摘要：以湖南郴州廣西中煙基地單元黑脛病發(fā)病區(qū)域采集的健康煙田土壤為樣本，采用土壤原位平板培養(yǎng)法，從卵菌類群中的煙草疫霉生長的平板上篩選出1株對煙草疫霉有抑制作用的真菌LYQ01。經(jīng)過18S-ITS序列擴(kuò)增測序比對，發(fā)現(xiàn)該菌與拜賴青霉（Penicillium bilaiae）序列的匹配率為99.65%，因此初步鑒定為拜賴青霉。隨后參照土壤磷循環(huán)有關(guān)的拜賴青霉菌株ATCC 20851的全基因組測序數(shù)據(jù)，設(shè)計4對引物，隨機(jī)擴(kuò)增得到次級代謝產(chǎn)物合成有關(guān)基因簇的4個片段，總長度約6 kb，測序后比對發(fā)現(xiàn)該菌的4個片段序列與拜賴青霉ATCC 20851的相似性達(dá)到了99.9%。利用該青霉菌進(jìn)行煙草疫霉菌平板對峙試驗，以及青霉菌發(fā)酵原液、提取液進(jìn)行煙草疫霉和根結(jié)線蟲的生防試驗，論證其分泌的酶與代謝產(chǎn)物對植物根結(jié)線蟲、煙草黑脛病菌具有抑殺作用。由于菌劑生產(chǎn)過程中調(diào)低pH值可以防止雜菌污染，因此確定青霉菌生長的酸性閾值為pH值 2.5。利用幾種單糖等有機(jī)碳源，初步分析該菌對碳源的利用情況，結(jié)果顯示，木糖與燕麥片最適合作為青霉菌生長的碳源，其次是葡萄糖與果糖，最佳濃度為0.5 g/100 mL。為了后續(xù)對該菌株進(jìn)行遺傳操作，確定潮霉素B可以用于構(gòu)建菌株遺傳操作體系，其應(yīng)用時的濃度范圍為125～250 μg/L。

關(guān)鍵詞：生物防治；煙草疫霉；煙草黑脛??；根結(jié)線蟲；拜賴青霉

中圖分類號：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0161-09

植物病蟲害防治為農(nóng)業(yè)治理中的主要問題之一。目前，我國農(nóng)業(yè)土壤植物病蟲害治理主要依靠化學(xué)防治，但是農(nóng)藥殘留超標(biāo)對食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。隨著人們生活水平的提高，食品安全問題備受關(guān)注，為了降低農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的風(fēng)險，生物防治技術(shù)逐漸受到重視。在植物保護(hù)領(lǐng)域和食品安全領(lǐng)域，利用生物防治降低植物病蟲害發(fā)生已成為重要課題。生物防治是指利用生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病害控制病原體的方法，通過生物種間關(guān)系、種內(nèi)關(guān)系降低有害病菌在入侵部位的密度，使得病原生物變少，從而減少植物病蟲害的暴發(fā)，達(dá)到用生物防治生物的目的。從自然界尋找既能緩解植物病害又對環(huán)境生態(tài)影響較小的生物新技術(shù)，利用生物之間的相互作用對植物病蟲害達(dá)到無公害化處理和持續(xù)性防治的目的，逐漸成為備受關(guān)注和具有發(fā)展前景的新興領(lǐng)域。生防菌是一種具有生物防治作用的微生物群，具有繁殖力高、所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物及活性酶種類繁多、對病原物的抑制機(jī)理多種多樣、易于快速大規(guī)模培養(yǎng)等特點，其自身往往與植物是互利共生的生物關(guān)系，主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌等，目前運用較多的生防細(xì)菌有芽孢桿菌（Bacillus）［1-6］、假單胞桿菌（Pseudomonas）［7-9］，生防真菌有木霉菌（Trichoderma）［10-13］等。因此，以生防菌為主體的殺菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。

