摘要：為確定白蠟樹葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征，密碼子偏好性模式及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。以10年生白蠟樹葉片為材料，利用高通量技術(shù)測定葉綠體基因組DNA序列，組裝、注釋基因組后，進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，白蠟樹葉綠體基因組為典型的4分區(qū)域結(jié)構(gòu)，全長為155 610 bp，GC1、GC2、GC3和GCall含量分別為47.1%、39.6%、28.3%和38.3%，其密碼子第3位更加偏向于使用A和U作為堿基。有效密碼子數(shù)平均值為51.021，最低為46.679，最高為56.643，其密碼子使用偏好性較弱。中性繪圖顯示，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.020，而回歸系數(shù)為0.029，說明密碼子使用偏好性很大程度上受到自然選擇的影響。ENC-plot繪圖顯示，白蠟樹葉綠體基因組密碼子主要傾向于隨機(jī)使用密碼子，部分基因偏好性受堿基突變的影響。PR2-plot分析可得，T頻率高于A，G頻率高于C，密碼子使用模式受自然選擇等多種因素影響。通過構(gòu)建基因的高低表達(dá)庫，篩選得到了4個(gè)（UUG、GCU、UCU、CGA）共有最優(yōu)密碼子。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，白蠟樹與韓國白蠟親緣關(guān)系較近。綜上所述，白蠟樹葉綠體基因組密碼子偏好性主要受自然選擇和突變的影響，該結(jié)果為白蠟樹的分類進(jìn)化、優(yōu)化基因工程等進(jìn)一步研究提供了依據(jù)，可以促進(jìn)白蠟樹資源的開發(fā)和利用。

關(guān)鍵詞：白蠟樹；葉綠體基因組；密碼子偏好性；最優(yōu)密碼子；序列分析

中圖分類號：Q943.2；S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0036-09

葉綠體是含有葉綠素的一種植物細(xì)胞器，是進(jìn)行光合作用、代謝反應(yīng)的重要質(zhì)體，是進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換的重要場所，轉(zhuǎn)化的生物質(zhì)能源相當(dāng)于每年能源消耗量的10倍，化石能源消耗的20倍，為地球大量生物提供了必需的能源［1-2］。同時(shí)葉綠體具有自身獨(dú)立的DNA，結(jié)構(gòu)相對簡單，序列相對保守，不易發(fā)生重組，是植物細(xì)胞特有的半自主細(xì)胞器，且大部分被子植物葉綠體基因組為母系遺傳，不存在基因重組等問題，進(jìn)化速率適中，基因編碼區(qū)與非編碼區(qū)進(jìn)化速度存在明顯差異，成為系統(tǒng)發(fā)育中區(qū)分不同分類階元的重要手段［2-3］，是系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)等研究領(lǐng)域的重要手段。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)在抗病蟲、抗鹽耐旱等農(nóng)藝性狀，胰島素、生長素等生物制劑及疫苗生產(chǎn)方面取得成功，并被廣泛應(yīng)用［4-5］。密碼子作為核酸與蛋白質(zhì)之間的橋梁，對遺傳信息傳遞至關(guān)重要，且蛋白質(zhì)合成過程中，在自然選擇、堿基突變、進(jìn)化過程中發(fā)生基因漂移，進(jìn)而產(chǎn)生同一密碼子偏性特征［6］，通過揭示密碼子偏好和選擇最優(yōu)密碼子靶向目的基因，為后續(xù)物種的密碼子優(yōu)化、葉綠體基因改造、擴(kuò)展外源基因表達(dá)等具有重要意義。

