摘要：為了解我國克氏原螯蝦不同地理群體的種屬差異，加快克氏原螯蝦的育種進(jìn)程，篩選與目標(biāo)性狀緊密相關(guān)位點的基因型進(jìn)行分子輔助選育，選取安徽巢湖、江西鄱陽湖、山東微山湖、湖南洞庭湖、湖北洪湖、江蘇洪澤湖6個地區(qū)的克氏原螯蝦樣品，對全長、體長、體重、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹部長、腹部寬、尾扇長8個形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測量，以2個形態(tài)參數(shù)比進(jìn)行多元分析；并根據(jù)標(biāo)記位點鑒定出的個體基因型，與測量到的形態(tài)指標(biāo)的差異進(jìn)行生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，分析出克氏原螯蝦重要的經(jīng)濟(jì)性狀肌肉重、腹部寬、頭胸甲寬等和與之相關(guān)的標(biāo)記位點。聚類分析表明，6個地區(qū)的克氏原螯蝦分為2個分支，第1分支為巢湖群體和洪湖群體；鄱陽湖群體、微山湖群體、洞庭湖群體和洪澤湖群體構(gòu)成第2分支。主成分分析結(jié)果顯示，雌蝦的4個主成分累計貢獻(xiàn)率達(dá)85.10%，其中，第1和第2主成分分別是腹長因子和腹寬因子；雄蝦的4個主成分累計貢獻(xiàn)率達(dá)86.31%，第1和第2主成分分別為頭胸甲和腹部因子。判別分析中，雌性綜合判別率為82.16%，雄蝦為83.28%，判別率較高。關(guān)聯(lián)分析表明，14對分子標(biāo)記的連鎖不平衡共有105對SSR位點組合，滿足P<0.01的條件，14對SSR引物在168份克氏原螯蝦材料中存在連鎖不平衡，可與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。采用一般線性模型對克氏原螯蝦種質(zhì)的6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀同SSR位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在P<0.01的閾值條件下，存在1組引物關(guān)聯(lián)多個性狀的情況，共檢測到30組引物對6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀呈極顯著關(guān)聯(lián)狀態(tài)。由此可以豐富克氏原螯蝦群體關(guān)聯(lián)位點的篩選，并在一定程度上為克氏原螯蝦種質(zhì)資源的保護(hù)和親本選育工作提供支持。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；形態(tài)差異；微衛(wèi)星標(biāo)記；關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號：S968.22+9.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0203-11

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）別稱小龍蝦，屬于甲殼綱、十足目、螯蝦科，是一種能在淡水中穩(wěn)定生存并加以繁衍的生物［1］，在20世紀(jì)初被當(dāng)作牛蛙餌料從美國引進(jìn)至日本，后又在20世紀(jì)中從日本傳入我國南京，并迅速擴(kuò)散至我國大部分省份，在我國眾多湖泊水域中迅速繁衍［2-3］。因其肉質(zhì)松軟、營養(yǎng)全面、食療效果佳，而成為一種深受大眾消費和喜愛的餐桌美食，并且由于其頭部酶系統(tǒng)高效且發(fā)達(dá)［4］，所以在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用十分廣泛［5］，常用于制備乳液、脂質(zhì)體及微膠囊等運載體系［6］。在這種大背景下，小龍蝦養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)收益顯著，前景十分廣闊，現(xiàn)已成為我國最具發(fā)展?jié)摿Φ酿B(yǎng)殖品種之一［7-8］。但其在養(yǎng)殖過程中對親本選育的重視性不足，未能很好地保護(hù)環(huán)境，造成野生種群數(shù)量的日益減少，品種資源保護(hù)不到位，種質(zhì)退化嚴(yán)重［9］，小龍蝦頭大尾小、含肉率低等［10］問題，均會影響到小龍蝦養(yǎng)殖市場的前景，從而影響小龍蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，迫切需要以野生種質(zhì)克氏原螯蝦種質(zhì)為研究對象，以關(guān)聯(lián)分析為主要方法，挖掘與性狀相關(guān)聯(lián)的基因位點，從而加速克氏原螯蝦的品種改良。

