摘要：SPL是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物從幼年期向成年期轉(zhuǎn)變，為探究DdSPL基因在德陽柿成花調(diào)控中的作用，為德陽柿實生苗的早花現(xiàn)象提供依據(jù)。本研究采用生物信息學(xué)方法對德陽柿SPL基因家族成員進行鑒定，并對其基本理化性質(zhì)、系統(tǒng)進化關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、共線性進行分析；通過融合蛋白瞬時表達鑒定亞細胞定位情況；利用qRT-PCR技術(shù)檢測其在不同成花時期不同部位［莖、葉、頂芽（花）］的表達情況。結(jié)果表明，德陽柿中共鑒定得到38條DdSPL基因序列，通過聚類分析可分為8個亞族，同一聚類的蛋白具有相似的氨基酸結(jié)構(gòu)（2個鋅指結(jié)構(gòu)ZN-1、ZN-2和1個核定位信號）和基因結(jié)構(gòu)；保守基序分析發(fā)現(xiàn)，所有的DdSPL蛋白均含有SBP結(jié)構(gòu)域。共線性分析結(jié)果顯示，德陽柿38個SPL基因家族成員中存在49對直系同源基因?qū)?。亞細胞定位顯示，DdSPL8、DdSPL13、DdSPL18均定位在細胞核中；DdSPL7、DdSPL13、DdSPL18這3個基因的表達模式相似，在幼苗期和現(xiàn)蕾期的莖、葉、頂芽（花）中表達量相對較少，在開花期的葉片中表達量明顯提高，可能參與德陽柿成花調(diào)控。綜上，本研究首次從德陽柿基因組中鑒定出38個SPL家族成員，序列高度保守，且均含有SBP結(jié)構(gòu)域，DdSPL7、DdSPL13、DdSPL18在開花期葉片中高表達，可能參與德陽柿成花調(diào)控。

關(guān)鍵詞：德陽柿；SPL基因家族；成花調(diào)控；基因鑒定；共線性分析

中圖分類號：S665.201 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0069-10

SQUAMOSA啟動子結(jié)合蛋白（SQUAMOSA promoter binding protein-like，SPL）作為植物中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控植物從幼年期向成年期轉(zhuǎn)變，并廣泛調(diào)控植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成［1］。SPL轉(zhuǎn)錄因子家族具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域，由78個氨基酸殘基組成，對DNA結(jié)合和核定位至關(guān)重要［2］。SBP的DNA結(jié)合域都包含2個鋅指狀結(jié)構(gòu)和1個二分核定位信號（NLS），可與順式元件TNCGTACAA的[JP9]GTAC核心基序特異性結(jié)合［3-4］。研究表明，AmSBP1和AmSBP2是最早被鑒定的SPL基因，它們可以與金魚草（Antirrhinum majus）中花分生組織識別基因SQUAMOSA的啟動子區(qū)相互作用，控制早期花發(fā)育［2］。近些年來，SPL基因家族在越來越多的綠色植物中被發(fā)現(xiàn)具有重要作用?；蚪M測序顯示，在模式植物擬南芥中，共鑒定出16個SPL基因，可將其分為8組［5］。水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopeersicum L.）、蘋果（Malus pumila Mill）和小麥（Triticum aestivum）中分別有19、15、27、56個SPL基因［6-9］。

植物中有一些開花基因僅與年齡的增長相關(guān)，即年齡途徑。研究表明，擬南芥中有11個SPL基因受miR156調(diào)控，這些SPL基因按編碼蛋白的大小可以分為SPL3（SPL3/SPL4/SPL5）和SPL9（SPL2/SPL6/SPL9/SPL10/SPL11/SPL13/SPL13-like/SPL15）［10］。miR156調(diào)控的基因AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5可促進營養(yǎng)物相變和開花［11］。miR156調(diào)控的分支基因AtSPL9和AtSPL15中的功能缺失突變延遲開花時間，導(dǎo)致更多的營養(yǎng)蓮座葉［12］。蘋果MdSP3基因和柑橘類SPL基因過表達后均可以引起擬南芥的開花時間提前［13-14］。在百合中LbrSPL9和LbrSPL15過表達后可以促進開花，縮短成熟時間［15］。

