收稿日期：2023-09-06

基金項目：云南省研究生導師團隊建設項目（2022100）；云南省“興滇英才支持計劃”青年人才專項（YNWR-QNBJ-2020-188）

作者簡介：朱 艷（2000-），女，云南昭通人，碩士研究生，主要從事森林保護相關研究。（E-mail）508034093@qq.com

通訊作者：韓長志，（E-mail）swfuhcz@163.com

摘要： 本研究旨在對比分析普通核桃與深紋核桃中葉綠體基因組密碼子的使用偏好性，對普通核桃與深紋核桃中各53條蛋白質編碼區(qū)序列開展預測分析，明確上述2種核桃葉綠體基因組中的最優(yōu)密碼子，為未來開展核桃物種的親緣關系研究提供理論依據(jù)。利用Codon W 1.4.2和在線軟件CUSP等分析普通核桃與深紋核桃中的葉綠體基因組密碼子，獲得相對同義密碼子使用度（RSCU）、有效密碼子數(shù)（ENC）、G+C含量等參數(shù)，再進行中性繪圖分析、有效密碼子數(shù)分析及奇偶偏好性分析。普通核桃與深紋核桃中葉綠體基因組的密碼子適應指數(shù)均為0.167，ENC均在45.00以上，表明密碼子偏好性弱。普通核桃與深紋核桃中葉綠體基因組密碼子的G+C含量整體表現(xiàn)為：基因中所有密碼子第1位堿基G+C的含量（GC1）＞基因中所有密碼子第2位堿基G+C的含量（GC2）＞基因中所有密碼子第3位堿基G+C的含量（GC3）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，第3位堿基的使用頻率表現(xiàn)為T大于A，G大于C。從普通核桃中篩選出14個最優(yōu)密碼子，從深紋核桃中篩選出17個最優(yōu)密碼子，其中共有23個最優(yōu)密碼子在第3個位置偏好以A/U結尾?？傊?，普通核桃和深紋核桃中葉綠體基因組密碼子偏好性主要受到自然選擇的影響，本研究結果可以為進一步探索核桃抗性遺傳基因的改良和表達提供理論基礎和數(shù)據(jù)支撐。

關鍵詞： 普通核桃；深紋核桃；葉綠體；基因組；同義密碼子；偏好性

中圖分類號： S664.1 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2024）08-1507-14

Comparison of codon usage characteristics of chloroplast genomes in Juglans regia and Juglans sigillata

ZHU Yan， HAN Changzhi

（College of Forestry， Southwest Forestry University/Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province， Kunming 650224， China）

Abstract： The aim of the study was to compare and analyze the usage preference of chloroplast genome codons in Juglans regia and Juglans sigillata， and to predict and analyze 53 protein coding sequences （CDS） in Juglans regia and Juglans sigillata， so as to clarify the optimal codons in the chloroplast genomes of the above two walnuts and provide a theoretical basis for the future research of the genetic relationship of walnut species. Codon W 1.4.2 and online software CUSP were used to analyze the chloroplast genome codons in Juglans regia and Juglans sigillata， and the relative synonymous codon usage （RSCU）， effective number of codons （ENC）， G+C content and other parameters were obtained. Neutrality plot analysis， effective number of codons analysis （ENC-plot）， and parity preference analysis （PR2-plot） were performed. The codon adaptation index of chloroplast genomes in Juglans regia and Juglans sigillata was 0.167， and the ENC was above 45.00， indicating that the codon preference was weak. The G+C content of chloroplast genome codons in Juglans regia and Juglans sigillata was as follows： the content of G+C at the first base of all codons in the gene （GC1）＞the content of G+C at the second base of all codons in the gene （GC2）＞the content of G+C at the third base of all codons in the gene （GC3）. Further analysis showed that the usage frequency of the third base was T＞A， G＞C. A total of 14 optimal codons were screened in Juglans regia， and 17 optimal codons were screened in Juglans sigillata. Among them， 23 optimal codons preferred the A/U end at the third position. In conclusion， the codon preference of chloroplast genome in Juglans regia and Juglans sigillata is mainly affected by natural selection， which provides theoretical basis and data support for further exploration of the improvement and expression of walnut resistance genes.

