【摘要】隨著抗菌藥物種類增多和抗生素處方數(shù)量的增加，廣泛的抗菌素耐藥性傳播成了一個日益嚴重的衛(wèi)生保健問題，對細菌感染的有效治療帶來巨大挑戰(zhàn)。目前，對于耐藥性檢測結(jié)果的準確性判斷控制的研究相對較少。本文從人員、設(shè)施與環(huán)境、設(shè)備和試劑、樣本采集及運送、檢驗過程和檢驗后過程6個方面，對動物源細菌耐藥性檢測實驗室需要注意的質(zhì)量控制問題進行了詳細的講解，不僅保證了實驗達到生物安全的要求，同時也保證了實驗數(shù)據(jù)的真實可靠。為不同實驗室間實驗過程的準確度、試劑的可靠性和操作的正確性提供了指導(dǎo)方向，為后續(xù)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析提供了準確、合理、規(guī)范的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進而能夠真實反映耐藥性現(xiàn)狀的要求。

【關(guān)鍵詞】耐藥性；質(zhì)量控制；動物源

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.05.037

Quality Control Requirements for Antibiotic Resistance Testing Laboratories of Animal Derived Bacteria

HAN Juanzhu， LI Xinnan， QIU Yue， SUN Yuanyuan， GUO Yucui， SU Weiyi

（Liaoning Inspection， Examination & Certification Centre〔Liaoning Institute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Liaoning Key Laboratory of Livestock Product Safety， Shenyang 110036， China）

Abstract： With the increase in the variety of antibiotics and the number of antibiotic prescriptions， the widespread spread of antibiotic resistance has become an increasingly serious healthcare problem， posing great challenges to the effective treatment of bacterial infections. There is relatively little research on the accuracy judgment and control of antibiotic resistance monitoring results. This article provides a detailed explanation of the quality control issues that need to be paid attention to in antibiotic resistance testing laboratories of animal derived bacterial resistance from six aspects： personnel， facilities and environment， equipment and reagents， sample collection and transportation， testing process， and post testing process. This not only ensures that biological safety requirements are met during the experimental process， but also ensures the authenticity and reliability of data. This provides guidance on the accuracy of inter laboratory testing processes， the reliability of reagents， and the correctness of operations， providing accurate， reasonable， and standardized basic data for subsequent data statistical analysis， in order to achieve the requirement of truly reflecting the current situation of drug resistance.

Keywords： antibiotic resistance； quality control； animal origin

為了提高動物源細菌耐藥性檢測實驗室（以下簡稱“實驗室”）質(zhì)量控制能力，我們以《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定評審準則》《農(nóng)業(yè)部產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試機構(gòu)基本條件》為基本原則，結(jié)合世界各國先進管理經(jīng)驗，從實驗室角度對該過程相關(guān)因子的真實性和準確性制定規(guī)范準則。該規(guī)范準則涵蓋了實驗的全過程，包括前期、中期和后期，以及動態(tài)影響因子（人員和環(huán)境）和靜態(tài)影響因子（設(shè)備、設(shè)施和方法學(xué)）。

1人員

從事耐藥性檢測的人員應(yīng)滿足《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》中“6.2人員”、《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定評審準則》中第九條、《農(nóng)業(yè)部產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試機構(gòu)基本條件》中“第二章機構(gòu)與人員”的相關(guān)要求。耐藥性檢測負責(zé)人還應(yīng)具有獨立簽發(fā)藥物敏感性檢驗報告的能力。耐藥性檢測人員應(yīng)具備微生物檢驗、生物安全相關(guān)理論知識和實踐經(jīng)驗，能夠正確使用耐藥監(jiān)測系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)上報，并具有對耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析總結(jié)的能力。耐藥性檢測人員應(yīng)相對固定，數(shù)量可以滿足工作需要。新員工或長時間不從事該方面檢驗人員應(yīng)經(jīng)相應(yīng)崗位能力評估合格后方可獨立操作。檢測人員每年需參加專業(yè)學(xué)習(xí)，包括自行組織學(xué)習(xí)、線上學(xué)習(xí)、外出學(xué)習(xí)等形式。

2設(shè)施與環(huán)境

2.1設(shè)計原則

實驗室設(shè)計參照GB 50346—2011《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》、GB 19489—2008《實驗室生物安全通用要求》、NY/T 1948—2010《獸醫(yī)實驗室生物安全要求通則》和WHO《實驗室生物安全手冊》，遵循科學(xué)的設(shè)計理念，合理選址、規(guī)范布局、流程通暢、設(shè)計先進。

實驗室設(shè)計要符合生物安全法的理念，保證生物安全性，確保實驗室人員及環(huán)境的安全；要結(jié)合現(xiàn)有條件合理規(guī)劃，既保證功能齊全達到檢測要求，又能經(jīng)濟實用營造舒適的檢測環(huán)境；要有適當超前原則，在空間上留有發(fā)展余地；布局上要體現(xiàn)出專業(yè)特征，便于控制、操作和管理。

