上海：上海海洋大學.［Xu B.2019.The effect and mechanism of Ganoderma lucidum triterpenoid inhibi-ting the growth of benign prostatic hyperplasia［D］.Shang‐hai：Shanghai Ocean University.］doi：10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000129.

徐錦，汪雯翰，楊妍，韓偉，唐傳紅，楊焱，劉艷芳，張勁松，賈薇.2020.乙醇濃度對提取靈芝三萜含量的影響及提取物抗前列腺癌細胞LNCaP的活性［J］.菌物學報，39（1）：155-163.［Xu J，Wang W H，Yang Y，Han W，Tang C H，Yang Y，Liu Y F，Zhang J S，Jia W.2020.Effects of etha‐nol concentration on the extraction of triterpenoids in Ganoderma lingzhi and activity of the extract against pros‐tate cancer cells LNCaP［J］.Mycosystema，39（1）：155-163.］doi：10.13346/j.mycosystema.190299.

楊妍，唐傳紅，賈薇，馮娜，唐慶九，劉艷芳，楊焱，吳迪，汪雯翰，張勁松.2020.基于偏最小二乘法的赤芝子實體三萜類化合物抗氧化譜效關系的研究［J］.食用菌學報，27（2）：63-76.［Yang Y，Tang C H，Jia W，F(xiàn)eng N，Tang Q J，Liu Y F，Yang Y，Wu D，Wang W H，Zhang J S.2020.Spectrum-effect relationship between HPLC fingerprints and antioxidant activity of triterpenes in Ganodermalucidum fruiting bodies using partial least squares regres‐sion［J］.Acta Edulis Fungi，27（2）：63-76.］doi：10.16488/j.cnki.1005-9873.2020.02.009.

Ahmad F，Singh G，Soni H，Tandon S.2023.Identification of potential neuroprotective compound from Ganoderma lucidum extract targeting microtubule affinity regulation kinase 4 involved in Alzheimer’s disease through molecu‐lar dynamics simulation and MMGBSA［J］.Aging Medi‐cine，6（2）：144-154.doi：10.1002/agm2.12232.

Ajith T A，Sudheesh N P，Roshny D，Abishek G，Janardhanan K K.2009.Effect of Ganoderma lucidum on the activities of mitochondrial dehydrogenases and complex I and II of electron transport chain in the brain of aged rats［J］.Experi‐mental Gerontology，44（3）：219-223.doi：10.1016/j.exger.2008.11.002.

Cao Y W，Jiang Y，Zhang D Y，Wang M，Chen W S，Su H X，Wang Y T，Wan J B.2015.Protective effects of Penthorumchinense Pursh against chronic ethanol-induced liver injury in mice［J］.Journal of Ethnopharmacology，161：92-98.doi：10.1016/j.jep.2014.12.013.

Cui L L，Cai Y J，Cheng W W，Liu G，Zhao J H，Cao H，Tao H，Wang Y，Yin M K，Liu T T，Liu Y，Huang P R，Liu Z，Li K S，Zhao B.2017.A novel，multi-target natural drug candi‐date，matrine，improves cognitive deficits in Alzheimer’s disease transgenic mice by inhibiting Aβaggregation and blocking the RAGE/Aβaxis［J］.Molecular Neurobiology，54（3）：1939-1952.doi：10.1007/s 12035-016-9783-8.

C?r D，Boti?T，Knez?，Batista U，Gregori A，Pohleven F，Bon?ina T.2014.Two-stage extraction of antitumor，anti‐oxidant and antiacetylcholinesterase compounds from Ganoderma lucidum fruiting body［J］.The Journal of Su-percritical Fluids，91：53-60.doi：10.1016/j.supflu.2014.04.006.

Deane R J.2012.Is RAGE still a therapeutic target for Alzheimer’s disease？［J］.Future Medicinal Chemistry，4（7）：915-925.doi：10.4155/fmc.12.51.

Deane R，Singh I，Sagare A P，Bell R D，Ross N T，LaRue B，Love R，Perry S，Paquette N，Deane R J，Thiyagarajan M，Zarcone T，F(xiàn)ritz G，F(xiàn)riedman A E，Miller B L，Zlokovic B V.2012.A multimodal RAGE-specific inhibitor reduces amyloidβ-mediated brain disorder in a mouse model of Alzheimer disease［J］.The Journal of Clinical Investiga‐tion，122（4）：1377-1392.doi：10.1172/jci58642.

DeKosky S T，Scheff S W.1990.Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer’s disease：Correlation with cogni‐tive severity［J］.Annals of Neurology，27（5）：457-464.doi：10.1002/ana.410270502.