Key words： Juglans regia;Juglans sigillata;chloroplast;genome;synonymous codon;bias

生物體內(nèi)的各種蛋白質由20種氨基酸構成，其中色氨酸、甲硫氨酸只有1個由三核苷酸組成的密碼子，其他氨基酸有2～6個由三核苷酸組成的密碼子[1]。通過對密碼子開展分析能夠輔助識別自然界中的遺傳信息[2]，目前共有64個密碼子，18種氨基酸能夠利用其簡并性實現(xiàn)不同密碼子編碼同一氨基酸[3]。不同物種、同一物種不同組織或基因中的密碼子存在不均衡使用的情況，即同義密碼子偏好性（SCUB）[4-6]。最優(yōu)密碼子是在物種高表達基因中頻繁出現(xiàn)、使用頻率最高的密碼子，而部分很少使用甚至不會出現(xiàn)的密碼子稱為稀有密碼子或者非優(yōu)化密碼子[3]。SCUB一般會受到基因突變、自然選擇、基因漂移等多種因素影響[7]，對其開展研究，有助于了解物種之間的親緣關系、遺傳相似性、基因水平轉移、基因分子進化及系統(tǒng)發(fā)育等，進而促進外源基因的表達和轉基因作物研究的發(fā)展[8-10]。葉綠體是綠色植物和藻類能進行光合作用的細胞器[11]，具有基因組小、拷貝數(shù)多、結構簡單、進化保守等諸多優(yōu)點，因此，葉綠本作為研究對象被廣泛應用于DNA條形碼分子標記、系統(tǒng)進化以及基因工程等研究領域[8，12]。前人對不同物種葉綠體基因組中SCUB展開了分析工作，如肉蓯蓉（Cistanche deserticola Ma）[13]、茶樹（Camellia sinensis）[14]、二喬玉蘭［Yulania×soulangeana （Soul.-Bod.） D. L. Fu］[15]、蒜頭果（Malania oleifera Chun & S. K. Lee）[16]、榕樹（Ficus microcarpa L. f.）[17]和圓柏（Juniperus chinensis Roxb.）[18]。

作為世界四大干果之一，核桃中含有大量的營養(yǎng)物質[19]，自古以來就深受消費者的喜愛[20]，同時，作為“木本油料之王”，其在木材建筑、經(jīng)濟效益方面發(fā)揮的作用顯著[21]。深紋核桃（Juglans sigillata D.）又被稱為云南核桃、南方核桃[22]，主要分布于中國西南地區(qū)和西藏自治區(qū)雅魯藏布江中上游地區(qū)，生長于海拔1 300～3 300 m的山坡或山谷林中。普通核桃（Juglans regia L.）是胡桃屬植物，主要盛產(chǎn)于中國北方。目前有關上述2種核桃的研究工作主要體現(xiàn)在分子生物學方面，涉及種質資源、表型研究和遺傳多樣性等[22-24]，然而，關于核桃葉綠體DNA的研究較少。本研究擬以深紋核桃、普通核桃中葉綠體基因組的高通量測序結果為基礎，通過對比分析其葉綠體基因組蛋白質編碼區(qū)序列（CDS）的堿基組成，利用中性繪圖分析、有效密碼子數(shù)分析（ENC-plot）及奇偶偏好性分析（PR2-plot）等深入剖析影響密碼子偏好性的主要因素，并篩選獲得葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，以期為深入開展2種核桃的基因組研究、種質創(chuàng)新研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從美國國家生物技術信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中獲取普通核桃和深紋核桃的葉綠體基因組CDS序列，前者GenBank登錄號為KT963008.1，利用EditSeq計算G+C含量為36.23%；后者GenBank登錄號為MF167465.1，G+C含量為36.02%。通過在線軟件（https：//irscope.shinyapps.io/Chloroplot/）繪制普通核桃和深紋核桃的葉綠體基因組圖譜。

1.2 試驗方法

1.2.1 密碼子堿基組成分析 使用Codon W 1.4.2處理數(shù)據(jù)得到密碼子適應指數(shù)（CAI）、有效密碼子數(shù)（ENC）、相對同義密碼子使用度（RSCU），通過CUSP分析獲得基因中所有NHksyIPAY+9HEPE2JVAsCNJ8waLMkZ+8oAGj/+j4z8Y=密碼子第1位堿基、第2位堿基、第3位堿基G+C的含量（GC1、GC2、GC3），最后使用IBM SPSS Statistics、Excel、Origin等分析軟件分析并作圖[25]。