黑脛病是一種由煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）侵染所致的、極其嚴(yán)重的土傳卵菌病害，是煙草種植中不可忽視的嚴(yán)重病害［14-15］。黑脛病菌在侵染煙草植株的過程中釋放毒素，瓦解植株細(xì)胞，其分泌物含半乳糖苷酶，可分解宿主細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)層和導(dǎo)管壁，產(chǎn)生果膠產(chǎn)物片段，然后形成凝膠團(tuán)塊［16-17］。該病在全國乃至世界范圍內(nèi)的煙草種植過程中均會發(fā)生，植株患病后會造成矮化、萎蔫、葉枯萎凋落以及根莖部分功能受損致使養(yǎng)分與水分運輸受阻甚至壞死等現(xiàn)象。煙草種植面積的擴(kuò)大、種植周期的延長以及自然環(huán)境由于多方面污染變得脆弱敏感，使得煙草黑脛病加重，不僅造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還破壞了生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性。

煙草根結(jié)線蟲病也是煙草種植過程中常見土傳病害之一，嚴(yán)重時不僅會導(dǎo)致煙株整株黃化萎蔫，還會導(dǎo)致青枯病、黑脛病、病毒病等多種其他病害聯(lián)合發(fā)生。一些研究團(tuán)隊也分離鑒定了生防菌，用其防治根結(jié)線蟲，其中就有淡紫擬青霉等青霉菌［18-22］。青霉菌是一種常見的霉菌，通常與土壤、腐爛的有機(jī)物以及水果和蔬菜的儲存腐爛物或病原體有關(guān)，它因生物降解有機(jī)物、生產(chǎn)青霉素和灰黃霉素等抗生素而聞名。草酸青霉（P. oxalicum）、灰黃青霉（P. griseofulvum）和繩狀青霉（P. funiculosum）、微紫青霉（P. janthinellum）等青霉菌均對作物土傳病害具有防治潛力，且生防青霉菌常具備廣譜抑菌活性［23-27］。一些青霉屬物種還可以在土壤中釋放固定磷，供植物利用［28］。與其他營養(yǎng)素相比，在大多數(shù)土壤中磷的流動性和對植物的可利用性最小。溶磷真菌在磷循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，以環(huán)境友好和可持續(xù)的方式向植物提供磷。拜賴青霉被用作種子接種劑，以提高各種作物的磷利用效率。拜賴青霉生長在植物根部周圍，能溶解磷酸鈣、磷酸鐵和磷酸鋁中的磷。拜賴青霉基因組的測序，為揭示磷的溶解機(jī)制和真菌對磷循環(huán)作出了貢獻(xiàn)，它是最早被證明有效的真菌溶磷商業(yè)產(chǎn)品之一。張文芳等利用基因組測序、基因注釋以及 qRT-PCR 檢測方法，探明來自深海的拜賴青霉 F-28 真菌具有產(chǎn)生倍半萜的潛力。從大規(guī)模發(fā)酵真菌中分離出20個倍半萜，共鑒定出18個新的倍半萜類化合物，并表明化合物18是一種很有發(fā)展前景的抗神經(jīng)炎癥藥物［29］。孟令紅等將海洋來源的拜賴青霉MA-267和櫻桃青霉EN-480共培養(yǎng)，產(chǎn)生2種新的亞萜類衍生物，它們可以拮抗細(xì)菌病原菌［30］。Nakahara 等從1株拜賴青霉菌株的發(fā)酵液中鑒定出3種化合物，驗證其殺根結(jié)線蟲的活性，在300 mg/L的濃度下致死率為52%～98%，其中吡啶二羧酸效果最好［31］。

本研究針對煙草黑脛病菌的防治，分離并鑒定了1株青霉。該青霉不僅能夠抑制煙草疫霉的生長，還可以誘殺根結(jié)線蟲，是1株具有農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價值的潛力菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

供試菌株主要包括煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）、根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita），均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與抗生素

供試培養(yǎng)基主要包括燕麥培養(yǎng)基、海博PDA培養(yǎng)基（僅含有馬鈴薯提取物和葡萄糖）、索萊寶PDA培養(yǎng)基（含有馬鈴薯淀粉、葡萄糖和蛋白胨）；供試抗生素主要包括放線菌酮、制霉菌素、氯霉素、潮霉素B。