德陽柿（Diospyros deyangnsis；2n=4x=60）是雌雄異株的落葉果樹，通過對德陽柿的組織形態(tài)以及細胞層面分析，鑒定德陽柿為四倍體［16］。收取德陽柿的種子播種后收獲的部分實生苗，當(dāng)年就可開花結(jié)果［17］。這種現(xiàn)象很少出現(xiàn)在木本植物中，因其具有早花特性打破年齡限制當(dāng)年成花，成為學(xué)術(shù)界探索的焦點問題［18］。有趣的是，德陽柿實生苗早花表現(xiàn)為頂芽經(jīng)過階段轉(zhuǎn)變形成花芽，且花瓣顏色為淡黃色，這與成年德陽柿植株的粉紅色花瓣表現(xiàn)出差異（圖1）。因此探究德陽柿實生苗完成成花轉(zhuǎn)變背后的分子調(diào)控機制具有重要的研究意義。SPL基因家族在植物成花誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，而德陽柿的SPL基因在成花中的作用及相關(guān)機制尚未被報道。本研究基于已經(jīng)測序獲得的德陽柿全基因組數(shù)據(jù)，鑒定得到38條SPL基因家族成員，系統(tǒng)分析其進化關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)圖、共線性等，并對德陽柿實生苗材料不同時期不同部位的DdSPLs基因表達水平進行分析，以期為進一步探索德陽柿實生苗早花現(xiàn)象背后的成花分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2022年2月至2023年5月在西北農(nóng)林科技大學(xué)國家柿種質(zhì)資源圃進行。

1.1 植物材料

本氏煙草（Nicotiana tabacum L.）（種子由筆者所在實驗室保存）、早花品種德陽柿（來自西北農(nóng)林科技大學(xué)國家柿種質(zhì)資源圃），均為當(dāng)年播種的實生苗；于2023年4月5日采取幼苗期莖、葉、頂芽材料；5月4日采取現(xiàn)蕾期植株的莖、葉、頂花芽材料；5月15日采取開花期植株莖、葉、頂花材料，經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 德陽柿DdSPL基因鑒定

從Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）下載SPL家族的結(jié)構(gòu)域模型文件（PF03110），使用HMMER 3.0軟件搜索DdSPL，E值閾值為E值≤1×10-10。將篩選得到的序列用Batch CD-search、Pfam在線工具驗證其是否含有完整的SPB保守結(jié)構(gòu)域，最后將得到的38條德陽柿DdSPL家族基因，按照其在染色體上排列的位置進行命名。

1.2.2 德陽柿SPL基因家族生物信息學(xué)分析

分子量（Mw）和理論等電點（pI）參數(shù)使用ExPASy程序（https：//web.expasy.org/protparam/）進行預(yù)測。應(yīng)用Weblogo 3將SBP結(jié)構(gòu)域可視化；使用TBtools對38條DdSPL基因繪制染色體定位圖；從Phytozome網(wǎng)站（http：//phytozome-next.jyi.doe.gov/）和NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載了擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻、番茄、葡萄（Vitis vinifera）和蘋果的SPL蛋白質(zhì)序列。使用分子進化遺傳學(xué)分析5.0版（MEGA 5）軟件包中的ClustalW算法對所有SPL進行全序列比對，并使用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1 000，服從泊松分布，其余步驟均采用默認參數(shù)進行［19］。GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）用于繪制DdSPL基因結(jié)構(gòu)圖；使用MEME（http：//meme-suite.org/）分析DdSPL編碼的蛋白保守基序，motif數(shù)量設(shè)為12；使用TBtools對DdSPL進行共線性分析。

1.2.3 RNA提取和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用RNAprep Pure Plant Plus試劑盒提取總RNA（Tiangen，China）。用PrimeScript RT試劑盒（Takara，Japan）合成第一鏈cDNA，總RNA為1 μg。DdSPL家族成員PCR定量引物通過Primer Premier 5設(shè)計（表1）。在QuantStudio 5 RT qPCR系統(tǒng)（Life Technologies，USA）中進行qRT-PCR擴增，反應(yīng)體系10 μL：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa）5 μL；F/R引物各0.4 μL；cDNA模板（1 00 ng/μL）1 μL；ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)45次；60 ℃延伸1 min；使用德陽柿內(nèi)源性基因DdACTIN作為內(nèi)參基因。測定結(jié)果均為3次生物學(xué)和3次技術(shù)性重復(fù)的平均值±標準誤差，通過2-ΔΔCT方法計算DdSPL的相對表達水平，利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和差異顯著性比較。

