關鍵詞： 錦鯉；環(huán)境；腸道微生物；功能預測

中圖法分類號： S917 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）02-0218-10

錦鯉（Cyprinuscarpio haematopterus）屬于鯉科，又被稱為緋錦鯉，是一種紅色鯉魚。在我國屬于知名度較高的觀賞魚種類，有“水中活寶石”、“會游泳的藝術品”等美譽，具有較高的經(jīng)濟價值。近些年來，人們的生活水平提高，消費者對具有觀賞性和美好寓意的錦鯉需求量不斷提高［1］。在池塘養(yǎng)殖過程中，如果水質(zhì)調(diào)控不好，魚類被有害菌感染，很容易在短期內(nèi)引發(fā)疾病，導致大量死亡。而采用抗生素拌料投喂和化學藥物浸浴則存在污染水質(zhì)和威脅水產(chǎn)品健康的問題［2］。因此，如何提高水產(chǎn)品免疫力是亟需解決的問題。

研究表明，微生物在水質(zhì)調(diào)節(jié)和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用［3］。作為魚類消化吸收重要場所，腸道內(nèi)擁有數(shù)量龐大、種類繁多的微生物群落，在免疫調(diào)控、代謝調(diào)控及揭示遺傳進化關系等方面發(fā)揮著重要的作用［4-5］。魚類腸道中優(yōu)勢菌門主要包括變形菌門、厚壁菌門和放線菌門等，優(yōu)勢菌屬包括鏈霉菌屬、桿菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬和氣單胞菌屬等，且淡水魚類和海水魚類的菌群結(jié)構(gòu)存在差異［6-8］。此外，野生和養(yǎng)殖環(huán)境下圓口銅魚、多鱗白甲魚、大菱鲆的腸道微生物組成和豐度也有差異［2，5，9］，表明生長環(huán)境也會影響腸道菌群結(jié)構(gòu)。

16S rRNA（16S ribosomal RNA）基因是細菌中編碼rRNA 所對應的DNA 序列，存在于全部細菌的基因組中，應用16S_rRNA 作為分子指標可以快速、微量、準確簡便的對水產(chǎn)動物腸道微生物進行分類鑒定［10-12］。油九菊等運用高通量測序技術分析了東海帶魚腸道微生物菌群多樣性［13］，蘇月華等用高通量測序技術分析出甲魚腸道中的優(yōu)勢菌群［14］。為探究了野生和養(yǎng)殖錦鯉腸道微生物與環(huán)境的關系，本研究采用高通量測序技術分析野生和養(yǎng)殖錦鯉腸道微生物多樣性并預測其功能，為探明錦鯉的環(huán)境適應機制及健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

實驗用錦鯉魚苗均為2021 年孵出，分別養(yǎng)殖在銅仁學院明德湖和銅仁學院水產(chǎn)工程中心池塘。分別在水產(chǎn)工程中心（養(yǎng)殖，CI）和明德湖（野生，WI）采集健康、體型相近的1 齡錦鯉各9 條（隨機分為3 組，每組3 條），在超凈工作臺內(nèi)用75%酒精對魚體進行全面消毒后，用解剖剪從肛門處剪開，取出腸道置于解剖盤，去除雜物并收集錦鯉腸道內(nèi)容物，置于-80 ℃冰箱中待測。

1.2 基因組DNA提取、擴增、純化

使用Mag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒（OmegaBio-Tek， USA）分別對CI和WI腸道微生物總DNA進行抽提。用NanoDrop2000 檢測DNA 純度和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA完整性。

1.3 PCR擴增、產(chǎn)物鑒定及純化

擴增引物對應區(qū)域：16S V3-V4 區(qū)，引物序列338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT；PCR 體系：DNA用量為10 ng，5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mMdNTPs 2 μL，引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase0.4 μL，BSA 0.2 μL，補ddH₂O至20 μL；PCR反應參數(shù)：1×（3 min，95 ℃），27 個循環(huán)數(shù)×（30 s，95 ℃；30 s 退火溫度55 ℃；45 s，72 ℃），10 min，72 ℃。PCR產(chǎn)物的鑒定用2%瓊脂糖凝膠電泳，純化采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 試劑盒（Axygen，USA）進行。