白蠟樹（Fraxinus chinensis Roxb.）為木樨科梣屬（Fraxinus）落葉喬木，材理通直堅(jiān)韌，萌發(fā)力強(qiáng)，是我國優(yōu)良的園林、經(jīng)濟(jì)樹木，還可以放養(yǎng)白蠟蟲生產(chǎn)白蠟，被稱為“蠟中之王”，其樹皮也可入藥（秦皮），還應(yīng)用于軍事、工業(yè)等領(lǐng)域，應(yīng)用十分廣泛［7］。在氣候變暖背景下白蠟樹在我國適生分布區(qū)面積呈現(xiàn)縮減趨勢［7］，葉綠體基因組是認(rèn)識植物資源保護(hù)利用和系統(tǒng)發(fā)育的重要分子基礎(chǔ)，然而關(guān)于白蠟樹葉綠體基因組尚未解析，基于葉綠體的系統(tǒng)發(fā)育分析和基因密碼子偏好性研究尚未發(fā)布。因此，本研究對白蠟樹葉綠體基因組進(jìn)行高通量測序、組裝注釋，通過分析其密碼子偏好性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等，以期為白蠟樹葉綠體基因組研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為白蠟樹進(jìn)一步開發(fā)利用和基因工程等方面研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年10月20日于河南省信陽市平橋區(qū)信陽農(nóng)林學(xué)院8號樓（32°10′0.62″N，114°7′9.12″E），采集白蠟樹無病害的新鮮綠葉，使用酒精棉擦拭后，快速放入裝有干冰覆蓋的自封袋中，并于當(dāng)日郵寄至北京諾禾致源科技股份有限公司天津?qū)嶒?yàn)室，2020年10月21日收到樣品進(jìn)行測序試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取DNA和測序

用CTAB法提取白蠟樹葉片DNA［8］，檢測合格后，經(jīng)Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長度為350 bp左右的片段，經(jīng)片段純化、末端修復(fù)等過程獲得測序文庫，質(zhì)檢合格后利用Illumina平臺的NovaSeq 6000 PE150測序儀，采用讀長為150 bp的片段，對葉綠體全基因組進(jìn)行雙末端測序。

1.2.2 基因的組裝和注釋

用NOVOPlasty軟件［9］對測序所得的白蠟樹Cleandata數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，使用GetOrganelle 1.7［10］軟件進(jìn)行組裝，選擇默認(rèn)參數(shù)，獲得一個(gè)完整環(huán)狀葉綠體基因組。使用在線注釋工具GeSeq［11］，對完整的基因組序列進(jìn)行功能注釋，然后對注釋結(jié)果進(jìn)行檢查并手動(dòng)矯正，進(jìn)一步確認(rèn)tRNA和rRNA注釋信息，最后將結(jié)果提交至GenBank，獲得的序列號為MW599993.1。利用OGDRAW［12］把得到的注釋文件轉(zhuǎn)化為物理圖譜，GC含量使用MEGA-X［13］軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 密碼子組成及偏好性分析

運(yùn)用軟件Codon W 1.4.2分析其葉綠體基因組的有效密碼子數(shù)（effective number of codon，簡稱ENC）、相對同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage，簡稱RSCU）等密碼子組成參數(shù)，RSCU>1的密碼子具有偏好性［14］。使用在線軟件CUSP分別導(dǎo)出各基因密碼子第1、2、3位的GC含量及總GC含量（以GC1、GC2、GC3、GCall表示），使用軟件SPSS 23.0進(jìn)行相關(guān)性分析。中性繪圖分析以GC1和GC2的平均值GC12為縱坐標(biāo)，GC3為橫坐標(biāo)，ENC-plot分析以ENC=2+GC3s+{29/［GC3s+（1-GC3s）2］}為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，GC3s為橫坐標(biāo)，ENC為縱坐標(biāo)，PR2-plot 分析以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)，A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)，均繪制為散點(diǎn)圖［15-17］。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

以白蠟樹葉綠體基因組序列和其他在我國有栽培分布的木樨科（10個(gè)屬27個(gè)種）植物葉綠體全基因組序列為研究對象，使用MAFFT進(jìn)行序列比對，導(dǎo)入軟件MEGA-X后，篩選出最優(yōu)模型GTR+G［18］，選擇關(guān)系較遠(yuǎn)的素馨屬茉莉花（Jasminum sambac）［19］為外類群，以自展值為1 000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基本結(jié)構(gòu)特征

通過葉綠體基因組組裝得到長度為155 610 bp的白蠟樹葉綠體全基因組，為四分體結(jié)構(gòu)，1個(gè)大單拷貝區(qū)（LSC），1個(gè)小單拷貝區(qū)（SSC）和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（IR）。LSC區(qū)長度為86 486 bp，GC含量占35.8%，SSC區(qū)長度為17 760 bp，GC含量占32.0%，2個(gè)反向重復(fù)序列長度為25 682 bp，GC含量占43.2%（圖1）。

