摘要：利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化蚯蚓硒的制備工藝條件，研究其對番鴨生長性能、硒沉積規(guī)律和免疫相關(guān)指標(biāo)的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法研究亞硒酸鈉的硒濃度（0、20、40、60、80、100、120、140、 160 mg/kg）、亞硒酸鈉攝食時(shí)間（0、30、60、90 min）對蚯蚓硒中總硒、有機(jī)硒和有機(jī)硒占比的影響，檢測模擬最優(yōu)工藝條件制備蚯蚓硒，并將其用于番鴨養(yǎng)殖，探究其在番鴨中的應(yīng)用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）蚯蚓硒的最佳制備工藝：硒濃度為159.758 mg/kg，放置49.673 min，45 ℃酶解24 h。測得總硒含量、有機(jī)硒含量和有機(jī)硒占比分別為 28.880 mg/kg、24.330 mg/kg 和84.251%。（2）與對照組相比，0.3 mg/kg酵母硒顯著降低番鴨終末重和平均日增重（P<0.05）；0.5 mg/kg 蚯蚓硒顯著增加番鴨的平均日增重（P<0.05）；0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒顯著降低番鴨的耗料增重比（P<0.05）。（3）0.3 mg/kg酵母硒，0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒極顯著增加42 d和56 d肌肉中的硒含量（P<0.01）。此外，0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒組56 d肝臟的硒含量顯著低于0.3 mg/kg酵母硒組（P<0.05）。（4）0.3 mg/kg酵母硒極顯著提高番鴨血清的白細(xì)胞介素2含量（P<0.01）；0.5 mg/kg蚯蚓硒顯著提高番鴨血清的免疫球蛋白G水平（P<0.05），極顯著提高腫瘤壞死因子α水平（P<0.01）。結(jié)果表明，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化蚯蚓硒的制備條件是合理可行的，蚯蚓硒在番鴨肌肉組織中具有顯著的富集效果，且不易于聚積在番鴨的肝臟中，能有效提高番鴨生長性能和免疫功能，是一種安全的硒源補(bǔ)充形式。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)曲面法；蚯蚓硒；番鴨；生長性能；硒沉積；免疫相關(guān)指標(biāo)

中圖分類號：S834.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0214-07

硒是生命體所必需的重要微量營養(yǎng)元素，對清除自由基、延緩衰老、快速增強(qiáng)抵抗力等有重要作用，與機(jī)體健康密切相關(guān)［1］。有機(jī)硒相較于無機(jī)硒，具有毒性低、污染小、轉(zhuǎn)化率高、活性強(qiáng)、易富集等優(yōu)點(diǎn)［2］。蚯蚓可將攝食的無機(jī)硒基本全部轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒［3］。筆者所在課題組在蚯蚓中添加無機(jī)硒（亞硒酸鈉），利用蚯蚓的硒富集和轉(zhuǎn)化能力，將外源性無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為蚯蚓體內(nèi)的有機(jī)硒。隨后，利用蚯蚓本身的水解酶分解蚯蚓蛋白質(zhì)，可得到高營養(yǎng)價(jià)值的蚯蚓硒，其有機(jī)硒占總硒的80%以上，是一種很好的硒源補(bǔ)充方式［4］。將蚯蚓硒作為畜禽飼料添加劑，不僅能實(shí)現(xiàn)畜禽產(chǎn)品的富硒，提高品質(zhì)，提升附加值，還提高畜禽生產(chǎn)性能，這對延伸產(chǎn)業(yè)鏈，推動農(nóng)牧循環(huán)和全面促進(jìn)人類和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有積極的作用。為進(jìn)一步優(yōu)化蚯蚓硒制備的工藝程序，本研究以亞硒酸鈉添加的硒濃度和蚯蚓對亞硒酸鈉的攝入時(shí)間為自變量，以總硒含量、有機(jī)硒含量和有機(jī)硒占比為因變量，利用響應(yīng)曲面法（RSM）分析，通過分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立連續(xù)變量曲面模型，進(jìn)而分析操作因子和響應(yīng)值，得到最優(yōu)參數(shù)值。