1.2.4 基因克隆

根據(jù)德陽柿實生苗不同組織材料表達模式，結(jié)合文獻中與成花誘導(dǎo)相關(guān)的SPL基因，分別選擇DdSPL13/DdSPL18（AtSPL3的同源基因）、DdSPL16（AtSPL4的同源基因）、DdSPL7（AtSPL5的同源基因）和DdSPL8（AtSPL9的同源基因）進行引物設(shè)計（表2）。以德陽柿實生苗葉片cDNA為模板進行基因克隆。反應(yīng)體系為：Takara primer STAR Max premix（2×）25 μL；F/R引物各1.5 μL；cDNA模板1 μL；ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。產(chǎn)物使用TIANGEN Universal DNA Purification Kit試劑盒進行回收，經(jīng)生工公司測序得到相應(yīng)基因序列。

1.2.5 載體構(gòu)建和亞細胞定位

基因序列去除終止密碼子，在基因克隆引物的5′端加上TAKARA限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點，將加黏性末端的目的基因片段與pCAMBIA 2300載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α（TransGen Biotech，Beijing）大腸感受態(tài)，挑取單克隆進行鑒定測序。鑒定成功的重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101。LB培養(yǎng)基擴繁農(nóng)桿菌并注射煙草葉片，2 d后使用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細胞定位情況，使用DAPI染料（迪醫(yī)生物，上海）進行核染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 DdSPL基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

基于德陽柿全基因組數(shù)據(jù)，獲得51條德陽柿SPL基因候選序列，使用Pfam網(wǎng)站對候選蛋白結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，根據(jù)E值結(jié)果對這些基因序列進行篩選，剔除不含SBP結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)域不完整的序列，共篩選鑒定獲得38條DdSPL基因，并按照其在染色體上的位置依次命名為DdSPL1～DdSPL38。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果（表3）顯示，DdSPL多肽鏈長度在147～1 136個氨基酸之間，蛋白質(zhì)的分子量在16.551 26～126.028 70 ku之間，等電點范圍在 6.22～9.76之間，其中編碼蛋白序列最長的是DdSPL14，最短為DdSPL7。

蛋白的功能結(jié)構(gòu)域?qū)τ诜诸惡蜕钊氲毓δ苎芯糠浅Ｖ匾?，因此?gòu)建了DdSPL蛋白SBP結(jié)構(gòu)域的序列標志。如圖2所示，德陽柿SPL家族成員的SBP保守結(jié)構(gòu)域中含有2個鋅指結(jié)構(gòu)（ZN-1，ZN-2）和1個核定位信號（NLS），Zn-1結(jié)構(gòu)包含的氨基酸殘基為Cys Cys Cys His，Zn-2結(jié)構(gòu)則為Cys Cys His Cys。德陽柿SPL家族成員中，DdSPL11的Zn-1結(jié)構(gòu)是Cys Cys Cys Cys，DdSPL15、DdSPL31的 Zn-2 結(jié)構(gòu)是Cys Cys Gln Cys。綜上，SBP結(jié)構(gòu)域在同種植物某些位置高度保守。

2.2 DdSPL基因家族的染色體分布

使用TBtools在基于各基因長度和其在染色體上的位置，繪制出染色體定位圖譜，由圖3可知，38個DdSPL基因不均勻分布在19條染色體上，Chr20和Chr30染色體上基因數(shù)量最多，均有4個；Chr06、Chr10[JP+2]和Chr18次之，分別有3個DdSPL； Chr07、Chr12、Chr15、Chr16、Chr21、Chr25和Chr28最少，僅有1個DdSPL。

2.3 DdSPL基因家族的系統(tǒng)進化分析

為了進一步分析德陽柿SPL基因家族成員之間的進化關(guān)系，選取擬南芥、水稻、番茄、葡萄、蘋果SPL基因家族各蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建，并進行聚類分析。結(jié)果（圖4）表明，SPL蛋白在植物中可分為8個分支，在擬南芥和德陽柿之間是保守的，除第7分支外每個分支至少包含1個AtSPL蛋白。 Clade1亞家族中包含的成員最多， 有