為達(dá)此目的，首先需要對我國現(xiàn)有的克氏原螯蝦群體進(jìn)行鑒別，進(jìn)而保護(hù)種質(zhì)資源合理利用。對于種質(zhì)資源鑒別，從業(yè)人員首先需要對我國存在的主要自然水域的天然群體進(jìn)行形態(tài)差異性的鑒別。該方法直觀、簡單、快速，能非常有效地反映不同地理種群之間的差異［11］，并且容易被廣大從業(yè)人員所理解。國內(nèi)關(guān)于克氏原螯蝦形態(tài)學(xué)的研究已有較多的報道，張龍等利用通徑分析分析了影響克氏原螯蝦體重的若干因素，得出頭胸甲長是影響克氏原螯蝦體重的最大因素，其次是全長和頭胸甲寬，為克氏原螯蝦親本選擇和改良育種帶來了幫助［12］。田燦等采用形態(tài)學(xué)測量和地表點法分析江蘇、江西、湖北、上海和河南5個地區(qū)克氏原螯蝦形態(tài)差異，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過長時間地理隔離，各地區(qū)克氏原螯蝦遺傳分化較嚴(yán)重，不同地區(qū)各群體形態(tài)差異明顯，差異主要集中在頭胸甲和腹部，大大簡化了克氏原螯蝦生產(chǎn)選育過程中群體的鑒別［13］。徐濱等利用多元統(tǒng)計分析方法分析了盱眙、合肥、沅江、武漢、潛江和沙市6個克氏原螯蝦群體的10項生態(tài)學(xué)指標(biāo)，6個群體的形態(tài)參數(shù)差異顯著，并根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果分出潛江、沅江、武漢群體，沙市、合肥群體及盱眙群體3大分支群，盱眙龍蝦群體較其他群體遺傳距離較遠(yuǎn)，可直接從形態(tài)上同其他群體進(jìn)行區(qū)分［14］。但以上研究仍有一定局限性，如試驗方法單一及選點分布集中于單一或少數(shù)的省份，尚未就全國范圍內(nèi)典型水域的野生克氏原螯蝦群體開展研究。

其次，以往的研究表明，與生長相關(guān)的性狀（體質(zhì)量、體長等）是受微效多基因控制和環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀［15-17］。因此，尋找控制這些數(shù)量性狀的基因和標(biāo)記，建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，是縮短時代間隔、加快育種進(jìn)展的有效方法之一，可提高克氏原螯蝦育種的速度和效率。微衛(wèi)星標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、共顯性、穩(wěn)定性好等特點，已被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的性狀相關(guān)分子標(biāo)記篩選、QTL定位［18］、遺傳圖譜的構(gòu)建［19］、群體遺傳學(xué)、物種遺傳多樣性的研究［20］、疾病的檢測［21］及親本分析［22］等方面。許多研究有所涉及，如張義鳳等報道了鯉魚主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的7個微衛(wèi)星標(biāo)記［16］。王洪哲等對24個微衛(wèi)星位點與鏡鯉主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)性進(jìn)行分析［23］。孫新等共獲得4個與鏡鯉體質(zhì)量、體長相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記［24］。李建林等在30個微衛(wèi)星中發(fā)現(xiàn)位點GM041、UNH860、GM304的AA基因型及位點GM519的DE基因型可作為羅非魚以體質(zhì)量為選育目標(biāo)的輔助標(biāo)記［25］。但對克氏原螯蝦的相關(guān)分析較少，在分子生物學(xué)技術(shù)未成熟以前，研究者們對克氏原螯蝦的研究常集中在養(yǎng)殖、營養(yǎng)和病害方面［26］，而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，越來越多的研究人員開始利用微衛(wèi)星技術(shù)進(jìn)行克氏原螯蝦遺傳多樣性的研究，如高楊等基于微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行克氏原螯蝦種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析［27］；彭剛等利用SSR分析了安徽巢湖、江西鄱陽湖、江蘇洪澤湖3大淡水湖內(nèi)養(yǎng)殖的克氏原螯蝦遺傳多樣性［28］；費騰等利用SSR對比分析了洪澤湖、長江野生湖以及塘封閉水體內(nèi)養(yǎng)殖的克氏原螯蝦等［29］。但以上研究選點區(qū)域內(nèi)仍有一定局限性，如選點分布集中于單一或少數(shù)的省份，尚未就全國范圍內(nèi)典型水域的野生克氏原螯蝦群體開展研究。