白蠟樹葉綠體全基因組的注釋結(jié)果（表1）表明，共有131個(gè)基因，包含88個(gè)蛋白編碼基因，8個(gè)rRNA基因以及35個(gè)tRNA基因。注釋結(jié)果顯示，在白蠟樹葉綠體基因中，有16個(gè)基因具有內(nèi)含子，其中只有rps12、ycf3和clpP基因具有2個(gè)內(nèi)含子。

白蠟樹葉綠體基因組密碼子主要參數(shù)結(jié)果（表2）表明，白蠟樹葉綠體基因組密碼子編碼區(qū)GC的含量在30.9%～46.2%之間，平均含量為38.3%；且GC含量在密碼子中分布不均勻，表現(xiàn)為GC1>GC2>GC3，平均值分別為47.1%、39.6%和28.3%，表明白蠟樹葉綠體基因密碼子中A和T的使用頻率高于G和C。白蠟樹葉綠體基因組密碼子的ENC位于46.67～56.65之間，平均值為51.021，皆遠(yuǎn)大于45.0，表明白蠟樹葉綠體基因組密碼子的使用偏好性較弱。

運(yùn)用SPSS 23.0軟件對白蠟樹葉綠體基因組密碼子的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（表3）表明，相關(guān)性達(dá)到極顯著水平的有6組，分別為GC1含量與GC2含量，GC1、GC2、GC3含量與GCall含量，ENC與GC3、GCall含量；而GC3含量與GC1、GC2含量相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，說明密碼子第1、2位堿基的組成相似，第1、2位與第3位上的堿基差異較大。另外ENC與GC1、GC2含量未達(dá)到顯著相關(guān)水平，而與GC3含量的顯著相關(guān)系數(shù)（0.999）遠(yuǎn)大于與GCall的顯著相關(guān)系數(shù)（0.376），說明密碼子第3個(gè)位置堿基含量對密碼子偏好性影響最大，且GC3含量越高，密碼子的使用偏好性越強(qiáng)。

相對同義密碼子使用度能直觀地反映密碼子使用的偏好性，白蠟樹各氨基酸密碼子的RSCU分析結(jié)果（表4）表明，RSCU大于1的密碼子有30個(gè)，其中有16個(gè)密碼子以U結(jié)尾，有13個(gè)密碼子以A結(jié)尾，而以G結(jié)尾的密碼子僅有1個(gè)，表明以A、U結(jié)尾是白蠟樹葉綠體基因組所偏好的密碼子；RSCU等于1的密碼子有2個(gè)（分別為Met、Trp）；RSCU小于1的密碼子有32個(gè)，且多以C或G結(jié)尾。從各氨基酸密碼子的數(shù)量上看，白蠟樹葉綠體基因組占比最高的氨基酸為亮氨酸（Leu）。

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析結(jié)果（圖2）表明，白蠟樹葉綠體基因組密碼子中GC12分布在0.334～0.566之間，GC3分布在0.244～0.369之間。所有基因均分布于中心對角線以上，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.020，而回歸系數(shù)為0.029，相關(guān)性不顯著，表明白蠟樹葉綠體基因組密碼子第1和第2位堿基的組成與第3位堿基的組成存在較大差異。并且所有基因均落在了對角線上方，表明白蠟樹葉綠體基因組密碼子使用偏好性主要受到選擇壓力的影響，并非遺傳變異。

2.3 ENC-plot分析

由ENC-plot分析結(jié)果（圖3）表明，ENC實(shí)際值較大，偏離預(yù)期值，基因相應(yīng)的點(diǎn)落在了ENC期望曲線上或上方附近位置，表明白蠟樹葉綠體基因組密碼子主要傾向于隨機(jī)使用密碼子，部分基因偏好性受堿基突變的影響。未發(fā)現(xiàn)位于曲線下方的基因和偏離較遠(yuǎn)的基因，說明其偏好性較弱。