1.1.3 引物

供試引物由北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司合成，序列如下：ITS1，TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4，TCCTCCGCTTATTGATATGC。P450-1 721F，CGTAACCCGACAGCCAAGAG；P450-3 134R，TACAGAGTGAGTGAGCGTGA。P450-1 556F，TGTAATAGAAGCCGAAGTGC；P450-4 931R，TTTCAGGTGCGGTCGCTATG。P450-1 843F，TATTGGGAGTCGGCTTACAC；P450-5 284R，TAAGTCACCCACCGCACAAT。GH62-72F，CAGGTAGGGAGGGCTTCACA；GH62-2 085R，GGAGACGACGGAGACCCTGA。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種分離方法

2023年7月于湖南郴州采集煙草黑脛病發(fā)病較重的煙地中的土壤樣品。其中，健康煙株周圍土壤樣品5份，將樣品0.5 g轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌PBS緩沖液中打散；隨后用無菌PBS緩沖液稀釋至10-4 ～10-7 倍，分別取50 μL并涂于添加了抗生素的燕麥片平板（取市售燕麥片30 g，加入適當(dāng)水煮沸20～30 min，紗布過濾取汁，加入瓊脂20 g，定容至1 000 mL，pH值自然），28 ℃條件下培養(yǎng)；挑取霉菌單菌落，利用平板對峙生長方法將單菌落和煙草疫霉接種于燕麥片抗生素平板，28 ℃條件下培養(yǎng)；觀察霉菌對植物病原菌的菌絲生長抑制情況，篩選出對煙草疫霉菌絲生長均具有很強(qiáng)抑制效果的菌株。

1.2.2 形態(tài)學(xué)及分子鑒定方法

參照青霉屬的特征，測試菌株在PDA平板上的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)，利用通用引物ITS1/ ITS4（ITS1，3′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-5′；ITS4，3′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5′）進(jìn)行PCR測序。PCR 反應(yīng)體系如下：2×PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L ITS1引物1 μL，10 μmol/L ITS4引物 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL；PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，30個循環(huán)；72 ℃復(fù)性。膠回收 PCR產(chǎn)物送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 青霉菌碳源利用試驗

1.2.3.1 初始培養(yǎng)基 初始培養(yǎng)基由微量元素液體培養(yǎng)基和大量元素液體培養(yǎng)基混合而成。（1）微量元素液體培養(yǎng)基的配制。稱取10 g乙二胺四乙酸（EDTA）、4.4 g ZnSO4·7H2O、1.01 g MnCl2·4H2O、0.32 g CoCl2·6H2O、0.315 g CuSO4·5H2O、0.22 g （NH4）6Mo7O24·4H2O、1.47g CaCl2·2H2O、1.0 g FeSO4·7H2O，蒸餾水補足至200 mL，pH值調(diào)節(jié)至7左右［32-33］；分裝至50 mL移液管中，放入冷凍冰柜。（2）大量元素液體培養(yǎng)基的配制。稱取6.0 g NaNO3、1.5 g KH2PO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4，蒸餾水補足至1 000 mL，pH值調(diào)節(jié)至7左右。

1.2.3.2 含碳源培養(yǎng)基 取配制好的微量元素液體培養(yǎng)基200 μL，并置于含1 L大量元素液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，混合，分成10等分，分別加入到10個容量為300 mL的三角瓶中，即100 mL/個；再分別加入碳源（木糖1 g、普魯蘭1 g、葡萄糖1 g、果糖1 g、海藻酸鈉0.5 g、檸檬酸1 g、羧甲基纖維素鈉0.5 g、葡萄糖0.5 g、燕麥片0.5 g），調(diào)節(jié)各份培養(yǎng)基的pH值至7左右。將30個含有不同碳源的培養(yǎng)基（10個碳源液體培養(yǎng)基，3次重復(fù)）的三角瓶進(jìn)行120 ℃高溫滅菌20 min，待冷卻至室溫后加入200 μL青霉菌孢子刮取液，搖勻后封口；放入28 ℃搖床中培養(yǎng)，72 h后記錄菌球生長情況。