關(guān)聯(lián)分析作為研究數(shù)量性狀行之有效的研究方法，是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，用于鑒定目標(biāo)表型性狀和具有特定功能的基因位點［30］。相較于QTL定位，關(guān)聯(lián)分析的精確度更高，耗時少、檢測廣度大，更重要的是可同時研究同一位點的多個等位基因的優(yōu)勢［31］，現(xiàn)已廣泛用于凡納濱對蝦［32］、草魚［33］、大西洋鮭魚等具有經(jīng)濟(jì)價值的水產(chǎn)物種［34］，皆已取得良好的效果，但在這方面對克氏原螯蝦的研究甚少。目前，水產(chǎn)生物的育種研究仍以傳統(tǒng)的選擇育種和雜交育種為主，分子標(biāo)記育種作為輔助育種手段，對于克氏原螯蝦也是如此，可快速找到同目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的基因或分子標(biāo)記，因而受到廣泛應(yīng)用，然而，其結(jié)果的準(zhǔn)確性也受到多重因素的影響。其中，群體結(jié)構(gòu)是影響關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的重要因素，不同群體的混入會造成整個群體內(nèi)連鎖不平衡的強度增強，進(jìn)而影響不連鎖的基因位點與性狀間的關(guān)聯(lián)，得出假陽性的結(jié)果。因此，群體結(jié)構(gòu)越簡單，關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果也更可靠［35］。此外，連鎖不平衡作為關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)，對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性同樣有影響，連鎖不平衡的結(jié)果受到遺傳漂變和自然選擇等因素的影響。

因此，本研究分別利用主成分分析、判別分析、聚類分析3種多元分析方法分析了6個不同地區(qū)克氏原螯蝦的形態(tài)差異；主成分分析可以判斷各種性狀指標(biāo)對群體的貢獻(xiàn)率，判別分析則可對不同的群體進(jìn)行統(tǒng)一的分類；聚類分析可以明晰各群體的分支。本研究基于3種分析方法，對我國不同地理區(qū)域的群體克氏原螯蝦的差異性加以了解，同時可反映在長期地理隔離下，不同自然水域克氏原螯蝦的形態(tài)差異變化和彼此間的親緣關(guān)系；并且把體質(zhì)量、全長、體長、腹部長、頭胸甲長等相關(guān)性性狀作為克氏原螯蝦傳統(tǒng)育種的主要選擇依據(jù)，利用通過結(jié)合高通量測序信息綜合分析獲得的SSR分子標(biāo)記對這些性狀加以關(guān)聯(lián)，尋找關(guān)聯(lián)印記。本研究方法將是經(jīng)濟(jì)有效的用于輔助選擇、提高育種效率、加快育種進(jìn)程的重要方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6組克氏原螯蝦野生群體分別采集自江蘇洪澤湖（HZH）、湖北洪湖（HH）、湖南洞庭湖（DTH）、山東微山湖（WSH）、安徽巢湖（CH）、江西鄱陽湖（PYH）的同一水系條件下，從捕撈的個體中挑選出形態(tài)大小相同、個體無明顯差異及健康無殘肢的蝦體作為研究對象，各組群體蝦的樣本量為30，為減少數(shù)據(jù)帶來的宏觀測量誤差，所有采集到的活體樣本就近完成采樣工作。

1.2 測量形態(tài)指標(biāo)與分析

1.2.1 形態(tài)指標(biāo)測量

使用測量工具對每尾克氏原螯蝦的7項指標(biāo)，包括全長、體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹部長、腹部寬和尾扇長，進(jìn)行準(zhǔn)確測量，并保證其測量結(jié)果精確值在0.01 cm（圖1）；用天平稱量每尾蝦體重、肝胰腺重、肌肉重3項重量指標(biāo)，稱量結(jié)果精確至0.01 g。

1.2.2 聚類分析

為科學(xué)合理地對比各野生群體生長性能、品質(zhì)優(yōu)劣，以盡可能消除不同蝦體規(guī)格、生長周期帶來的誤差干擾，待所有指標(biāo)數(shù)據(jù)測量統(tǒng)計完成后，采用多組次的2項性狀指標(biāo)比例參數(shù)作為衡量形態(tài)差異的主要依據(jù)，具體比例參數(shù)指標(biāo)見表1。測出的各項生長表型指標(biāo)，以群體作為單位區(qū)分，錄入Excel 2010軟件，然后利用Excel 2010軟件計算出各組各指標(biāo)的平均值，隨后進(jìn)行聚類分析。聚類分析中的類別抽樣為層次聚類分析中的O型聚類，分析方法為歐氏距離最短系統(tǒng)距離法［36］。

1.2.3 主成分與判別分析

聚類分析中的12個數(shù)據(jù)指標(biāo)被劃分為能夠充分反映母系信息的相對獨立指標(biāo)，從而避免了變量之間存在的共線性問題。在進(jìn)行分析前，為了消除各群體之間生長期不同導(dǎo)致的個體大小偏差影響，本研究利用SPSS 16.0軟件對6個種群的168個樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗。以各自形態(tài)的相對變量之間的比值作為度量形式，繼續(xù)使用SPSS 16.0軟件對12個形狀的比例系數(shù)進(jìn)行分析，以得到各自的特征值、主成分的貢獻(xiàn)率及累計貢獻(xiàn)率，從而來判斷出不同類群間的形態(tài)差異，分析出性狀對形態(tài)差異的影響［37］。