Dong Q Y，He D J，Ni X D，Zhou H B，Yang H L.2019.Com‐parative study on phenolic compounds，triterpenoids，and antioxidant activity of Ganoderma lucidum affected by dif‐ferent drying methods［J］.Journal of Food Measurement and Characterization，13：3198-3205.doi：10.1007/s 11694-019-00242-0.

Guan L S，Mao Z，Yang S，Wu G L，Chen Y R，Yin L H，Qi Y，Han L，Xu L N.2022.Dioscin alleviates Alzheimer’s dis‐ease through regulating RAGE/NOX4 mediated oxidative stress and inflammation［J］.Biomedicine&Pharmaco‐therapy，152：113248.doi：10.1016/j.biopha.2022.113248.

Hajam Y A，Rani R，Ganie S Y，Sheikh T A，Javaid D，Qadri S S，Pramodh S，Alsulimani A，Alkhanani M F，Harakeh S，Hussain A，Haque S，Reshi M S.2022.Oxidative stress inhuman pathology and aging：molecular mechanisms and perspectives［J］.Cells，11（3）：552.doi：10.3390/cells 1103 0552.

Hasnat M A，Pervin M，Lim B O.2013.Acetylcholinesterase inhibition and in vitro and in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum grown on germinated brown rice［J］.Molecules，18（6）：6663-6678.doi：10.3390/molecules 180 66663.

Hiramatsu M，Takiguchi O，Nishiyama A，Mori H.2010.Cilo‐stazol prevents amyloidβpeptide（25-35）-induced memory impairment and oxidative stress in mice［J］.British Jour‐nal of Pharmacology，161（8）：1899-1912.doi：10.1111/j.1476-5381.2010.01014.x.

Hsu M J，Lee S S，Lin W W.2002.Polysaccharide purified from Ganoderma lucidum inhibits spontaneous and Fas-mediated apoptosis in human neutrophils through activa‐tion of the phosphatidylinositol 3 kinase/Akt signaling pathway［J］.Journal of Leukocyte Biology，72（1）：207-216.doi：10.1189/jlb.72.1.207.

Huang H C，Chang P，Dai X L，Jiang Z F.2012.Protective effects of curcumin on amyloid-β-induced neuronal oxida‐tive damage［J］.Neurochemical Research，37（7）：1584-1597.doi：10.1007/s 11064-012-0754-9.

Jedinak A，Thyagarajan-Sahu A，Jiang J H，Sliva D.2011.Ganodermanontriol，a lanostanoid triterpene from Gano-derma lucidum，suppresses growth of colon cancer cells throughβ-catenin signaling［J］.International Journal of Oncology，38（3）：761-767.doi：10.3892/ijo.2011.898.

Kolniak-Ostek J，Oszmiański J，Szyjka A，Moreira H，Barg E.2022.Anticancer and antioxidant activities in Ganoderma lucidum wild mushrooms in Poland，as well as their pheno‐lic and triterpenoid compounds［J］.International Journal of Molecular Sciences，23（16）：9359.doi：10.3390/ijms23 169359.

Kook S Y，Hong H S，Moon M，Ha C M，Chang S，Mook-Jung I.2012.Aβ1-42-RAGE interaction disrupts tight junctions of the blood-brain barrier via Ca2+-calcineurin signaling［J］.Journal of Neuroscience，32（26）：8845-8854.doi：10.1523/JNEUROSCI.6102-11.2012.

Lai C S W，Yu M S，Yuen W H，So K F，Zee S Y，Chang R C C.2008.Antagonizingβ-amyloid peptide neurotoxicity of the anti-aging fungus Ganoderma lucidum［J］.Brain Re-search，1190：215-224.doi：10.1016/j.brainres.2007.10.103.

Lee Y H，Kim J H，Song C H，Jang K J，Kim C H，Kang J S，Choi Y H，Yoon H M.2016.Ethanol extract of Gano-derma lucidum augments cellular anti-oxidant defense through activation of Nrf2/HO-1［J］.Journal of Pharmaco‐puncture，19（1）：59-69.doi：10.3831/KPI.2016.19.008.

Li Q M，Han H H，Zang D D，Zha X Q，Zhou A，Zhang F Y，Luo J P.2024.Rapid discovery of Aβ42 fibril disintegra‐tors from Ganoderma lucidum via ligand fishing and their neuroprotective effects on Alzheimer’s disease［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，72（8）：4127-4141.doi：10.1021/acs.jafc.3c08664.