26個，其中有5個DdSPL蛋白；其次是Clade5，有25個成員，10個DdSPL蛋白；Clade6有24個成員，8個DdSPL蛋白；Clade3和Clade4均有17個成員，分別有4、5個DdSPL蛋白；Clade8有10個成員，2個DdSPL蛋白；Clade2有9個成員，2個DdSPL蛋白；Clade7亞家族包含的成員最少，僅有5個，其中有2個DdSPL蛋白。此外，德陽柿和葡萄、蘋果的SBP蛋白聚集較近，同源性較高。

2.4 DdSPL基因家族的共線性分析

片段的串聯(lián)重復(fù)是染色體基因家族擴增的原因之一，研究共線性對探究物種起源具有重要意義。利用TBtools分析了德陽柿SPL基因家族成員中的大片段基因重復(fù)現(xiàn)象。結(jié)果（圖5）表明，德陽柿38個SPL基因家族成員中存在49對直系同源基因?qū)?，存在大片段?fù)制的基因在30條德陽柿染色體（LG）上分布不均勻，說明德陽柿在進化過程中出現(xiàn)了基因片段重復(fù)和基因串聯(lián)重復(fù)。

2.5 DdSPL基因的結(jié)構(gòu)和保守基序

使用GSDS 2.0分析基因結(jié)構(gòu)（圖6-A）發(fā)現(xiàn)，外顯子的數(shù)量變化差異明顯。根據(jù)結(jié)果將DdSPL分為9個組，其中G2組的內(nèi)含子數(shù)量最多，尤其是DdSPL5有15個外顯子；而G9組成員最少，僅1個成員，DdSPL11含有11個外顯子；其次為G1、G4、G7分別含有外顯子3～6個不等； G5、G8均有2個

成員，內(nèi)含子數(shù)量分別是3、5個；G6的2條序列均含有3個外顯子，G3的成員基因結(jié)構(gòu)最簡單，僅有2個外顯子。外顯子在不同亞組之間可能不同，而同一亞組內(nèi)的外顯子數(shù)量相似，由此推測每個亞組內(nèi)基因的功能較為相似。

使用MEME評估了所有DdSPL成員的基序組成（圖6-B），在DdSPL中識別了12個不同的motif，結(jié)果顯示所有成員的基序有3～10個不等，所有的DdSPL蛋白均含有3個motif：motif1、motif2和motif3，motif1和motif2分別為SBP-box的鋅指結(jié)構(gòu)和核定位信號。進化樹聚集的成員motif大致相似，G2組成員DdSPL12、DdSPL14、DdSPL30、DdSPL5、DdSPL6、DdSPL26結(jié)構(gòu)相似，含有motif4～motif12，G7組中DdSPL4、DdSPL22、DdSPL23的motif完全相同，除3個共有motif外還含有motif6。這種序列的保守和差異可能反映出德陽柿在進化過程中功能的保守性和差異性。

2.6 亞細胞定位分析

構(gòu)建由35S啟動子驅(qū)動的pCAMBIA 2300過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時表達于本氏煙草。結(jié)果顯示，35S：：GFP-DdSPL8、35S：：GFP-DdSPL13、35S：：GFP-DdSPL18蛋白的熒光信號均定位在細胞核上（圖7）。

2.7 DdSPL基因在不同組織的表達分析

對德陽柿成花相關(guān)基因DdSPL7、DdSPL8、DdSPL13、DdSPL16、DdSPL18設(shè)計定量引物，探討其在不同時期不同部位的表達模式。結(jié)果（圖8）顯示，DdSPL16基因在各個時期莖、葉、頂芽（花）這3個部位并無明顯差異。DdSPL8在不同部位表現(xiàn)出不同的表達模式，幼苗期在頂芽中表達量最高，在現(xiàn)蕾期和開花期的頂花中表達量逐漸降低；在葉片中各時期表現(xiàn)為先降低后升高，在開花期表達量最高。DdSPL7、DdSPL13和DdSPL18這3個基因表現(xiàn)為相似的表達模式， 在幼苗期和現(xiàn)蕾期的莖、葉、頂芽（花）中表達量相對較少，在開花期的葉片中表達量明顯提高，尤其是DdSPL13在葉中的表達量是其在幼苗期莖中表達量的155倍。表明這3個基因可能參與德陽柿當(dāng)年生實生苗的早花調(diào)控過程，其作用機制有待進一步研究。