2.4 PR2-plot分析

由PR2-plot分析結(jié)果（圖4）表明，圖中的大部分基因分布于右下角象限內(nèi)，表示T的出現(xiàn)頻率高于A，G的出現(xiàn)頻率高于C，表明白蠟樹葉綠體基因組密碼子第3位堿基的使用具有一定的偏好性，說明密碼子使用模式雖然在一定程度上受到自身堿基突變作用，但該影響作用有限，主要受選擇壓力的影響，同時(shí)也受到其他因素的影響。

2.5 最優(yōu)密碼子分析

通過Codon W 1.4.2進(jìn)行分析，將同時(shí)滿足高頻（表4中RSCU>1）和高表達(dá)（ΔRSCU≥0.08）的密碼子為共有最優(yōu)密碼子。白蠟樹葉綠體基因最優(yōu)密碼子的分析結(jié)果（表5）顯示，最終篩選得到RSCU>1的密碼子有29個(gè)，ΔRSCU≥0.08的密碼子有28個(gè)，共有最優(yōu)密碼子僅有4個(gè)（UUG、GCU、UCU、CGA），以A、U結(jié)尾的有3個(gè)，以G結(jié)尾的有1個(gè)。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定白蠟樹在系統(tǒng)發(fā)育中的位置，將其葉綠體基因組序列和我國其他有栽培分布的木樨科10個(gè)屬27個(gè)物種葉綠體全基因組序列（從https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站獲?。┻M(jìn)行比對，使用軟件MEGA-X篩選出GTR+G最優(yōu)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹［18］，結(jié)果（圖5）表明，以素馨屬為外類群，其余物種聚成4支，自展支持率均達(dá)到了100%，說明該樹具有較高的可信度。從系統(tǒng)發(fā)育樹中得知，第1支有梣屬8個(gè)物種組成，且白蠟樹與韓國白蠟（Fraxinus chiisanensis）親緣關(guān)系較近，其他梣屬植物與其分為2系，其自展支持率為100%；第2支有木樨屬（Osmanthus）、流蘇樹屬（Chionanthus）、木樨欖屬（Olea）7個(gè)物種組成；第3支有丁香屬（Syringa）和女貞屬（Ligustrum）6個(gè)物種組成；第4支有雪柳屬（Fontanesia）、膠核木屬（Myxopyrum）、連翹屬（Forsythia）6個(gè)物種組成。系統(tǒng)發(fā)育分析初步揭示了白蠟樹在木樨科中的系統(tǒng)發(fā)育地位和進(jìn)化關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

被子植物葉綠體基因組為典型的4分區(qū)域結(jié)構(gòu)，是了解葉綠體功能、植物資源保護(hù)利用、細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)移、系統(tǒng)發(fā)育的重要分子基礎(chǔ)［19-21］。本研究首次通過測定白蠟樹葉綠體基因組DNA序列，組裝、注釋基因組后， 獲得完整環(huán)狀葉綠體基因組，大小為155 610 bp，為典型的四分體結(jié)構(gòu)，與趙月梅等研究的木樨科植物基因組特征［19］一致。GC含量在基因組變化過程中起著非常重要的作用，其不均勻分布可能造成基因組序列的保守性［22］；植物在進(jìn)化過程中IR區(qū)的擴(kuò)張或收縮，導(dǎo)致基因的變異、缺失和偽基因的產(chǎn)生，進(jìn)而使葉綠體基因組大小發(fā)生改變［6，22］；白蠟樹葉綠體基因組GC含量為38.3%，其中IR區(qū)GC含量43.2%，明顯高于LSC區(qū)和SSC區(qū)，與千果欖仁（Terminalia myriocarpa）、黃丹木姜子[CM（21]（Litseaelongata）等被子植物的研究結(jié)果［6，23］一致，可能是rRNA在該區(qū)域較高的GC值表達(dá)水平導(dǎo)致的。