現(xiàn)階段，我國畜牧行業(yè)發(fā)展不僅僅著眼于擴(kuò)大生產(chǎn)量，也將重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至如何生產(chǎn)出符合消費(fèi)者要求的高質(zhì)量產(chǎn)品。番鴨作為我國人民重要的肉類食品，具有體型大、生長迅速、耐粗飼、易肥育、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，能夠提供人體所需的多種微量元素［5］。通過在番鴨飼養(yǎng)過程中添加蚯蚓硒生產(chǎn)天然富硒番鴨可成為增加人類每日硒攝取量的有效途徑。因此，本研究以番鴨為研究對象，以蚯蚓硒為飼料添加物，進(jìn)一步探究番鴨體內(nèi)不同組織中硒元素隨日齡增加的沉積規(guī)律，同時(shí)檢測蚯蚓硒對番鴨生長性能和免疫相關(guān)指標(biāo)，以驗(yàn)證蚯蚓硒的安全性和使用效果，為優(yōu)質(zhì)富硒番鴨的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

動物試驗(yàn)于2023年1—2月在江西省贛州市南康區(qū)試驗(yàn)示范基地完成。其余試驗(yàn)于2023年2—4月在贛州市畜牧水產(chǎn)研究所完成。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用經(jīng)牛糞養(yǎng)殖的赤子愛勝蚓（Eisenia foetida，購于定南縣東山嘉禾現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司）；試驗(yàn)番鴨由贛州市畜牧水產(chǎn)研究所的贛南番鴨育種中心提供。

1.3 蚯蚓硒制備

將亞硒酸鈉倒入裝有蚯蚓的燒杯中，使其硒濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140、 160 mg/kg，分別放置0、30、60、90 min，再放入烘箱，45 ℃酶解24 h。過濾、搖勻，采集樣品用于后續(xù)總硒和有機(jī)硒的測定。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert設(shè)計(jì)軟件，采取Box-Behnken試驗(yàn)原理對2個(gè)因素（亞硒酸鈉的硒濃度、攝食時(shí)間）及其水平進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，優(yōu)化單因素、因素的平方項(xiàng)和不同因素間的相互作用項(xiàng)，從而獲得最大響應(yīng)變量，得出最佳的反應(yīng)條件。以總硒含量、有機(jī)硒含量及有機(jī)硒占比為響應(yīng)值，自變量為亞硒酸鈉濃度和蚯蚓對亞硒酸鈉攝入時(shí)間，亞硒酸鈉的硒濃度水平為0、20、40、60、80、100、120、140、160 mg/kg，亞硒酸鈉攝食時(shí)間為0、30、60、90 min。

1.4.2 動物試驗(yàn) 選用1日齡體況良好、體重接近的番鴨900羽，隨機(jī)分成5個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30羽。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，0.3 mg/kg 酵母硒組在基礎(chǔ)飼糧中添加硒含量為0.3 mg/kg的酵母硒，0.1 mg/kg蚯蚓硒組、0.3 mg/kg 蚯蚓硒組和0.5 mg/kg蚯蚓硒組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加硒含量為0.1、0.3、0.5 mg/kg的蚯蚓硒。

1.5 檢測指標(biāo)

試驗(yàn)期過程中，采集試驗(yàn)第14、28、42、56天番鴨的肌肉、糞便用于硒含量的檢測；采集試驗(yàn)第56天番鴨的胸肌、腿肌、心臟、肝臟、十二指腸，用于硒含量的檢測；采集試驗(yàn)第56天番鴨的血清，用于后續(xù)免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.5.1 生長性能測定 分別于飼養(yǎng)第1天和第56天測定番鴨的初生重及終末重，并定時(shí)記錄其采食量，計(jì)算各組的生長性能。供試番鴨生長性能指標(biāo)包括：初生重、終末重、平均日增重、平均日采食量、耗料增重比（平均日采食量/平均日增重）。

1.5.2 總硒的測定 按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.93—2017中電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS法）使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Agilent 7800 ICP-MS）測總硒含量。