Li X D，Buccafusco J J.2003.Effect ofβ-amyloid peptide 1-42 on the cytoprotective action mediated byα7 nicotinic ace‐tylcholine receptors in growth factor-deprived differentia-ted PC-12 cells［J］.Journal of Pharmacology and Experi‐mental Therapeutics，307（2）：670-675.doi：10.1124/jpet.103.053785.

Lin M S，Yu Z R，Wang B J，Wang C C，Weng Y M，Koo M.2015.Bioactive constituent characterization and antioxi‐dant activity of Ganoderma lucidum extract fractionated by supercritical carbon dioxide［J］.Sains Malaysiana，44（12）：1685-1691.

Lin S B，Li C H，Lee S S，Kan L S.2003.Triterpene-enriched extracts from Ganoderma lucidum inhibit growth of hepa‐toma cells via suppressing protein kinase C，activating mitogen-activated protein kinases and G2-phase cell cycle arrest［J］.Life Sciences，72（21）：2381-2390.doi：10.1016/S0024-3205（03）00124-3.

Masliah E，Mallory M，Alford M，DeTeresa R，Hansen L，Mc-Keel Jr DW，Morris J C.2001.Altered expression of synap-tic proteins occurs early during progression of Alzheimer’s disease［J］.Neurology，56（1）：127-129.doi：10.1212/wnl.56.1.127.

Masliah E，Mallory M，Hansen L，DeTeresa R，Alford M，Terry R.1994.Synaptic and neuritic alterations during the pro‐gression of Alzheimer’s disease［J］.Neuroscience Letters，174（1）：67-72.doi：10.1016/0304-3940（94）90121-x.

Mau J L，Tsai S Y，Tseng Y H，Huang S J.2005.Antioxidant properties of hot water extracts from Ganoderma tsugae Murrill［J］.LWT-Food Science and Technology，38（6）：589-597.doi：10.1016/j.lwt.2004.08.010.

Nichols E，Szoeke C E，Vollset S E，Abbasi N，Abd-Allah F，Abdela J，Aichour M T E，Akinyemi R O，Alahdab F，Asgedom S W.2019.Global，regional，and national burden of Alzheimer’s disease and other dementias，1990-2016：A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016［J］.The Lancet Neurology，18（1）：88-106.doi：10.1016/S1474-4422（18）30403-4.

Onyango I G，Tuttle J B，Bennett Jr J P.2005.Altered intracel‐lular signaling and reduced viability of Alzheimer’s di-sease neuronal cybrids is reproduced byβ-amyloid peptide acting through receptor for advanced glycation end pro-ducts（RAGE）［J］.Molecular and Cellular Neuroscience，29（2）：333-343.doi：10.1016/j.mcn.2005.02.012.

Scheff S W，Price D A，Schmitt F A，DeKosky S T，Mufson EJ.2007.Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer di-sease and mild cognitive impairment［J］.Neurology，68（18）：1501-1508.

Shi J H，Li R Z，Yang Y X，Ji L T，Li C Y.2021.Protective effect ofα-asarone andβ-asarone on Aβ-induced inflamma‐tory response in PC12 cells and its［J］.Journal of Zhejiang University（Medical Sciences），50（5）：591-600.doi：10.3724/zdxbyxb-2021-0162.

Smina T P，Mathew J，Janardhanan K K，Devasagayam T P A.2011.Antioxidant activity and toxicity profile of total tri-terpenes isolated from Ganoderma lucidum（Fr.）P.Karst occurring in South India［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，32（3）：438-446.doi：10.1080/j.etap.2011.08.011.

Smina T，P Joseph J，Janardhanan K K.2016.Ganoderma lucidum total triterpenes preventγ-radiation induced oxida‐tive stress in Swiss albino mice in vivo［J］.Redox Report，21（6）：254-261.doi：10.1080/13510002.2015.1126098.

Song Y X，Li P，Liu L，Bortolini C，Dong M D.2018.Nano‐structural differentiation and toxicity of amyloid-β25-35 aggregates ensue from distinct secondary conformation［J］.Scientific Reports，8（1）：765.doi：10.1038/s41598-017-19106-y.

Sudheesh N P，Ajith T A，Ramnath V，Janardhanan K K.2010.Therapeutic potential of Ganoderma lucidum（Fr.）P.Karst.against the declined antioxidant status in the mitochondria of post-mitotic tissues of aged mice［J］.Clinical Nutrition，29（3）S+RjRe9B5mbuJom2N36e25yqSu+PIuN648+IaGTn6LA=：406-412.doi：10.1016/j.clnu.2009.12.003.