根據(jù)測定的參考指標(biāo)對群體進(jìn)行分類，從而建立出判別函數(shù)，根據(jù)判別函數(shù)的樣品來源不同來進(jìn)行分類，采用距離判別方法，判別準(zhǔn)確率則是由樣品中判別正確的尾數(shù)占此群體實際尾數(shù)的百分比來進(jìn)行判斷［38］。在群體中，綜合判別率為判別正確的尾數(shù)占實際尾數(shù)的比例。

1.3 基因型與關(guān)聯(lián)分析及遺傳效應(yīng)評估

總基因組DNA提取采用苯酚/三氯甲烷法［39］提取尾節(jié)組織的總基因組DNA，DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗純度，紫外分光光度計測定D260 nm和D280 nm濃度，合格的DNA稀釋濃度至50.00 ng/mL，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

參考GenBank已發(fā)表的微衛(wèi)星序列及本實驗室自行開發(fā)的微衛(wèi)星序列共14對（表2），正向引物的5′端FAM標(biāo)記委托無錫天霖生物有限公司加以合成。PCR反應(yīng)總體系為DNA模板 2.0 μL，Taq酶12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，最后加滅菌的超純水至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序為 94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃變性10 s，在最適退火溫度下退火10 s，72 ℃延伸15 s，30個循環(huán)；最后72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過ABI3730XL測序儀（美國ABI公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，通過geneMarker軟件進(jìn)行基因型分型。

本研究利用14對分子標(biāo)記、6項表型性狀數(shù)據(jù)和2項質(zhì)量性狀數(shù)據(jù)對供試的168尾克氏原螯蝦資源進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，再根據(jù)判別分析篩選的主要變量進(jìn)行具體分析。首先，利用Excel軟件對168尾克氏原螯蝦的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用Tassel 2.1軟件計算14個位點間的連鎖不平衡，使用SPSS 22.0軟件對基因型數(shù)據(jù)和生長數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，分析采用一般線性模型（general linear model，GLM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 6個不同地理群體外形指標(biāo)分析及其聚類分析

外形指標(biāo)分析通過比較不同個體間的外形指標(biāo)差異，達(dá)到區(qū)分雌雄個體的作用。對于克氏原螯蝦而言，雌雄個體在腹部、頭胸甲部存在明顯的差異。為探明6個不同群體的雌雄克氏原螯蝦外形指標(biāo)間的差異性，對6個不同地區(qū)的雌雄蝦體形態(tài)參數(shù)進(jìn)行了測量，由表3可知，雌雄個體存在多項指標(biāo)參數(shù)相同的情況，如A2頭胸甲長/體長、A3頭胸甲寬/體長、A4腹部長/體長、A5腹部寬/體長、A6尾扇長/體長、A11肌肉重/體重、A12肝胰腺重/體重。A8腹部寬/頭胸甲寬在各群體中均出現(xiàn)雌性>雄性的現(xiàn)象；A10腹部長/腹部寬則相反，呈現(xiàn)雄性>雌性的現(xiàn)象。由以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌雄克氏原螯蝦個體在體態(tài)區(qū)別最明顯的特征呈現(xiàn)在腹部。

聚類分析可很好地辨別不同群體的分支和來源，對于群體的溯源有著重要的作用。為了探明6個群體的來源分支情況，本研究對6個群體進(jìn)行聚類分析，從而為物種遺傳多樣性的保護(hù)提供價值。由圖2可知，雌雄6個群體可分為2個主要分支，第1分支為巢湖群體和洪湖群體，其間形態(tài)差異較??；第2分支則較為復(fù)雜，先由遺傳距離最短的鄱陽湖群體和微山湖群體聚為一類，然后再同洞庭湖群體相聚類，最后與洪澤湖群體聚類，4個群體共同聚為一支。鄱陽湖群體和微山湖群體相似度更近于分支內(nèi)的其他群體。洪澤湖群體相較鄱陽湖群體和微山湖群體有著較遠(yuǎn)的遺傳距離，其間形態(tài)差異較大。鄱陽湖群體和微山湖群體相近度更近于分支內(nèi)的其他群體。第1分支與第2分支聚類，反映了分支內(nèi)群體間最遠(yuǎn)的遺傳距離。聚類分析表明，6個不同水域群體的形態(tài)不同，地理區(qū)域的差異也如此。