1.2.2 中性繪圖分析 分別以GC12（GC1和GC2的平均值）為縱坐標，GC3為橫坐標，繪制散點圖，分析密碼子使用偏好性的影響因素[26]，進而對密碼子不同位置的堿基使用性開展相關性分析[27]。

1.2.3 ENC-plot分析 分別以GC3作為X軸變量，ENC作為Y軸變量繪制散點圖，通過公式（1）計算出各基因的標準ENC并繪制標準曲線。ENC的理論取值為20～61，其值越接近20表明偏好性越強，反之，其值越接近61表明偏好性越弱，若散點與標準曲線接近，表示密碼子使用偏好性的主要影響因素是基因突變，若散點遠離標準曲線，說明密碼子使用偏好性的主要影響因素是自然選擇[28]。為了更好地評估ENC實際觀察值與ENC期望值之間的差異，根據(jù)公式（2）計算ENC比值并進行分析。

ENC=2+GC3+29/[GC32+（1-GC3）2]（1）

ENC比值=（ENCexp-ENCobs）/ENCexp（2）

式中，ENC表示基因中使用有效密碼子數(shù)；GC3表示基因中所有密碼子的第3位堿基G+C的含量；ENCexp表示ENC期望值；ENCobs表示ENC實際觀察值。

1.2.4 PR2-plot分析 分別以G3為分子，G3與C3的和為分母，所得比值為X軸變量；以基因中所有密碼子第3位堿基A的含量（A3）為分子，A3與基因中所有密碼子第3位堿基T的含量（T3）的和為分母，所得比值為Y軸變量，繪制散點圖[29]。中心點位置表示A=T、G=C，即密碼子不具有偏好性，其他點到中心點的距離表示該基因的偏倚程度。

1.2.5 最優(yōu)密碼子的確定 以密碼子的ENC作為分析偏好性的標準，選取升序排列后ENC最低和最高兩端各10%的基因，建立基因庫。分別計算2組的RSCU值和△RSCU值（高表達基因的RSCU值-低表達基因的RSCU值）[30]，確定2種核桃葉綠體基因組的高頻密碼子（RSCU＞1.00）和高表達密碼子（△RSCU≥0.08），最優(yōu)密碼子要同時滿足RSCU＞1.00、△RSCU≥0.08這2個條件[31]。

2 結果與分析

2.1 密碼子堿基組成分析

普通核桃和深紋核桃的葉綠體基因組呈雙鏈環(huán)狀，為典型的四分體結構（圖1、圖2），普通核桃大單拷貝區(qū)（LSC）為89 872 bp，小單拷貝區(qū)（SSC）為18 423 bp，反向重復區(qū)包括IRA和IRB，均為26 036 bp；深紋核桃LSC為89 871 bp，SSC為18 412 bp，IRA為26 034 bp，IRB為26 034 bp。普通核桃的葉綠體基因組一共注釋到136個基因，包括88個蛋白質編碼基因，40個tRNA基因和8個rRNA基因，其中光合作用的相關基因包括6類[5個光系統(tǒng)Ⅰ基因、13個光系統(tǒng)Ⅱ基因、12個還原型輔酶Ⅰ（NADH）-脫氫酶基因、6個細胞色素b/f復合物基因、6個ATP合酶基因、1個RuBisCO亞基基因]，自我復制的相關基因包括5類（15個小核糖體蛋白基因、11個大核糖體蛋白基因、4個RNA聚合酶基因、40個tRNA基因、8個rRNA基因），其他類型基因15個。深紋核桃的葉綠體基因組一共注釋到131個基因，包括86個蛋白質編碼基因，37個tRNA基因和8個rRNA基因，其中光合作用的相關基因包括6類[5個光系統(tǒng)Ⅰ基因、14個光系統(tǒng)Ⅱ基因、12個NADH-脫氫酶基因、6個細胞色素b/f復合物基因、6個腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合酶基因、1個RuBisCO亞基基因]，自我復制的相關基因包括5類（15個小核糖體蛋白基因、10個大核糖體蛋白基因、4個RNA聚合酶基因、37個tRNA基因、8個rRNA基因），其他類型基因13個。

利用GeneiousPrime對2種核桃的葉綠體基因組序列進行篩選，刪除長度過短或重復的CDS，選擇典型基因序列，最終普通核桃和深紋核桃各獲得53條CDS。進一步分析，普通核桃密碼子第3位堿基上T、C、A、G的含量分別為47.27%、15.55%、43.92%、16.21%；深紋核桃密碼子第3位堿基上T、C、A、G的含量分別為47.35%、15.50%、44.05%、16.10%，上述2種核桃中T3和A3高于G3和C3（表1）。