1.2.4 黑脛病生防試驗方法

將LYQ01菌株和病原菌分別在燕麥片平板上28 ℃活化培養(yǎng)3～5 d，備用；然后用打孔器在活化好的菌株菌絲邊緣打取圓形菌餅（直徑0.50 cm），再用接種針分別將LYQ01菌株和測試疫霉的菌餅挑至新的平板兩端，然后將培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中于28 ℃條件下培養(yǎng)。將挑取的LYQ01菌株接種到燕麥片液體培養(yǎng)基（不加瓊脂的燕麥片培養(yǎng)基）上，于28 ℃ 條件下振蕩培養(yǎng)14 d，然后于12 000 r/min條件下離心10 min，過濾，獲得含有LYQ01菌株的發(fā)酵液上清（發(fā)酵液上清中僅為LYQ01菌株的發(fā)酵產(chǎn)物）。對該發(fā)酵液上清進(jìn)行不同濃度的稀釋（1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%），添加到燕麥片固體培養(yǎng)基中，接種煙草疫霉菌絲餅，觀察煙草疫霉的生長情況。煙草疫霉菌于28 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，測定其在1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%等不同濃度發(fā)酵液處理中菌絲的長度。

用1 L的三角瓶裝200 mL蛋白胨PDA液體培養(yǎng)基，接種1 mL的108 CFU/mL孢子懸液，于 28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d；合并3瓶600 mL未過濾的、含有菌絲的液體發(fā)酵液，直接加入等量（600 mL）的乙酸乙酯，抽提3次后旋蒸，最后溶解在3 mL甲醇或者乙酸乙酯中，通過0.22 μm微孔濾膜過濾青霉菌提取液，以去除可能殘留的青霉菌孢子和其他雜菌，用作提取物的抑菌試驗。青霉菌提取液各取50、100、500 μL，分別加入到配制好的燕麥固體培養(yǎng)基中；設(shè)置對照組，只添加500 μL的甲醇溶液，接種到燕麥固體培養(yǎng)基中。將上述培養(yǎng)基制備成固體培養(yǎng)皿，接種菌餅放至培養(yǎng)皿中心，放入培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長情況，然后測量并記錄菌落半徑。

1.2.5 青霉菌生長的pH值最低閾值的測定

培養(yǎng)基選用PDA（馬鈴薯、葡萄糖）液體培養(yǎng)基，稱取17.5 g PDA在500 mL燒杯中溶解，補足蒸餾水至500 mL，將其平均分裝至5個300 mL三角瓶中，再置于121 ℃下高溫滅菌20 min。用1 mol/L鹽酸溶液和1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PDA液體培養(yǎng)基的pH值，測得PDA液體培養(yǎng)基初始pH值為6.3，再利用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH值至1.5、2、3、4、5，利用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7、8、9、10、11。將配制好的培養(yǎng)基接種50 μL青霉菌原液，于28 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.6 根結(jié)線蟲滅活試驗方法

用35 mg/mL海博PDA液體培養(yǎng)基、2.5 mg/mL索萊寶含蛋白胨PDA液體培養(yǎng)基（在PDA的基礎(chǔ)上添加蛋白胨）等2種PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)青霉菌，得到2種不同的原液。同時，將青霉菌新鮮原液以乙酸乙酯為萃取劑，經(jīng)20 min靜置萃取后取上清液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以70 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行蒸餾提取，其提取物用甲醇溶液溶解；運用類似方法將萃取液更改為甲醇溶液，其余步驟不變，得到乙酸乙酯提取液和甲醇提取液，這2種提取液中主要提取的物質(zhì)為青霉菌的代謝產(chǎn)物，去除了絕大多數(shù)的酶，原液中則保留降解酶。為比較青霉菌與傳統(tǒng)化學(xué)制劑各自對根結(jié)線蟲的致死程度，選用對根結(jié)線蟲具有明顯抑殺作用的3 mg/mL吡啶二羧酸溶液作對照。將這5種試劑分別進(jìn)行梯度稀釋，即2種PDA溶解的青霉菌原液、吡啶二羧酸溶液原液及其2、4、8、16、32、64倍液，由于2種青霉菌提取液中青霉菌的濃度遠(yuǎn)高于原液，因此取乙酸乙酯50、100倍液。將上述原液與稀釋液各取1 mL置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，對照組為不接種青霉菌的2種PDA溶液、蒸餾水、乙酸乙酯及甲醇溶液，將上述溶液接種50頭新孵化的南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲，進(jìn)行24、48 h的死亡率觀察并記錄。1 mL無菌水和50頭新孵化的J2作為對照，3次重復(fù)，置于15 ℃下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后6、12、24、30 h，2、3、4、5、6、7、8、9、10 d記錄J2死亡數(shù)，計算J2死亡率與J2校正死亡率：校正死亡率＝（試驗組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%。