2.2 主成分與判別分析

主成分分析可研究判斷出各種主成分的貢獻(xiàn)率，選擇出對物種影響較大的幾項外形指標(biāo)，可在一定程度上為育種提供一定參考借鑒。為探究出對克氏原螯蝦影響最大的外形指標(biāo)， 本研究以6個不同水域克氏原螯蝦野生種群的形態(tài)參數(shù)為材料進(jìn)行主成分分析，獲得了方差貢獻(xiàn)率最大的4個主成分因子。由表4可知，各組成部分對應(yīng)的特征值和累計貢獻(xiàn)率，雌蝦和雄蝦4個主成分的累計貢獻(xiàn)率分別為85.10%和86.31%。雌蝦、雄蝦4個主成分的累積貢獻(xiàn)率較高，包含了大部分的變異相關(guān)信息，可作為獨立因子反映不同地區(qū)克氏原螯蝦野生種群的形態(tài)特征。

雌雄群體主成分特征值及累計貢獻(xiàn)率存有差異。就雌蝦而言，雌蝦的第1主成分特征值為4.17，方差貢獻(xiàn)率42.30%，其中，起主要作用的指標(biāo)是腹部長/腹部寬（A10），反映了克氏原螯蝦的腹部特征，稱為腹長因子；第2主成分的特征值為2.12，方差貢獻(xiàn)率23.32%，起主要作用的是腹部寬/頭胸甲寬（A8），稱為腹寬因子；第3主成分的主要作用是頭胸甲長/頭胸甲寬（A9），稱為頭胸甲因子；第4主成分主要反映腹部長/體長（A4）。雄蝦的第1主成分特征值為3.97，方差貢獻(xiàn)率39.14%，起主要作用的是頭胸甲長/頭胸甲寬（A9）、頭胸甲長/體長（A2），鮮明地反映了頭胸甲特性。第2主成分特征值2.17，方差貢獻(xiàn)率24.64%，起主要作用的是腹部長/體長（A4）、腹部長/腹部寬（A10），反映克氏原螯蝦的腹部特性。第3主成分主要作用是頭胸甲長/體長（A2）。第4主成分主要反映腹部長/體長（A4）。根據(jù)以上論述，由此發(fā)現(xiàn)，腹部長、腹部寬、頭胸甲長、頭胸甲寬、體長可作為區(qū)分不同群體克氏原螯蝦的重要指標(biāo)依據(jù)。此外，雌蝦因獨特的生理特征，尾扇部位作為抱卵場所，較為發(fā)達(dá)，可作為區(qū)分雌性群體的重要指標(biāo)。雄性個體螯足更發(fā)達(dá)，體重可作為區(qū)分群體的重要指標(biāo)。

由表5可知，6組雌蝦群體中，第1主成分貢獻(xiàn)率最高的是洪湖群體（39.17%），最低的是洪澤湖群體（35.72%）；4個主成分累計貢獻(xiàn)率最高的是鄱陽湖群體（88.36%），最低的是洪澤湖群體（83.12%）。雄蝦群體中，第1主成分貢獻(xiàn)率最高的是洞庭湖群體（38.14%），最低的是洪澤湖群體（34.18%）；4個主成分累計貢獻(xiàn)率最高的是微山湖群體（87.64%），最低的是洪澤湖群體（85.16%）。

F檢驗判別分析結(jié)果表明，群體判別分析的結(jié)果均較好（P<0.01）。從12項性狀比值中篩選出用于區(qū)分不同野生克氏原螯蝦群體的幾個主要變量，其中對雌性群體具有顯著貢獻(xiàn)的有A1、A7、A8、A9、A10 5 項變量，這5個變量群體的判別準(zhǔn)確率高，判別效果良好，具有顯著性意義。對雄性群體則篩選出了A1、A7、A9、A10、A11 5 組變量，以此5組變量建立起的判別方程用于判別雄性群體的效果較好。通過代入雌雄各5組性狀的數(shù)值到判別方程中，即可確定相應(yīng)個體所對應(yīng)的群體。由表6可知，雌性群體中判別率最高的是洪澤湖群體（89.92%），最低的是微山湖群體（73.28%），綜合判別率83.16%；雄性群體中，判別率最高的是洞庭湖群體（92.14%），最低的是巢湖群體（72.18%），綜合判別率87.28%。