2.2布局

實驗室可采用常壓和負壓兩種狀態(tài)的實驗室。常壓狀態(tài)實驗室主要用于培養(yǎng)基制備、生化鑒定、血清分型及藥敏試驗和濕熱干熱滅菌消毒等；負壓狀態(tài)實驗室的生物安全防護性能高于常壓狀態(tài)實驗室，其主要用于細菌的分離純化、無菌實驗、真菌檢測等。

2.3設(shè)施

實驗室可以設(shè)置在共用建筑物內(nèi)，但應(yīng)相對獨立。入口處應(yīng)有對應(yīng)等級的生物安全黃色警告防護標識、標明負責(zé)人、聯(lián)系電話等。實驗室內(nèi)部布局應(yīng)滿足微生物實驗室基本要求，配備實驗操作區(qū)域、人員緩沖區(qū)域和物品清潔區(qū)域；物流、人流不應(yīng)出現(xiàn)重疊；操作間的門應(yīng)配有玻璃窗，并且門能夠自動感應(yīng)；大門需配有門禁卡。

實驗室內(nèi)部空氣流通可以使用自然風(fēng)，同時配備防蚊蟲紗窗。當使用器械人工通風(fēng)時，通風(fēng)系統(tǒng)應(yīng)獨立于公共的中央空調(diào)系統(tǒng)，以防污染。采用內(nèi)部循環(huán)排風(fēng)系統(tǒng)的生物安全柜，實驗室應(yīng)配備通風(fēng)換氣裝置；采用管道排風(fēng)式生物安全柜，實驗室的排風(fēng)系統(tǒng)要求獨立安裝，不應(yīng)與公共通風(fēng)系統(tǒng)相連。另外，根據(jù)實驗操作時的標準操作規(guī)程和儀器管理辦法，實驗室內(nèi)必須配備足夠數(shù)量的洗手池。洗手池要位于實驗操作區(qū)域出口處，并配有腳踏式、長手柄式或自動感應(yīng)式洗手龍頭，同時配備消毒設(shè)施，包括洗手液、消毒皂液、新潔爾滅等，特殊時期配備快速手部消毒液。另外，耐藥性檢測實驗操作區(qū)內(nèi)應(yīng)安裝足夠數(shù)量的洗眼設(shè)備，重點區(qū)域配備應(yīng)急噴淋裝置。

3設(shè)備和試劑

3.1設(shè)備

實驗室應(yīng)配備的設(shè)備包括：二級生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、低溫冰箱、超低溫冰箱、光學(xué)顯微鏡、比濁儀、高壓滅菌器、細菌鑒定儀、菌液接種儀、定量PCR儀、基質(zhì)輔助激光解吸電離-微生物質(zhì)譜、細菌藥敏結(jié)果分析儀等。各種設(shè)備應(yīng)定期做好驗證、檢定或校準，做好維護和使用記錄；對于溫度依賴的儀器，要做好溫度監(jiān)控記錄；對于壓力容器要每個滅菌包外貼化學(xué)指示膠帶，定期進行生物監(jiān)測。

3.2試劑

實驗室應(yīng)配備的試劑包括：在細菌分離及鑒定過程中涉及的培養(yǎng)基，藥敏實驗的菌株等。購買的培養(yǎng)基、試劑及試劑盒要按照GB 4789.28—2013《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》、SN/T 1538.1—2016《培養(yǎng)基制備指南第1部分：實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則》和SN/T 1538.2—2016《培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南》要求進行驗證，驗證后分類存儲，并建立清單。培養(yǎng)基的配制和使用應(yīng)及時進行記錄。對使用中的試劑制定管理辦法，包括質(zhì)量控制周期和檢測方法。對于染色劑，使用頻率高時每周用陽性和陰性質(zhì)控菌株檢測，使用頻率低時，每次實驗用陽性和陰性質(zhì)控菌株檢測；對于血清試劑，每次實驗時做多價血清陽性和陰性質(zhì)控。

藥敏試驗應(yīng)選用標準菌株，確保檢測結(jié)果的溯源性和穩(wěn)定性。實驗室需要建立完善的記錄文件，包括標準菌株臺賬、標準菌株使用記錄、標準菌株傳代記錄、標準菌株驗證記錄、標準菌株期間核查、標準菌株銷毀記錄等。

在菌種保藏和分類鑒定中，要核查菌種質(zhì)量，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)團、污染或泄漏要立即重新保存。對菌種的操作要有詳細的記錄，要做到每一步實驗有記錄可查。實驗室應(yīng)配備基本的標準菌株，作為標準儲備菌株F1代要在-80℃保存，儲備菌株F2代在-20℃多管保存，工作菌株F3～F5代在4℃冰箱斜面或平板保存。