1.5.3 有機(jī)硒測定

參照劉軍的試驗(yàn)方法［6］測定有機(jī)硒的含量。有機(jī)硒含量和有機(jī)硒占比計(jì)算方式如下：有機(jī)硒=總硒-無機(jī)硒；有機(jī)硒占比=（有機(jī)硒含量/總硒含量）×100%。

1.5.4 免疫指標(biāo)測定 血清中IgM、IgG含量采用免疫比濁法按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行測定；白細(xì)胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素17（IL-17）含量采用ELISA法測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，選擇Duncans法多重比較組間差異顯著性，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)曲面法優(yōu)化蚯蚓硒制備工藝條件

2.1.1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛿?shù)據(jù) 響應(yīng)曲面試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)以亞硒酸鈉的硒濃度（A）和時(shí)間（B）為自變量，蚯蚓硒的總硒含量、有機(jī)硒含量和有機(jī)硒占比為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)2因素3水平響應(yīng)試驗(yàn)，共36組，所得數(shù)據(jù)和試驗(yàn)因素水平見表1。

2.1.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析 應(yīng)用Design Expert軟件對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模擬，得到總硒、有機(jī)硒和有機(jī)硒占比的函數(shù)表達(dá)式：

Y1=21.22+16.70A-3.87B+4.25AB-5.25A2-10.77B2-1.23A2B-7.33AB2-2.47A3+9.66B3；

Y2=13.84+14.80A+4.03B+4.47AB-2.34A2-7.25B2-2.18A2B-6.79AB2-3.09A3+1.61B3；

Y3=65.60+32.39A+35.28B+11.54AB-14.13A2-14.02B2-12.06A2B-11.72AB2-5.38A3-12.41B3。

式中：Y1為響應(yīng)值（總硒），mg/kg；Y2為響應(yīng)值（有機(jī)硒），mg/kg；Y3為響應(yīng)值（有機(jī)硒占比），%；A為濃度，mg/kg；B為時(shí)間，min。

采用DesignExpert軟件中的ANOVA進(jìn)行響應(yīng)面方差分析。由表2可知，模型中F值分別為37.70、32.87、21.71。P<0.000 1，表明模型對總硒含量、有機(jī)硒含量和有機(jī)硒占比影響極顯著。預(yù)測值與它們對應(yīng)的試驗(yàn)值的R2（總硒）＝0.928 8、變異系數(shù)CV（總硒）為24.81%、調(diào)整相關(guān)系數(shù)值R2adj（總硒）＝0.904 2；R2（有機(jī)硒）＝0.919 2、變異系數(shù)CV（有機(jī)硒）為31.57%、調(diào)整相關(guān)系數(shù)值R2adj（有機(jī)硒）＝0.891 3；R2（有機(jī)硒占比）＝0.882 5、變異系數(shù)CV（有機(jī)硒占比）為18.94%、調(diào)整相關(guān)系數(shù)值R2adj（有機(jī)硒占比）＝0.841 9。各組R2和R2adj接近1，表明構(gòu)建的模型擬合良好，模型選取合理。

由表2可知，對于響應(yīng)值Y（總硒），A、AB、A2、B2、AB2、B3對總硒含量有顯著影響。各因素影響程度由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋喝芤簼舛龋ˋ）、時(shí)間（B）。對于響應(yīng)值Y（有機(jī)硒）， A、AB、B2、AB2對有機(jī)硒含量的影響顯著。各因素影響程度由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋簼舛龋ˋ）、時(shí)間（B）。對于響應(yīng)值Y（有機(jī)硒占比），A、B、AB、A2、B2對有機(jī)硒占比的影響顯著。

2.1.3 響應(yīng)曲面分析 通過構(gòu)建模型預(yù)測蚯蚓硒的總硒、有機(jī)硒和有機(jī)硒占比的三維響應(yīng)面圖和等高線圖。由圖1可知，濃度和時(shí)間的交互作用對總硒含量、有機(jī)硒含量和有機(jī)硒占比影響均顯著，表現(xiàn)為曲面較陡呈鐘罩形、半鐘罩形。通過軟件對試驗(yàn)分析，將總硒和有機(jī)硒設(shè)置最大值，有機(jī)硒占比范圍設(shè)置為80%～100%，進(jìn)行優(yōu)化，模擬預(yù)測結(jié)果，亞硒酸鈉處理蚯蚓制備蚯蚓硒的優(yōu)化條件為亞硒酸鈉的硒濃度為159.758 mg/kg、亞硒酸鈉的攝入時(shí)間為49.673 min。在該條件下總硒濃度和有機(jī)硒濃度最高，為29.929、23.714 mg/kg；有機(jī)硒占比為81.825%，>80%。試驗(yàn)驗(yàn)證值與預(yù)測值偏差為0.265。