在體視顯微鏡下觀察處理過的J2活動狀態(tài)和體態(tài)。結(jié)果顯示，存活的J2蟲體一般是彎曲的且可以不斷地移動；死亡的J2蟲體一般是僵直的，將僵直的J2蟲體再次分離，置于盛有2％生理鹽水的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用1 mL注射器針尖輕輕撥動J2，靜止不動的即為死亡蟲體。

1.2.7 谷子培養(yǎng)基共培養(yǎng)試驗

帶殼谷子加適量自來水，100 ℃煮沸至約2/3爆花為止（約40 min），利用紗布瀝干水分，分裝，高壓滅菌。在100 mL的三角瓶中，滅菌谷子裝量1/3并鋪滿底部，厚約 1 cm，設(shè)置4組試驗，每組3個重復(fù)。其中，第1組為空白對照組（未接種滅菌谷子），第2組為接種5個直徑為0.5 cm [JP+2]的LYQ01菌餅，第3組為同時接種5個直徑為0.5 cm的疫霉和拜賴青霉菌LYQ01菌餅，第4組為只接種5個直徑為0.5 cm的疫霉菌餅，分別置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 d。

1.2.8 青霉菌的抗生素抗性檢測

真菌中的抗性基因標(biāo)記比較少，首先選用經(jīng)常使用的潮霉素B進(jìn)行抗性檢測。由于拜賴青霉在含有蛋白胨的PDA培養(yǎng)基上生長迅速，并且在不同的培養(yǎng)基上生長時抗性不同。為了較好地控制拜賴青霉的生長速度，所以選用僅有馬鈴薯淀粉和葡萄糖的海博PDA培養(yǎng)基，在這個寡營養(yǎng)的培養(yǎng)基上拜賴青霉生長較慢。潮霉素B購自生工生物工程（上海）股份有限公司。潮霉素B濃度定為10、125、250、375、500 μg/mL 等5個濃度梯度。利用孢子進(jìn)行抗性試驗，將5 mL的0.01% 吐溫-80噴于成熟的青霉PDA平板上，用1 mL槍尖吹洗后制成約 1010 CFU/mL 孢子懸液；之后利用0.01%吐溫-80溶液梯度稀釋制成10-4、10-5、10-6、10-7 孢子懸液，各取10 μL分別涂布于含有抗生素的PDA平板上，置于25 ℃進(jìn)行真菌恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次，連續(xù)觀察7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌拮抗菌的分離

利用含有煙草黑脛病疫霉屬病原菌的土壤，稀釋液涂布在PDA抗生素固體培養(yǎng)基，疫霉菌絲延伸到平板頂部。利用燕麥培養(yǎng)基雙抗平板分離，經(jīng)過4～5批次的分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)1株疑似放線菌或者真菌的綠色拮抗菌（圖1），菌株編號為LYQ01，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，分泌黃褐色色素，一般色素水平與抗生物質(zhì)水平相當(dāng)，分泌色素擴(kuò)散范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌落生長直徑。由于煙草疫霉等卵菌的菌株生長較快，類似于蘑菇云狀，脫離培養(yǎng)基生長至平板頂部，所以經(jīng)過火燒去掉表面菌絲后可明顯看到抑菌圈（圖1-D）。轉(zhuǎn)移到燕麥培養(yǎng)基后，進(jìn)一步確認(rèn)拮抗效果，在普通PDA固體培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)如圖2所示，2種培養(yǎng)基上生長都不快，但是在PDA培養(yǎng)基上黃色色素圈明顯更大。