同義密碼子使用偏倚是生物學(xué)中的一個(gè)重要現(xiàn)象，也是種群分類、進(jìn)化中不可避免的現(xiàn)象，反映了生物體在適應(yīng)環(huán)境和生存競爭中的復(fù)雜性和靈活性。生物體在進(jìn)化壓力、環(huán)境適應(yīng)性、基因表達(dá)過程中，葉綠體基因組密碼子使用偏倚受選擇壓力、堿基突變等多種因素復(fù)合影響，但偏倚程度因物種不同、環(huán)境變化產(chǎn)生差異［24-26］。由于葉綠體基因[21]組的獨(dú)特遺傳方式，使得密碼子偏好性分析對物種進(jìn)化的認(rèn)識、基因工程外源基因的表達(dá)和定點(diǎn)整合等方面具有重要意義［27］，而自然選擇、堿基突變是影響生物體密碼子偏倚的重要因素［28］，本研究通過分析GC含量、有效密碼子數(shù)、相對同義密碼子使用度、最優(yōu)密碼子，發(fā)現(xiàn)密碼子偏好性較弱，并偏好使用A、U結(jié)尾，這與滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）［29］、橄欖（Canarium album）［30］等雙子葉植物的研究結(jié)果一致。密碼子第3位上的堿基突變不會(huì)導(dǎo)致氨基酸類型的改變，因此其堿基受到選擇壓力相對較低［31-33］，可作為衡量密碼子使用偏好的指標(biāo)。本研究中中性繪圖顯示自然選擇是決定白蠟樹密碼子偏好性的主要因素；ENC-plot分析發(fā)現(xiàn)，白蠟樹主要傾向于隨機(jī)使用密碼子，部分基因偏好性受堿基突變的影響；從PR2-plot繪圖發(fā)現(xiàn)白蠟樹密碼子偏好性主要受選擇壓力的影響，同時(shí)還有其他因素，如堿基突變等的作用，這與燈盞花（Erigeron breviscapus）［34］、杜梨（Pyrus betulifolia）［35］、無刺龍舌蘭（Yucca treculeana）［36］等植物的分析一致，說明自然選擇和堿基突變是導(dǎo)致白蠟樹密碼子產(chǎn)[21]生偏倚的主要因素，這進(jìn)一步豐富了對白蠟樹密碼子偏倚成因的認(rèn)識。

形態(tài)學(xué)分類方法是根據(jù)植物形態(tài)特征，以復(fù)雜多樣的根、莖、葉、花、果實(shí)等外觀特征進(jìn)行分類辨別，存在觀察周期長、主觀因素占比大等影響因素，無法準(zhǔn)確迅速識別植物之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近［35］。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，該方法結(jié)合了系統(tǒng)發(fā)育研究與基因組學(xué)技術(shù)，使得植物間親緣關(guān)系在系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)中更加準(zhǔn)確和快速地被揭示，葉綠體基因組的穩(wěn)定性和保守性在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，該方法為解決一些分類困難類群的系統(tǒng)學(xué)問題提供了有效方案［37］，并已經(jīng)應(yīng)用在了鐵皮石斛（Dendrobium candidum）［38］、甘草（Glycyrrhiza uralensis）［39］等中醫(yī)藥材植物中。本研究基于木樨科27個(gè)物種的葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，且10個(gè)屬之間關(guān)系得到較高支持率。雪柳屬、膠核木屬和連翹屬原始類群位于進(jìn)化樹的基部，其分化起始于白堊紀(jì)早期，梣屬與木樨屬分化較晚，印證了趙月梅等對木樨科19個(gè)物種系統(tǒng)發(fā)育的研究猜想［19］，增加了數(shù)據(jù)支持。本研究發(fā)現(xiàn)，白蠟樹與韓國白蠟親緣關(guān)系較近，這可能是由于中新世海平面上升大陸部分淹沒，以及第四紀(jì)前的季風(fēng)氣候條件，使得白蠟樹分化出韓國白蠟［40］。本研究確定了我國栽植木樨科主要屬的系統(tǒng)發(fā)育地位。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31860228、31360197）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號：212102110186）；河南省科技興林項(xiàng)目（編號：YLK202138）；信陽市苗木花卉培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目。

作者簡介：黃 松（1968—），男，南陽內(nèi)鄉(xiāng)人，副教授，主要從事園藝植物栽培及科研管理工作。E-mail：13803862987@126.com。

通信作者：王 輝，碩士，教授，主要從事植物資源保護(hù)與利用研究。E-mail：tdhp2006@126.com。