普通核桃的ENC范圍為37.68～58.08個，深紋核桃的ENC范圍為37.85～58.90個，進一步分析發(fā)現(xiàn)，共有74條（普通核桃37條、深紋核桃37條）葉綠體基因組序列的有效密碼子數(shù)大于45.00個，表明2種核桃葉綠體密碼子使用偏好性較弱，從表2可以看出，GC在不同位置、不同基因中未均勻分布。

對密碼子各參數(shù)進行相關性分析，結果（表3）表明，在普通核桃和深紋核桃中，ENC與GC3極顯著相關（P＜0.01），與GC1、GC2相關性不顯著，說明GC3對密碼子偏好性存在較強影響；GC1、GC2與GC3相關性不顯著，說明3個位置的堿基組成差異較大。

進一步對普通核桃和深紋核桃葉綠體基因組中各53條CDS進行分析，2種核桃RSCU大于1.00的密碼子數(shù)量均為32個，普通核桃中以U結尾且RSCU>1的密碼子有UUU、CUU、AUU、GUU、UCU、UAU、CAU、AAU、GAU、UGU，以A結尾且RSCU>1的密碼子有AUA、GUA、UCA、CCA、ACA、GCA、UAA、CAA、AAA、GAA、CGA、AGA、GGA，以G結尾、RSCU>1的密碼子有UUG、UCG、CCG、GCG、UAG、CGG、AGG、GGG，以C結尾且RSCU>1的密碼子為UCC（表4）。深紋核桃中不同之處之一是以A結尾的密碼子不含CGA，而含有UUA。由此可見，2種核桃以A和U結尾的密碼子出現(xiàn)頻率較高，為偏好密碼子。

2.2 中性繪圖分析

圖3顯示，普通核桃葉綠體基因組密碼子的GC12、GC3的取值范圍分別為0.333～0.543、0.210～0.365，深紋核桃葉綠體基因組密碼子的GC12、GC3的取值范圍分別為0.306～0.543、0.210～0.365，由此可見，2種核桃的葉綠體基因組密碼子分布基本重合，說明普通核桃和深紋核桃中葉綠體基因組密碼子的G+C含量接近。普通核桃GC12與GC3的回歸系數(shù)為0.379 7，決定系數(shù)為0.016 9；深紋核桃GC12與GC3的回歸系數(shù)為0.343 7，決定系數(shù)為0.028 2。2種核桃回歸系數(shù)均不接近1.000 0，說明G+C在第1位、第2位、第3位這3個位置的堿基組成差異大，GC12與GC3相關性不顯著。大部分基因位于對角線上方，綜合相關性分析和中性繪圖分析的結果，2種核桃葉綠體基因組密碼子的使用偏好性主要受自然選擇的影響。

2.3 ENC-plot繪圖分析

ENC-plot分析結果（圖4）表明，少數(shù)基因位于標準曲線上，該部分基因的ENC實際觀察值與ENC期望值差異較??；大部分基因遠離標準曲線，其ENC實際觀察值與ENC期望值相差較大。進一步分析基因與標準曲線的距離，并對ENC比值進行計算（表5），發(fā)現(xiàn)普通核桃和深紋核桃葉綠體密碼子基因組在-0.049～0.049區(qū)間的基因頻率為0.377，ENC實際觀察值與ENC期望值差距較大。上述結果表明普通核桃和深紋核桃葉綠體密碼子使用偏好性主要受到自然選擇的影響。

2.4 PR2-plot分析

密碼子偏好性僅受基因突變影響時，第3位堿基A/T、G/C具有相等的概率；受到自然選擇影響時，A/T、G/C的概率不均等。對上述CDS進行堿基奇偶性分析，結果（圖5）表明，2種核桃葉綠體基因在4個區(qū)域的基因位點呈現(xiàn)不均勻分布，在A3/（A3+T3）＜0.5和G3/（G3+C3）＞0.5區(qū)域分布得最多，表示密碼子在第3位堿基的選擇上具有偏好性，使用頻率表現(xiàn)為T＞A、G＞C。上述結果說明，普通核桃和深紋核桃葉綠體基因組密碼子偏好性受到自然選擇的影響。