2.2 LYQ01菌株的鑒定分析

LYQ01菌株菌落的菌絲發(fā)達(dá)，但長度較短，呈氈狀；分生孢子頭呈掃帚狀，分生孢子鏈狀著生，這些特征符合青霉屬的典型特征，因此確定LYQ01菌株為青霉屬菌株。經(jīng)測序，LYQ01菌株的ITS序列片段經(jīng)過NCBI 數(shù)據(jù)庫比對，待測菌株LYQ01與拜賴青霉（P. bilaiae）MH1214菌株（GenBank登錄號為LN901118.1）、NRRL 3391菌株（GenBank登錄號為AF033402.1）的序列匹配率為99.65%（表1）。

通過綜合分析，最終確定所篩選到的LYQ01菌株為拜賴青霉。該菌株能夠分泌大量的黃色色素，可以作為拮抗菌株繼續(xù)研究并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

隨后參照與土壤磷循環(huán)有關(guān)的拜賴青霉菌株ATCC 20851全基因組測序數(shù)據(jù)（該菌株保存于美國模式培養(yǎng)物菌種庫），選定1個GH62家族的糖苷水解酶基因和1個次級代謝基因簇中P450家族的酶基因并分別設(shè)計1、3對引物，用以擴(kuò)增這個長度為5 kb的基因。設(shè)計的這4對引物的擴(kuò)增長度理論上分別是1 413、3 378、3 441、2 013 bp，隨機(jī)擴(kuò)增得到次級代謝產(chǎn)物合成有關(guān)基因簇的4個片段。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3所示，4個片段長度分別是1.4、3.4、3.4、2.0 kb，與理論值相等。測序發(fā)現(xiàn)其總長度約6 kb，經(jīng)過這幾個片段的拼裝（有些片段是重疊在一起的）后檢索，序列比對發(fā)現(xiàn)該菌的4個片段序列與拜賴青霉菌株 ATCC 20851的相似性達(dá)到了99.9%。

2.3 LYQ01菌株對疫霉菌菌絲生長的抑制作用

將菌餅接種到不同濃度的培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵液濃度的升高，煙草疫霉菌菌絲生長受到的抑制也逐漸明顯，使得菌落逐漸減?。ū?）。1%發(fā)酵液的抑菌效果與未接種發(fā)酵液相比幾乎沒有差別，但當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)到5%時，抑菌效果就十分明顯。隨著LYQ01菌株發(fā)酵液濃度的增加，煙草疫霉菌的菌落直徑越來越小，當(dāng)其濃度為15%時，抑菌率超過66%。說明LYQ01菌株的發(fā)酵產(chǎn)物對煙草疫霉菌菌絲伸長具有很強(qiáng)的抑制作用。

之后，利用乙酸乙酯提取液進(jìn)行黑脛病菌菌絲生長抑制試驗，結(jié)果見表3。隨著青霉菌提取液添加量的增加，煙草黑脛病菌的生長受到抑制，但是效果并不是特別明顯，雖然利用添加提取液可證實青霉菌對煙草黑脛病菌具有抑制作用，但是效果不如直接添加發(fā)酵液明顯（表3）。

2.4 青霉菌對根結(jié)線蟲的抑殺效果

根據(jù)文獻(xiàn)［31］可知，青霉菌發(fā)酵液中可產(chǎn)生一些抑殺根結(jié)線蟲的小分子化合物， 所以使用該菌的發(fā)酵液及乙酸乙酯提取液統(tǒng)計了根結(jié)線蟲的死亡率，結(jié)果見表4。