3 討論

SPL基因作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，對植物生長發(fā)育起著重要作用。SPL在不同物種中的數(shù)量也有很大差異，例如甜橙有15個CsSPL基因，藍莓有56個VcSPL基因，水曲柳有36個FmSPL基因，馬尾松有11個PmSPL基因，紅花有21個CtSPL基因［20-24］。本研究中根據(jù)德陽柿基因組數(shù)據(jù)共篩選得到38條DdSPL序列，按照其在染色體上的位置依次命名為DdSPL1～DdSPL38。德陽柿SPL轉(zhuǎn)錄因子蛋白長度變化范圍較大，這可能與該家族成員功能的多樣性有關(guān)。隨后構(gòu)建了DdSPL蛋白SBP結(jié)構(gòu)域的序列標志進一步確認該家族成員信息。

植物的SPL家族最初歸為2～3組，隨著近些年研究的深入被細分為8～9個亞族［12，25］。例如擬南芥、麻風(fēng)樹、水曲柳SPL基因家族依據(jù)進化關(guān)系構(gòu)建成系統(tǒng)發(fā)育進化樹均被細分為8個亞族［5，26-27］。本研究中將德陽柿和不同物種植物如擬南芥、蘋果等的SPL基因編碼的蛋白構(gòu)建進化樹，也可分為8個亞族，其中AtSPL被劃分在除Clade7亞族之外的7個亞族，而DdSPL在各亞族中均有分布。當(dāng)?shù)玛柺恋腄dSPL被單獨做進化樹歸類時，又可分為9個亞族（圖6-A）。同一聚類的基因具有相似的氨基酸結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)，外顯子的數(shù)量基本相似，這暗示它們在系統(tǒng)進化過程中相對保守，可能表現(xiàn)為相似的基因功能。通過對DdSPL的保守基序進行分析發(fā)現(xiàn)，所有的DdSPL均含有motif1、motif2、motif3，而G2組還具有最多的保守基序，最多的外顯子，推測其在德陽柿生長發(fā)育中起到特殊功能。

擬南芥SPL3/SPL4/SPL5和SPL9/SPL15在其成花誘導(dǎo)和階段轉(zhuǎn)化中起著重要作用［28］。在擬南芥中過量表達AtSPL3、AtSPL4、AtSPL5、AtSPL9和AtSPL15均可以促進開花［29-30］。在其他物種中也發(fā)現(xiàn)SPL基因?qū)Τ苫ㄓ蟹e極作用，誘導(dǎo)植物從幼年期轉(zhuǎn)向成年期［31］。在德陽柿中分別鑒定出AtSPL3、AtSPL4、AtSPL5和AtSPL9的同源基因DdSPL13/DdSPL18、DdSPL16、DdSPL7和DdSPL8。通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn)DdSPL8、DdSPL13、DdSPL18均定位在細胞核中，這與牛明月報道的光皮樺SPL基因定位在細胞核中的結(jié)果［32］一致。說明DdSPL8、DdSPL13、DdSPL18作為轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中發(fā)揮調(diào)控作用，具有核定位功能。本研究分析了德陽柿不同組織部位中部分成花相關(guān)的DdSPL表達模式，結(jié)果顯示，德陽柿G3亞群的基因DdSPL7、DdSPL13、DdSPL18以及G5亞群的DdSPL8均在開花期的葉中有較高表達，推測G3、G5亞群基因?qū)Φ玛柺翆嵣玳_花周期調(diào)控具有積極作用。

4 結(jié)論

本研究首次從德陽柿基因組中鑒定出38個SPL家族成員，并對其進行了全面的生物信息學(xué)研究，包括理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體位置、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、共線性分析和表達模式分析等，發(fā)現(xiàn)所有成員均含有SBP結(jié)構(gòu)域且高度保守；DdSPL7、DdSPL8、DdSPL13、DdSPL18在葉中高表達，推測其可能參與德陽柿成花調(diào)控。本研究結(jié)果為探索德陽柿實生苗早花現(xiàn)象背后的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2022YFD2200400）。

作者簡介：李家艷（1999—），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要研究方向為分子生物學(xué)。E-mail：lijiayan182@163.com。

通信作者：關(guān)長飛，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事柿種質(zhì)資源收集保存、鑒定評價研究。E-mail：guanchangfei@nwafu.edu.cn。