2.3 一般線性模型分析及性狀比值指標(biāo)與標(biāo)記位點的關(guān)聯(lián)分析

由表7可知，本研究采用一般線性模型對克氏原螯蝦種質(zhì)的6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀同SSR位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在P<0.01的閾值條件下，存在1組引物關(guān)聯(lián)多個性狀的情況，共檢測到30組引物對6個表型性狀和2個質(zhì)量性狀呈極顯著關(guān)聯(lián)狀態(tài)。其中，體長性狀與5組引物呈極顯著關(guān)聯(lián)，5組引物分別是PCLG02、PCLG10、PCLG27、Transcript1和Transcript4024，是關(guān)聯(lián)引物數(shù)目最多的性狀；全長、腹部長、腹部寬、肌肉重4個性狀分別與4組引物相關(guān)聯(lián)；體重、頭胸甲長、頭胸甲寬3個性狀同3組引物相關(guān)聯(lián)。

為更精確地得到性狀與標(biāo)記位點的關(guān)聯(lián)性，消除生長周期等外在物理條件因素對關(guān)聯(lián)結(jié)果造成的影響，本研究根據(jù)判別分析篩選的5組變量，特采用2項生長性狀的比值作為衡量指標(biāo)進(jìn)行位點關(guān)聯(lián)性的分析。在P<0.01的條件下，同樣存在1組標(biāo)記與多組性狀比值指標(biāo)有關(guān)聯(lián)，共檢測出40組引物與6項比值性狀指標(biāo)有極顯著關(guān)聯(lián)，其中，肌肉重/體質(zhì)量（A11）有著最多關(guān)聯(lián)標(biāo)記數(shù)量，達(dá)到12組，分別為PCLG02、PCLG08、PCLG10、PCLG13、PCLG27、PCLG33、PCLG48、Transcript1、Transcript2011、Transcript4024、Transcript8060、Transcript13127。其余5項指標(biāo)分別是全長/體長（A1）、頭胸甲寬/體長（A3）、腹部寬/體長（A5）、頭胸甲長/頭胸甲寬（A9）、腹部長/腹部寬（A10），與這些比值性狀相關(guān)聯(lián)的引物見表8。就已得出的標(biāo)記和性狀間的關(guān)聯(lián)性，以克氏原螯蝦最含經(jīng)濟(jì)價值的肌肉重、腹寬、頭胸甲寬性狀而言，肌肉重/體重這項比值指標(biāo)與PCLG02、PCLG08、PCLG10、PCLG28、PCLG33、PCLG48、Transcript8060、Transcript13130這些引物標(biāo)記極顯著相關(guān)。腹部寬/頭胸甲寬這項指標(biāo)與PCLG10、PCLG48、Transcript8060這些標(biāo)記極顯著相關(guān)。

2.4 6個群體Hardy-Weinberg平衡分析和連鎖不平衡檢驗

連鎖不平衡（LD）作為關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)，反映了同一染色體上或不同染色體間不同基因座等位基因非隨機(jī)關(guān)聯(lián)的結(jié)果，其結(jié)果水平反映了連鎖的緊密程度，連鎖越緊密相應(yīng)所需的分子標(biāo)記就越少［40］。14對分子標(biāo)記的連鎖不平衡共有105對SSR位點組合，從分析結(jié)果來看，滿足P<0.01的條件，所選用的14對SSR引物在168份克氏原螯蝦材料中存在連鎖不平衡，可與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。將所有標(biāo)記的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析，由表9可知，沒有1對位點在6個群體中均符合哈代溫伯格平衡，各位點在各群體中均存在明顯哈代溫伯格平衡偏離現(xiàn)象。其中，PCLG10位點僅在2個群體中存在哈達(dá)溫伯格平衡偏離，其余13對標(biāo)記位點均在2個以上群體的基因型分布偏離Hardy-Weinberg平衡，已知所取的14對位點基因型純合率較高，表明標(biāo)記位點內(nèi)存在嚴(yán)重的雜合子缺失現(xiàn)象，同時各群體間近親雜交的現(xiàn)象明顯，須采取適當(dāng)措施以防止野生種資源生物多樣性降低。

對6組克氏原螯蝦群體進(jìn)行連鎖不平衡檢測，共檢測到59個基因座位對，其中，巢湖群體和洪澤湖群體均存在6個連鎖座位對的不平衡狀態(tài)，鄱陽湖群體是連鎖座位對處于不平衡狀態(tài)最少的群體，僅為2對，同時，各個群體處于不平衡狀態(tài)時相應(yīng)的連鎖座位對并不相同。對于整個群體而言，一共檢測到9個連鎖座位對處于不平衡狀態(tài)。