由表4可知，不含蛋白胨PDA發(fā)酵液原液在 24 h 時的校正死亡率僅有（3.91±4.74）%，在48 h時的校正死亡率僅有（44.01±15.55）%。而含有蛋白胨的PDA發(fā)酵液原液在24、48 h時的校正死亡率分別是（90.90±3.88）%、（93.50±1.48）%，都在90%以上。這說明培養(yǎng)基中的蛋白能促進(jìn)青霉菌株致死活性物質(zhì)的產(chǎn)生。后續(xù)利用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵真菌，檢測提取液對根結(jié)線蟲的抑殺效果。文獻(xiàn)［31］報道了吡啶二羧酸具有抑殺根結(jié)線蟲的能力，因此本試驗以3 mg/mL吡啶二羧酸溶液作為參照。吡啶二羧酸在經(jīng)過4倍稀釋后對根結(jié)線蟲的抑殺率為（77.89±8.62）%，但是進(jìn)一步稀釋為8倍即濃度為375 mg/L時，抑殺率僅為（7.19±7.75）%，這達(dá)不到一般農(nóng)藥的致死濃度的要求。發(fā)酵液經(jīng)過乙酸乙酯抽提后，去除了發(fā)酵液中各種酶的影響，經(jīng)過50倍稀釋后抑殺率僅為（6.65±2.44）%，經(jīng)過100倍稀釋后抑殺率為（2.15±1.38）%，沒有達(dá)到理想的抑殺濃度。

2.5 幾種單糖等對青霉菌生長的影響

青霉菌能降解各種復(fù)雜的有機(jī)質(zhì)，同時分泌各種降解有機(jī)質(zhì)的酶類，這些酶類可能對病原菌或者根結(jié)線蟲具有抑殺作用。所以，為了后續(xù)鑒定可能的酶類在拮抗或者抑殺病原物的作用，筆者利用幾種單糖和復(fù)雜有機(jī)質(zhì)分析該青霉菌對碳源的利用情況。培養(yǎng)后72 h，觀察含不同碳源培養(yǎng)基內(nèi)青霉菌的生長情況，記錄并比對各菌球體積、密度、培養(yǎng)基透明度等數(shù)據(jù)。

1 g/100 mL木糖與0.5 g/100 mL燕麥片試驗組中的青霉菌在所選碳源中長勢最好，木糖培養(yǎng)基中的菌球體積是所測試驗組中最大的，生長密度中等；燕麥片培養(yǎng)基中的青霉菌生長密度最大，菌球體積中等。綜上，青霉菌在木糖培養(yǎng)基中的綜合生長情況最佳。

0.5、1 g/100 mL葡萄糖和1 g/100 mL果糖試驗組中的青霉菌長勢較好，總體生長情況次于木糖培養(yǎng)基與燕麥片培養(yǎng)基，葡萄糖培養(yǎng)基中的菌株生長狀態(tài)優(yōu)于果糖培養(yǎng)基，而濃度為1 g/100 mL的葡萄糖培養(yǎng)基中的青霉菌長勢又優(yōu)于濃度為 0.5 g/100 mL 的葡萄糖培養(yǎng)基。1 g/100 mL普魯蘭培養(yǎng)基、0.5 g/100 mL海藻酸培養(yǎng)基、1 g/100 mL 檸檬酸培養(yǎng)基及0.5 g/100 mL羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基內(nèi)青霉菌的生長狀況較差，海藻酸培養(yǎng)基內(nèi)有少量絮狀菌絲，其余3種碳源培養(yǎng)基內(nèi)無明顯生長，說明在短期培養(yǎng)中，這4種物質(zhì)被青霉菌吸收、分解、利用的效率低、速度慢，不適合作為青霉菌培養(yǎng)的碳源。后續(xù)又對檸檬酸、普魯蘭、海藻酸鈉以及羧甲基培養(yǎng)基再次進(jìn)行72 h培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)后檸檬酸培養(yǎng)基內(nèi)青霉菌生長良好，菌球體積小，培養(yǎng)基無色透明，菌落密度較大；海藻酸鈉培養(yǎng)基內(nèi)有少量絮狀菌漂浮，溶液無色透明；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基內(nèi)菌球密度與體積較小，培養(yǎng)基無色透明；普魯蘭培養(yǎng)基內(nèi)仍無明顯的菌落生長（圖4上）。

通過培養(yǎng)比對，判定木糖與燕麥片最適合作為青霉菌生長的碳源，其次是葡萄糖與果糖，其中 1 g/100 mL 葡萄糖比0.5 g/100 mL葡萄糖更有利于青霉菌的繁殖，海藻酸、普魯蘭、羧甲基纖維素鈉及檸檬酸培養(yǎng)基在72 h內(nèi)未見明顯的菌落生長，說明青霉菌對此類碳源降解速率慢，因此不適合作為培養(yǎng)青霉菌的碳源。