2.1.4 條件優(yōu)化及驗(yàn)證 為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法的準(zhǔn)確性，采取上述最優(yōu)參數(shù)組合進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果測得的總硒含量、有機(jī)硒含量和有機(jī)硒占比分別為28.880 mg/kg、24.330 mg/kg和84.251%，相對誤差為1.05%，驗(yàn)證實(shí)際值與優(yōu)化預(yù)測值能夠很好地吻合，表明了模型選擇的準(zhǔn)確性。

2.2 蚯蚓硒在番鴨的應(yīng)用研究

2.2.1 蚯蚓硒對番鴨生長性能的影響 由表3可知，與對照組相比，0.3 mg/kg酵母硒組番鴨的終末重和平均日增重均顯著降低（P<0.05）；0.5 mg/kg蚯蚓硒組番鴨的平均日增重顯著增加（P<0.05）；0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒組番鴨的耗料增重比均顯著降低（P<0.05）。該結(jié)果表明，酵母硒會阻礙番鴨生長性能， 而蚯蚓硒的使用能有效提高番鴨生長性能和經(jīng)濟(jì)效益。

2.2.2 蚯蚓硒對番鴨肌肉硒含量的影響 由表4可知，與對照組相比，使用0.3 mg/kg酵母硒，以及0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒42 d后，肌肉中的硒含量均極顯著增加（P<0.01）；使用0.1 mg/kg蚯蚓硒56 d后，肌肉中的硒含量顯著增加（P<0.05）。

2.2.3 蚯蚓硒對番鴨糞便硒含量的影響 由表5可知，各組番鴨糞便中的硒含量差異均不顯著（P>0.05）。

2.2.4 蚯蚓硒對番鴨體內(nèi)臟器硒含量的影響 由表6可知，56 d后，0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒組肝臟的硒含量均顯著低于酵母硒組（P<0.05）。

2.2.5 蚯蚓硒對番鴨免疫相關(guān)指標(biāo)的影響 由表7可知，與對照組相比， 使用0.3 mg/kg酵母硒番鴨血清的白細(xì)胞介素2含量極顯著升高（P<0.01）；使用0.5 mg/kg蚯蚓硒番鴨血清的免疫球蛋白G含量顯著升高（P<0.05），腫瘤壞死因子α含量極顯著升高（P<0.01）。

3 討論

3.1 蚯蚓硒制備工藝的優(yōu)化

富硒產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展以來，人類缺硒問題不斷被解決，但新的高濃度硒暴露風(fēng)險(xiǎn)也隨之而來［7］。因此，硒源補(bǔ)充的研究不止關(guān)注硒富集量，也重視補(bǔ)硒方式的安全性。蚯蚓具有很強(qiáng)的無機(jī)硒富集和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力，當(dāng)其攝食無機(jī)硒后，可將無機(jī)硒基本全部轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒［8］。有機(jī)硒毒性弱、吸收率較高、活性強(qiáng)、安全性好［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著亞硒酸鈉中硒含量的升高，蚯蚓硒中的硒水平也逐漸升高，通過軟件對試驗(yàn)分析，將總硒和有機(jī)硒設(shè)置最大值，有機(jī)硒占比范圍設(shè)置為 80%～100%，[JP+2]進(jìn)行優(yōu)化，模擬預(yù)測結(jié)果：亞硒酸鈉處理蚯蚓制備蚯蚓硒的優(yōu)化條件為亞硒酸鈉濃度 159.758 mg/kg、蚯蚓攝入亞硒酸鈉的時(shí)間為49.673 min。在該條件下總硒濃度和有機(jī)硒濃度最高，分別為29.929、23.714 mg/kg；有機(jī)硒占比為81.825%。