1.4 Illumina測序

采用Quantus? Fluorometer 檢驗和定量PCR產(chǎn)物。依據(jù)每一個樣品所需測序量，按比例混合樣品。使用TruSeq ? DNA Sample Prep Kit（Illumina， USA）進行PE 文庫構(gòu)建，經(jīng)MiseqPE300平臺測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用QIIME2 dada2 軟件進行質(zhì)控，修剪，去噪，拼接，以及去除嵌合體，得到特征序列表格；運用QIIME2 feature-classifier 軟件將ASV 的代表序列比對到GREENGENES 數(shù)據(jù)庫（ 根據(jù)338F/806R 引物對將數(shù)據(jù)庫修剪到V3V4 的區(qū)域），得到物種的分類信息表；用QIIME2 featuretable軟件剔除線粒體和葉綠體序列；運用LefSe方法鑒定樣本間豐度有差異的細菌；使用QIIME2 core-diversity 軟件計算多樣性矩陣，特征序列水平α 多樣性指數(shù)，包括OTUs、Chao1、香農(nóng)指數(shù)、simpson 指數(shù)和Faith’s 指數(shù)。最后，用PICRUSt2 軟件，根據(jù)ASV（或OTU）豐度表和ASV序列（或代表序列），預測樣本中的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列篩選

通過去除低質(zhì)量的序列、矯正錯誤堿基、去除嵌合體及短序列后，共得到序列262 691 條，平均43 782 條，其中優(yōu)質(zhì)序列最多為52 655 條，最少為35 864 條。去除嵌合體后有平均30 091 條有效序列（69.39%）（表1）。

2.2 物種篩選

對不同樣本中的微生物從界、門、綱、目、科、屬、種進行注釋，CI 組中界、門、綱、目、科、屬、種各注釋到數(shù)量分別為1、25、58、94、108、98、26，而WI 組中注釋到數(shù)量分別為1、17、34、48、55、40、13，兩組微生物群結(jié)構(gòu)有明顯差異（表2），且不同分類水平的注釋比例不同，種水平注釋到的數(shù)量最少（圖1）。

2.3 門水平上微生物群落分析

在門水平上，排名前五的為變形菌門（29.81%）、藍細菌門（25.57%）、綠彎菌門（18.16%）、軟壁菌門（13.97%）、厚壁菌門（1.74%），總占比達89.29%（圖2）。

2.4 屬水平上微生物群落分析

對不同樣本中屬水平上的微生物種類和相對豐度進行分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌屬有綠絲菌屬、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、軍團菌屬（Legionella）、紅細菌屬、暖繩菌屬、藤黃色桿菌屬、Arthronema、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、甲基彎曲菌屬（Methylosinus）、纖發(fā)鞘絲藍細菌屬、席藻屬（Phormidium） 、脫硫桿菌屬（Desulifobacca）等。其中，養(yǎng)殖環(huán)境下樣本中的優(yōu)勢菌屬有紅細菌屬、藤黃色桿菌屬、泉發(fā)菌屬（Crenothrix）；野生環(huán)境下樣本中的優(yōu)勢菌群有綠絲菌屬、纖發(fā)鞘絲藍細菌屬、暖繩菌屬。（圖3）