2.6 青霉菌生長的pH值最低閾值

經(jīng)培養(yǎng)后觀察各培養(yǎng)基中青霉菌的生長狀態(tài)并記錄，再通過濾網(wǎng)過濾，用分析天平稱取各組青霉菌濕重并進(jìn)行具體比較，判斷適宜青霉菌能夠生長的pH值最低閾值。將后3組培養(yǎng)基（pH值為1、1.5、2）再次進(jìn)行28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，同時連續(xù)觀測6 d，結(jié)果顯示，3組培養(yǎng)基內(nèi)仍無明顯菌落生長，因此可驗證青霉菌的最低生長pH值約為2.5（圖4下）。由于青霉菌的生物菌劑在實際處理中更多地應(yīng)用于酸性環(huán)境，因此測定其最高承酸閾值更有實際參考價值。

2.7 青霉菌遺傳操作所用抗生素及其濃度篩選

目前，真菌中可用的抗生素遺傳標(biāo)記比較少，使用最多的就是潮霉素B，所以直接選擇潮霉素B來檢測該菌對于潮霉素的抗性并且篩選濃度范圍。在海博PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后48 h，觀察到在 125 μg/mL 平板10-4稀釋度區(qū)域還有菌落長出，但是在250 μg/mL的濃度下已經(jīng)沒有菌落長出了（圖5-a）。培養(yǎng)5 d后，不管哪個濃度還是會長出青霉菌的菌落，說明長時間培養(yǎng)，青霉菌對潮霉素抗性反而失效了（圖5-b）。

2.8 谷子培養(yǎng)基中的病原菌與拮抗菌共培養(yǎng)生長結(jié)果

為了解青霉菌的煙草疫霉拮抗機(jī)理，利用谷子培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)試驗，結(jié)果見圖6。共培養(yǎng)后 5 d，第2組LYQ01菌絲生長，但沒有向四周擴(kuò)散，不是很旺盛，沒有從基質(zhì)內(nèi)向外伸展；第4組疫霉菌絲生長特別旺盛并向四周擴(kuò)散，完全蓋住了基質(zhì)；同時接種了2種菌的第3組中沒有看到白色的疫霉病原菌菌絲，而是長滿了墨綠色的LYQ01菌絲和孢子。說明在有病原菌接種的前提下，可以激發(fā)拮抗菌的生長，阻止病原菌的增殖作用（圖6-C）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從發(fā)病區(qū)域的健康煙草植株根際土中篩選出1株抑制病原菌的真菌，利用18S和5.8S之間的ITS序列引物擴(kuò)增測序方法鑒定為拜賴青霉，與已測序的拜賴青霉比對，則進(jìn)一步確定其即為拜賴青霉。篩選出的青霉菌對煙草黑脛病菌有明顯的抑制作用，它對煙草黑脛病菌起抑殺作用的物質(zhì)主要是揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及幾丁質(zhì)水解酶，對根結(jié)線蟲起抑殺作用的物質(zhì)主要為多種可被乙酸乙酯或甲醇等有機(jī)試劑提取的代謝產(chǎn)物。通過改變單一變量，分析青霉菌對碳源的利用情況，結(jié)果顯示利用效果最佳的碳源為木糖與燕麥片，其次為葡萄糖和果糖。拜賴青霉的酸性pH值閾值在2.5左右，為青霉菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了便利，有效防止雜菌的污染，提高生產(chǎn)效率。最后，利用潮霉素B確定了該拜賴青霉的抗性濃度范圍，為進(jìn)一步進(jìn)行遺傳操作奠定了基礎(chǔ)。

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基金項目：廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技計劃（編號：2022450000340066）。

作者簡介：曾祥難（1978—），男，廣西來賓人，碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事煙草栽培及質(zhì)量管理研究。E-mail：513655538@qq.com。

通信作者：韋建玉，博士，研究員，主要從事煙草栽培技術(shù)、煙葉質(zhì)量研究。E-mail：jtx_wjy@163.com。