4樣本采集及運送

4.1樣本來源的確定

對于彎曲菌屬腸球菌屬和腸桿菌屬，樣本主要來自養(yǎng)殖場或屠宰場，對象為雞或豬的糞便；對于葡萄球菌屬，樣本只針對生鮮乳；對于寵物源大腸桿菌和腸球菌，樣品主要來自動物醫(yī)院的寵物犬或貓。樣本的代表性通過以下方法來得到保證：一個圈舍只收集1株一種菌，一個養(yǎng)殖場的樣本分離獲得的菌株收集不超過10株，致病菌收集不超過5株。

4.2采樣單填寫

詳細填寫NY/T 4141—2022《動物源細菌耐藥性監(jiān)測樣品采集技術(shù)規(guī)程》中采樣單內(nèi)容，填寫預(yù)防用抗生素藥的種類與藥物使用方式、治療用抗生素藥物的種類與藥物使用方式，有特殊情況要詳細注明。

4.3樣品的運輸

在運輸中要選用合適的運送培養(yǎng)基。對于大腸桿菌、腸球菌的拭子使用商業(yè)化的運輸培養(yǎng)基即可；沙門氏菌的盲腸和金黃色葡萄球菌的生鮮牛乳不需要運送培養(yǎng)基；彎曲菌最好是在采樣現(xiàn)場直接涂布到分離培養(yǎng)基中。運輸溫度盡量保證在4℃左右，24 h內(nèi)盡快到達實驗室，如若無法準時到達，最多延長到72 h。

4.4樣本接收耐藥性

實驗室對收到的樣本要進行手寫或電腦登記，主要記錄樣本接錄時間，同時粗略判斷樣本狀態(tài)，對于腐爛變質(zhì)和不符合運輸要求的樣本不能接收。

5檢驗過程

目前，耐藥性實驗中對抗生素敏感性測試的方法主要有E-test法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和紙片擴散法等。在這些方法中，肉湯稀釋法的結(jié)果綜合性評定結(jié)果最好，建議實驗室以微量肉湯稀釋法為主，快速檢測時可采用E-test法等。動物源細菌分離純化及耐藥性檢測依據(jù)NY/T 4149—2022《動物源大腸埃希菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4147—2022《動物源腸球菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4146—2022《動物源沙門氏菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4145—2022《動物源金黃色葡萄球菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4148—2022《動物源彎曲桿菌分離與鑒定技術(shù)規(guī)程》、NY/T 4142—2022《動物源細菌抗菌藥物敏感性測試技術(shù)規(guī)程微量肉湯稀釋法》等標準。每次進行藥敏檢測時，都需要跟隨質(zhì)控菌株重復(fù)3～4次，保證結(jié)果的可靠性。

實驗室應(yīng)制定人員比對質(zhì)量控制程序，由多名技術(shù)人員進行專業(yè)性強檢驗項目的考核和比較，定期對工作人員技能素質(zhì)進行驗證，保證檢驗結(jié)果的一致性和準確性，同時還要參加實驗室間比對。參加實驗室間比對和能力驗證不僅是對實驗室檢測能力和分析能力的評判，也是對實驗室質(zhì)量控制效果的考察，更是發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差和標準化實驗室的比對。通過參加能力驗證活動，證實實驗室對耐藥性監(jiān)測程序和方法的有效控制，提高實驗室可信度，完善實驗室質(zhì)量管理體系。同時參加實驗室間比對可確定各實驗室進行某些項目檢測的能力，以及檢測實驗室耐藥性監(jiān)測的持續(xù)能力，有利于實驗室技術(shù)水平的提高。耐藥性實驗室應(yīng)對能力驗證或者不同耐藥性實驗室之間質(zhì)量評估的原始記錄、結(jié)果和證書要實時留存，為實驗室能力體現(xiàn)提供證明。

6檢驗后過程

實驗室應(yīng)制定合理和完善的衛(wèi)生管理制度、廢棄物管理制度、菌種保藏制度、數(shù)據(jù)結(jié)果上報制度，以確保實驗過程符合國家標準的要求規(guī)范。檢驗后的樣本、污染培養(yǎng)基等廢棄物應(yīng)采取合理處理，然后投入指定的容器內(nèi)，經(jīng)無害化處理后方可廢棄，以防對環(huán)境和人員造成危害，以及引起病原微生物的傳播。分離純化獲得的耐藥性菌株應(yīng)遵照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》要求，對菌種、菌株、菌粉制定保管要求，并按規(guī)定嚴格實施，控制好菌種、菌株、菌粉。

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[3]實驗室生物安全通用要求：GB 19489—2008[S].

[4] PATRICK G，ALINA S，AMINT B，et al.Considerations for expanding antimicrobial resistance surveillance networks[J].Clinical Infectious Diseases，2023，77（7）：578-580.

【作者簡介】

韓鐫竹，女，1985年出生，高級畜牧師，碩士，研究方向為動物源細菌耐藥性。

（編輯：劉一童）