2.5 微生物在種水平上進行分析

對不同樣本種水平上的微生物種類和相對豐度進行分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌種有空腔污水球菌、Methylobacterium adhaesivum、湖泊玫瑰單胞菌、Proteocatella sphenisci、琥珀黃桿菌、胭脂甲桿菌、Reyranella massiliensis、葡萄土壤桿菌（Agrobacterium vitis）、Quadrisphaera granulorum、索氏鯨桿菌、淺綠黃假單胞菌（Pseudomonasviridiflava）、馬氏副球菌（Paracoccus marcusii）、Williamsia serinedens、西伯利亞橘色桿菌（Sandaracinobacter sibiricus） 、富油柵藻（Acutodesmus obliquus）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）。其中，養(yǎng)殖環(huán)境下樣本中優(yōu)勢菌有Methylobacterium adhaesivum、琥珀黃桿菌、胭脂甲桿菌、湖泊玫瑰單胞菌；野生環(huán)境下樣本中的優(yōu)勢菌為空腔污水球菌、Proteocatella sphenisci、湖泊玫瑰單胞菌、Reyranella massiliensis、索氏鯨桿菌。湖泊玫瑰單胞菌為兩組共有優(yōu)勢菌（圖4）。

2.6 不同環(huán)境下錦鯉腸道菌群差異物種分析

對于不同樣本中微生物種類豐度差異分析發(fā)現(xiàn)，屬水平上，CI 組表達豐度高于WI 組的菌屬有甲基嬌養(yǎng)桿菌屬（Methylotenera）、柯林斯菌屬（Collinsella）、芽孢桿菌屬（Bacillus），WI 組表達豐度高于CI 組的菌屬有Defluviicoccus、杜氏藻屬（Dunaliella）、放線菌屬（Nostcoida）、紅色單胞菌屬（Rubrimonas）。種水平上，CI 組表達豐度高于WI 組的菌種有活動甲基嬌養(yǎng)桿菌（Methylotenera mobilis）、產(chǎn)氣柯林斯菌（Collinsella aerofaciens）、彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）、壁芽孢桿菌（Bacillus muralis）；WI 組表達豐度高于CI 組的菌種有空腔污水球菌、杜氏藻（Dunaliella tertiolecta）、泥生綠菌（Nostocoida limicola）、產(chǎn)氣莢膜梭菌、克利夫頓淡紅色單胞菌（Rubrimonas cliftonensis）（圖5）。

2.7 Alpha多樣性分析

分析不同樣本中Alpha 多樣性，從Chao1、faith 指數(shù)（faith index）、香濃指數(shù)（shannon index）和simpson 指數(shù)（simpson index）來看，CI 組均高于WI組，但差異不顯著（Pgt;0.05），說明明養(yǎng)殖樣本的微生物豐富度和多樣性均比野生樣本高（圖6）。

2.8 OTU分布韋恩圖（Venn）

分析樣本之間的OTU組成，CI 樣本和WI樣本核心OTU 數(shù)為249，占養(yǎng)殖樣本的OTU 數(shù)的15.50%，占野生樣本OTU 數(shù)的46.54%，CI 樣本獨有OTU 個數(shù)為1 357，WI 樣本獨有的OTU 個數(shù)為286（圖7）。CI 樣本的OTU數(shù)量遠高于WI樣本的OTU數(shù)量，說明CI 樣本的物種多樣性和物種豐度比WI樣本的高。

2.9 錦鯉腸道菌群基因功能注釋

通過對錦鯉腸道菌群的潛在功能進行注釋后發(fā)現(xiàn)，L1 水平上注釋到新陳代謝（73.14%）、遺傳信息傳遞過程（10.31%）、細胞過程（6.03%）、人類疾?。?.31%）、環(huán)境信息處理過程（2.46%）、有機系統(tǒng)（2.76%）。L2 水平上共注釋到47 個信號通路（圖8）。L3 水平的豐度顯示，功能基因主要參與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、萜類和類固醇的生物合成、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、D-丙氨酸新陳代謝、鏈霉素生物合成等相關通路（圖9）。

采用ANOVA和Duncan方法進行差異比較，篩選出CI 組和WI 組差異顯著的KEGG 通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CI 組和WI 組差異顯著的通路有2-氧羧酸添加代謝、甜菜堿生物合成、安莎霉素的生物合成、雙酚降解、丁酸鹽代謝、二惡英降解、醚脂代謝、脂肪酸降解、糖胺聚糖降解、糖鞘脂生物合成系列神經(jīng)節(jié)等（圖10）。