3 討論

多元分析方法已被廣泛用于遺傳變異的研究，并已取得較好的效果。國內(nèi)很多學(xué)者采用了多元分析方法進(jìn)行魚蝦蟹類的分析，其中，包括對日本沼蝦［41-42］、凡納濱對蝦種群［43］、日本對蝦［44］、中國白蝦［45］、中華絨螯蟹［46］、青蝦［45］和大黃魚［47］等的形態(tài)分析研究，但對克氏原螯蝦的形態(tài)學(xué)的分析較少。在少數(shù)對克氏原螯蝦形態(tài)分析的研究中，田燦等基于圖像識別對5個不同產(chǎn)地克氏原螯蝦進(jìn)行了形態(tài)差異分析［13］。而本研究則是通過3種多元分析方法，深入研究大家涉及較少且更大范圍的克氏原螯蝦群體，去更加細(xì)致地分析不同群體克氏原螯蝦的差異及在不同自然水域中群體呈現(xiàn)的形態(tài)差異。

聚類分析方法可對不同群體進(jìn)行初步的分類，聚類之間距離則表現(xiàn)為不同群體親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近［48］。本研究顯示，所挑選的6組克氏原螯蝦群體在形態(tài)差異上均產(chǎn)生一定的變異，可從形態(tài)上進(jìn)行一定的區(qū)分。從聚類的結(jié)果來看，巢湖群體和洪湖群體形狀差異最小，親緣關(guān)系相近，相互集為一支，棲息在共同的長江水域下不受地理隔離障礙的影響。鄱陽湖、微山湖、洞庭湖和洪澤湖最后再聚為一支。聚類結(jié)果表明，長江中游棲息的克氏原螯蝦群體與其他水系群體的親緣關(guān)系不近，同時本次聚類顯示的洪澤湖群體、微山湖群體、鄱陽湖群體的聚類結(jié)果與地理分布并不一致，可能與克氏原螯蝦近些年來養(yǎng)殖規(guī)模日益龐大，不同屬地的克氏原螯蝦以苗種或成蝦的形式銷售進(jìn)入其他水域環(huán)境中，當(dāng)?shù)氐乃w環(huán)境為克氏原螯蝦代代繁衍提供了條件。

主成分分析方法利用多個變量進(jìn)行線性變換，創(chuàng)造出一些代表性的因子變量，各因子變量間相關(guān)性較低，通過少數(shù)變量代替原先多變量［49］，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物的形態(tài)分析，成果顯著。如韓曉磊等應(yīng)用主成分分析反映了克氏原螯蝦和東北螯蝦身體寬度形態(tài)變化［50］。本研究的主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹部長、腹部寬、頭胸甲寬、體長是對6組群體形態(tài)影響最大的性狀因子。頭胸甲作為攝食部位，腹部作為游泳運動部位，承擔(dān)克氏原螯蝦的大部分生命活動，同時受環(huán)境影響。食物作為生物生長不可或缺的條件，在食物獲取不充足時，野生克氏原螯蝦為了尋找更多的食物［51］會發(fā)生同性相殘的現(xiàn)象，發(fā)生了不同程度的優(yōu)勝劣汰，全長較長的個體更容易得以保留。這4項形狀指標(biāo)作為分析形狀中進(jìn)化速度相對較快的性狀，可用于辨別群體。此外，本研究將所有重要指標(biāo)按體長劃分進(jìn)行校對改正，分開對雌雄群體進(jìn)行處理，避免誤差。其中，影響雌蝦的性狀主要是腹長、腹部和體長，而影響雄蝦則是頭胸甲寬、腹部寬和體長。此結(jié)果與6個種群中雄性的胸甲寬度/體長指數(shù)（A3）均大于雌性的結(jié)果一致。同時，對雌蝦來說，尾扇長度也對形態(tài)有一定的影響，雄蝦的體重也對自身形態(tài)有一定影響。

另一種通過觀察樣本數(shù)據(jù)建立線性函數(shù)的群體鑒定方法為判別分析。以構(gòu)建的線性函數(shù)，計算單因子F值的大小，完成對未知樣品的初步分類［52-53］。本研究得到的連鎖不平衡水平較低，有效的連鎖不平衡對數(shù)僅占全部位點組合的13.26%。連鎖不平衡水平較低，可能是個體間出現(xiàn)近親雜交引起有效重組率較低；另外標(biāo)記數(shù)量的覆蓋范圍不足，留下較大的空白遺傳距離也會對結(jié)果準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。未來隨著高通量測序的進(jìn)一步發(fā)展，在此基礎(chǔ)上，評估衰減率達(dá)到增加標(biāo)記覆蓋率的效果，可促進(jìn)精準(zhǔn)定位［54］。