3.2 蚯蚓硒在番鴨中的應(yīng)用研究

3.2.1 蚯蚓硒對番鴨生長性能的影響 平均日增重指的是受測畜禽在測定期中平均每天增加的重量，體現(xiàn)了畜禽的生長情況［10］。飼料轉(zhuǎn)化率也稱為飼料利用率，是指飼料轉(zhuǎn)化為活重的效率［11］。在番鴨生產(chǎn)中稱為耗料增重比， 為某一年齡段飼料消耗量與增加的體重之比［12］。耗料增重比越低表明番鴨的經(jīng)濟(jì)效益越高［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓硒的使用使番鴨的平均日增重顯著增加，耗料增重比顯著下降，該結(jié)果表明，蚯蚓硒的使用能有效提高番鴨生長性能和經(jīng)濟(jì)效益。此外，酵母硒的使用顯著降低了番鴨的終末重和平均日增重，該結(jié)果表明酵母硒的使用不利于番鴨的生長發(fā)育。

3.2.2 蚯蚓硒對番鴨體內(nèi)硒水平的影響 硒元素遍布動物組織器官，在機(jī)體內(nèi)廣泛分布。本研究發(fā)現(xiàn)，在番鴨機(jī)體內(nèi)各組織器官硒濃度由高到低為：肝臟>十二指腸>心臟>肌肉。此外，硒元素作為一種微量元素，若在體內(nèi)沉積過多會出現(xiàn)中毒［14］。本研究結(jié)果表明，蚯蚓硒的使用可使硒在肝臟中的沉積量顯著低于酵母硒組，該結(jié)果表明，蚯蚓硒的使用可減少硒在肝臟中的積累，有效降低硒中毒風(fēng)險(xiǎn)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，酵母硒的使用可導(dǎo)致硒在番鴨肝臟中顯著增加，該結(jié)果表明，酵母硒對番鴨肝臟可能有一定的損傷作用， 這可能是酵母硒導(dǎo)致番鴨生長性能降低的原因之一。

3.2.3 蚯蚓硒對番鴨免疫功能的影響 炎癥反應(yīng)是機(jī)體對抗外界病原體等因素造成組織損傷所進(jìn)行的一個(gè)正常生理反應(yīng)，促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2等的含量可反映機(jī)體炎癥水平［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，酵母硒的使用可使番鴨的IL-2水平顯著提高，該結(jié)果表明酵母硒的使用有可能引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，這可能是酵母硒導(dǎo)致番鴨56日齡體重顯著降低的原因之一，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。免疫球蛋白G（IgG）是血清中免疫球蛋白的主成分，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫調(diào)節(jié)的功能［16］。腫瘤壞死因子α（TNF-α）能夠抑制腫瘤細(xì)胞，具有抗感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用［17］。因此，試驗(yàn)結(jié)果中免疫球蛋白G和腫瘤壞死因子α水平的增加表明了番鴨機(jī)體免疫功能的提高，以上結(jié)果表明蚯蚓硒對番鴨的免疫功能有積極促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

蚯蚓硒有效提高了番鴨平均日增重、肌肉中的硒含量、血清中IgG和TNF-α的水平，降低了番鴨的耗料增重比。因此，本研究中制備的蚯蚓硒能夠有效提高番鴨的生長性能和免疫功能，為番鴨提供優(yōu)質(zhì)硒蛋白，在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)和醫(yī)藥中的硒水平方面具有重要的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

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基金項(xiàng)目：江西省高層次高技能領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目（編號：贛人社發(fā)〔2022〕34號）；贛州市科技計(jì)劃（編號：贛市科發(fā)〔2021〕24號、贛市科發(fā)〔2022〕31號）。

作者簡介：劉珍妮（1994—），女，福建省泉州人，碩士，畜牧師，主要從事動物營養(yǎng)與動物疫病研究。E-mail：746178508@qq.com。

通信作者：雷小文，碩士，副研究員，主要從事動物營養(yǎng)與動物疫病研究。E-mail：343224896@qq.com。