2.5 最優(yōu)密碼子的確定

對5個高表達基因petD、rps18、rps14、cemA、petB以及5個低表達基因atpF、ndhK、rpl2、ycf2、ycf3中的同義密碼子進行計算，結果（表6）表明，普通核桃中有24個密碼子（其中11個以U結尾，6個以A結尾，3個以G結尾，4個以C結尾）的△RSCU（高表達基因的RSCU-低表達基因的RSCU）≥0.08，深紋核桃中有26個密碼子（其中11個以U結尾，8個以A結尾，3個以G結尾，4個以C結尾）△RSCU≥0.08。結合表4，普通核桃和深紋核桃中RSCU＞1.00的密碼子均為32個。同時滿足RSCU＞1.00和△RSCU≥0.08這2個條件的密碼子為最優(yōu)密碼子，從普通核桃中篩選出UUU、AUU、UUG、GUU、CUU、UCC、UCG、CCG、GCA、UAU、CAA、AAA、GAA、UGU共14個最優(yōu)密碼子；從深紋核桃中篩選出UCC、UCA、UCG、CCG、UUU、GCA、UUA、UAU、UUG、CAA、CUU、AAA、AUU、GAA、AUA、UGU、GUU共17個最優(yōu)密碼子，上述共有23個最優(yōu)密碼子在第3個位置偏好以堿基A/U結尾。

3 討論

密碼子作為生物體內(nèi)重要的遺傳信息，在核糖核酸翻譯為蛋白質的過程中發(fā)揮著重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，在自然環(huán)境中，生物體中同義密碼子的使用頻率逐漸適應宿主的生長環(huán)境，并出現(xiàn)不能均衡使用的情況[32-33]。密碼子使用偏好性受不同因素（基因序列堿基組成、自然選擇等）影響[34]，但一般認為自然選擇是影響密碼子使用偏好性的主要因素[35]。前人研究多將第3位堿基的G+C含量作為評價密碼子偏好性的關鍵參數(shù)[36]。ENC能反映同義密碼子非均衡使用的偏好情況，是最具參考價值的參數(shù)，ENC理論取值范圍為20～61[37]。

普通核桃和深紋核桃的葉綠體基因組密碼子中第1位、第2位和第3位堿基的組成都影響著葉綠體CDS的使用偏好。第3位堿基G+C含量總體小于第1位、第2位堿基，第3位堿基A、T含量均高于G、C含量，表明第3個位置上的堿基偏好使用A/T，這與南歐大戟（Euphorbia peplus L.）[33]、蒲桃屬（Syzygium Gaertn.）[38]、杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）[39]的密碼子使用偏好性相同。堿基奇偶性分析結果表明，在第3個位置上堿基使用頻率表現(xiàn)為T＞A、G＞C，說明2種核桃葉綠體基因組密碼子使用偏好性受自然選擇的影響，這與對木蘭[40]、柿樹[41]、薔薇科果樹[42]、紫花苜宿[43]等植物的分析結果相同；趙森等[44]分析秋茄，得出C大于G、T大于A的結果，說明秋茄葉綠體基因密碼子使用模式受到自然選擇的影響；竹節(jié)參葉綠體基因組密碼子的偏好分析結果表明，基因突變是影響其密碼子偏好形成的主要因素[45]，這與本研究結果不一致，說明不同植物密碼子使用偏好性受到的主要影響因素不盡相同。

4 結論

基于獲得的普通核桃、深紋核桃葉綠體基因組序列，進行堿基組成、中性繪圖分析、PR2-plot、RSCU值及ENC-plot分析比較，明確2種核桃擁有UUU、UUG、CUU、AUU、GUU、UCC、UCG、CCG、GCA、UAU、CAA、AAA、GAA、UGU共14個共同的最優(yōu)密碼子，多數(shù)以A或者U結尾，反映了相同分類單位、親緣關系近的生物密碼子偏好使用類似的堿基結尾[46-47]?；蛲蛔兒妥匀贿x擇共同影響普通核桃、深紋核桃葉綠體基因組密碼子的使用偏好性，但自然選擇為主要影響因素。普通核桃中有14個最優(yōu)密碼子，深紋核桃中有17個最優(yōu)密碼子，且最優(yōu)密碼子更傾向于以A/U結尾，本研究得到2種核桃葉綠體基因組表達的重要信息，對之后進行核桃物種進化及種質資源的研究有著重要作用，同時也為預測核桃未知蛋白質的基因、基因工程表達載體的設計等提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

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（責任編輯：王 妮）