各數(shù)量性狀間常會表現(xiàn)出某種特定的關(guān)聯(lián)性。就[CM（21]本研究而言，對來自6個地區(qū)的168尾克氏原螯蝦自然群體進(jìn)行表型性狀和品質(zhì)性狀的調(diào)查和測定，采用SSR標(biāo)記對所選個體進(jìn)行分子標(biāo)記的分析，對供試樣本的多個生長性狀與相關(guān)標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，尋找生長性狀的可靠相關(guān)位點，根據(jù)之前報道過的結(jié)合本實驗室自行開發(fā)的14對克氏原螯蝦SSR分子標(biāo)記，在168份樣品中共檢測到等位基因124個，各群體不同標(biāo)記位點的等位基因數(shù)（Na）在3～14，有效等位基因數(shù)在1.00～5.16，平均期望雜合度為0.81，平均多態(tài)信息含量分布在0.42～0.59，證明所選的引物多態(tài)性較高，同時選用試驗材料遺傳多樣性豐富。對所有克氏原螯蝦樣本的SSR位點進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測到多對標(biāo)記與克氏原螯蝦生長相關(guān)聯(lián)，如PCLG02、PCLG08、PCLG10、PCLG13、PCLG27、PCLG33、PCLG48、Transcript1、Transcript2011、Transcript4024、Transcript8060、Transcript13127，同時存在1組標(biāo)記與多對生長性狀相關(guān)聯(lián)，充分闡釋了多基因共顯性作用，可為選擇性選育工作提供參考。另外，在同一組標(biāo)記下，不同基因型的個體對自身生長性狀也會產(chǎn)生影響。

因此了解到克氏原螯蝦體重與體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹部長呈極顯著正相關(guān)，出現(xiàn)這種表型性狀的相關(guān)性可能與某個基因的多效性或控制不同性狀的基因緊密連鎖造成。本研究中，檢測到多組1對標(biāo)記控制多對性狀如PCLG02同時與體重、體長、肌肉這3組性狀相關(guān)聯(lián)。除此，各生長性狀之間也有一定的關(guān)聯(lián)性。腹部寬和體長之間有關(guān)聯(lián)性，PCLG27同時控制這2組性狀；頭胸甲長和體長這2組性狀則由Transcript4024控制?？梢姡嚓P(guān)性狀之間的遺傳關(guān)聯(lián)性在本研究中得到了進(jìn)一步的證實，在育種過程中，利用關(guān)聯(lián)標(biāo)記進(jìn)行輔助性選擇，有助于實現(xiàn)多性狀的遺傳改良［55］。

本研究綜合利用3種方法，通過聚類分析將相同地理來源的克氏原螯蝦群體分為一類，根據(jù)聚類分析的結(jié)果，6個群體的克氏原螯蝦群體被分為2個分支，證明了不同地區(qū)的克氏原螯蝦種質(zhì)具有遺傳差異。遺傳結(jié)構(gòu)分析和主成分分析表現(xiàn)出相同的分類趨勢，證明相同來源的種質(zhì)群體具有較近的親緣關(guān)系，而根據(jù)形態(tài)學(xué)表觀測量數(shù)據(jù)結(jié)果，可直觀對生長指標(biāo)進(jìn)行研判，進(jìn)行親本選育過程中的初步篩選。但由于目前有關(guān)克氏原螯蝦的關(guān)聯(lián)分析研究還很空白，本研究中標(biāo)記顯著關(guān)聯(lián)到的生長性狀還沒有在其他文獻(xiàn)中報道，因此，仍需進(jìn)一步分析本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。因為涉及關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的還有許多，未來可對更大的群體數(shù)據(jù)及多年多點的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究以提高關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，本研究采用了線性研究方法進(jìn)行性狀的關(guān)聯(lián)分析方法，比較直觀簡單，但不能估計QTL的具體位置，鑒于此，采用2種分析方法相結(jié)合的策略，提高克氏原螯蝦性狀標(biāo)記分析的精確性和準(zhǔn)確性，進(jìn)一步為育種工作提供幫助。

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資助項目：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費資助項目（編號：2022XT01）；江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項目（編號：JBGS〔2021〕123）；中央級基本科研業(yè)務(wù)費（編號：2021JBFM21）。

作者簡介：高 楊（1997—），男，安徽銅陵人，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種。E-mail：1463455739@qq.com。

通信作者：蘇勝彥，博士，研究員，主要從事蝦蟹遺傳育種研究，E-mail：ouhaicourse@hotmail.com；朱 健，碩士，研究員，主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究，E-mail：zhuj@ffrc.cn。