Sudheesh N，Ajith T，A Janardhanan K K.2009.Ganoderma lucidum（Fr.）P.Karst enhances activities of heart mito‐chondrial enzymes and respiratory chain complexes in the aged rat［J］.Biogerontology，10（5）：627-636.doi：10.1007/s10522-008-9208-9.

Sun X Z，Liao Y，Li W，Guo L M.2017.Neuroprotective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides against oxi‐dative stress-induced neuronal apoptosis［J］.Neural Rege-neration Research，12（6）：953-958.doi：10.4103/1673-5374.208590.

Su?kowska-Ziaja K，Balik M，Szczepkowski A，Trepa M，Zengin G，Ka?a K，Muszyńska B.2023.A review of chemi‐cal composition and bioactivity studies of the most promi-sing species of Ganoderma spp.［J］.Diversity，15（8）：882.doi：10.3390/d 15080882.

Terry R D，Masliah E，Salmon D P，Butters N，DeTeresa R，Hill R，Hansen LA，Katzman R.1991.Physical basis of cogni‐tive alterations in Alzheimer’s disease：Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment［J］.Annals of Neu-rology，30（4）：572-580.doi：10.1002/ana.410300410.

Varadarajan S，Kanski J，Aksenova M，Lauderback C，Butter‐field D A.2001.Different mechanisms of oxidative stress and neurotoxicity for Alzheimer’s Aβ（1-42）and Aβ（25-35）［J］.Journal of the American Chemical Society，123（24）：5625-5631.doi：10.1021/ja010452r.

Varadarajan S，Yatin S，Aksenova M，Butterfield D A.2000.Review：Alzheimer’s amyloidβ-peptide-associated freeradical oxidative stress and neurotoxicity［J］.Journal of Structural Biology，130（2-3）：184-208.doi：10.1006/jsbi.2000.4274.

Vaudry D，Stork P J，Lazarovici P，Eiden L.2002.Signaling pathways for PC12 cell differentiation：Making the right connections［J］.Science，296（5573）：1648-1649.doi：10.1126/science.1071552.

Wang C F，Liu X M，Lian C L，Ke J Y，Liu J Q.2019.Triter‐penes and aromatic meroterpenoids with antioxidant activ‐ity and neuroprotective effects from Ganoderma lucidum［J］.Molecules，24（23）：4353.doi：10.3390/molecules242 34353.

Wang H Q，Xu Y X，Yan J，Zhao X Y，Sun X B，Zhang Y P，Guo J C，Zhu C Q.2009.Acteoside protects human neuro‐blastoma SH-SY5Y cells againstβ-amyloid-induced cell injury［J］.Brain Research，1283：139-147.doi：10.1016/j.brainres.2009.05.101.

Westerink R S H，Ewing A G.2008.The PC12 cell as model for neurosecretion［J］.Acta Physiologica，192（2）：273-285.doi：10.1111/j.1748-1716.2007.01805.x.

Wu G S，Qian Z M，Guo J J，Hu D J，Bao J L，Xie J，Xu W S，Lu J J，Chen X P，Wang Y T.2012.Ganoderma lucidum extract induces G1 cell cycle arrest，and apoptosis in human breast cancer cells［J］.The American Journal of Chinese Medicine，40（3）：631-642.doi：10.1142/S019241 5X12500474.

Xie D N，Deng T，Zhai Z W，Sun T，Xu Y.2023.The cellular model for Alzheimer’s disease research：PC12 cells［J］.Frontiers in Molecular Neuroscience，15：1016559.doi：10.3389/fnmol.2022.1016559.

Yan S D，Chen X，Walker D G，Schmidt A M，Arancio O，Lue L F.2007.RAGE：A potential target for Aβ-mediated cellu‐lar perturbation in Alzheimer’s disease［J］.Current Mole-cular Medicine，7（8）：735-742.doi：10.2174/1566524077 83220741.

Yan S S，Chen D，Yan S Q，Guo L，Du H，Chen J X.2012.RAGE is a key cellular target for Abeta-induced perturba‐tion in Alzheimer’s disease［J］.Frontiers in bioscience（Scholar edition），4（1）：240-250.doi：10.2741/s265.

Zheng S Z，Zhang W R，Liu S R.2020.Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides and triter‐penoids from the medicinal mushroom Ganoderma lucidum and evaluation of their in vitro antioxidant capaci‐ties［J］.PLoS One，15（12）：e0244749.doi：10.1371/jour‐nal.pone.0244749.

（責任編輯羅麗）