3討論

腸道是水生動物與外部環(huán)境相互影響的關鍵器官之一，生長環(huán)境的不同對魚類腸道微生物的種類與豐度都有影響，且腸道微生物群落相對穩(wěn)定對于魚類的生長、發(fā)育和健康是非常重要的［13-15］。本研究討論了明德湖（野生）和銅仁學院水產(chǎn)工程中心（養(yǎng)殖）錦鯉腸道微生物多樣性的差異，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境中，微生物種群從目水平開始出現(xiàn)變化且菌落組成和結(jié)構(gòu)差異大，可見環(huán)境對微生物種群的影響極大。

孫中石等［16］發(fā)現(xiàn)變形菌門在錦鯉腸道中豐度最高，這與本研究結(jié)果一致。變形菌門和厚壁菌門是大多數(shù)魚類的腸道中優(yōu)勢菌門［17］。這可能與菌門的特點以及某些種類的功能有關，比如變形菌門是細菌中最大的門類，種類繁多；厚壁菌門則具有重要的促宿主能量吸收作用［18-19］。另外，變形菌門是水體環(huán)境中的優(yōu)勢菌門，廣泛存在于不同環(huán)境中［20］。孫中石等［16］發(fā)現(xiàn)錦鯉腸道優(yōu)勢菌屬為氣單胞菌屬、鯨桿菌屬、擬桿菌屬、弧菌屬、希瓦氏菌屬、沼桿菌屬。肖善勢等［21］研究發(fā)現(xiàn)千峽湖的翹嘴鲌、達氏鲌和紅鰭原鲌優(yōu)勢菌屬均為鯨桿菌屬、鄰單胞菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬和螺旋體屬。這與我們的結(jié)果不一致，可能是地域及品種的差異造成的。

在種水平上，野生和養(yǎng)殖錦鯉的腸道優(yōu)勢菌也存在差異。這可能是由于野生環(huán)境水體有自凈作用，如野生錦鯉腸道中空腔污水球菌和泥生綠菌為優(yōu)勢菌，這兩種菌均為活性污泥菌群用于污水處理［22， 23］。周文豪等［24］通過投喂不同餌料研究攝食對魚類腸道菌群影響，發(fā)現(xiàn)攝食不同餌料能明顯導致腸道菌群數(shù)量和菌群組成不同。因此，本研究中不同環(huán)境錦鯉腸道菌群數(shù)量和組成的差異，也可能與食物不同緊密相關。

分析微生物的Alpha 多樣性，結(jié)果表明養(yǎng)殖錦鯉的微生物豐富度和多樣性均比野生樣本高，這與多鱗白甲魚上的研究結(jié)果相似［2］，但與大菱鲆上的結(jié)果不同［9］。

腸道微生物通過為宿主細胞提供底物、酶和能量在代謝過程發(fā)揮重要作用［25］。通過對錦鯉腸道菌群的潛在功能的預測發(fā)現(xiàn)，錦鯉腸道微生物主要影響新陳代謝、遺傳信息傳遞過程。這與圓口銅魚上的研究結(jié)果一致［5］。對不同環(huán)境錦鯉腸道微生物功能的差異分析表明，養(yǎng)殖錦鯉腸道微生物的功能富集中雙酚降解、丁酸鹽代謝最為顯著，野生環(huán)境下類固醇降解最為顯著。雙酚A常作為塑料制品的添加劑，導致其在環(huán)境中的暴露問題，銅綠假單胞菌、紅球菌等都有降解雙酚的作用。養(yǎng)殖過程中使用的用具可能導致魚類接觸到更多的雙酚，進而導致雙酚降解的顯著富集。腸道內(nèi)丁酸鹽產(chǎn)生菌主要是厚壁菌門中的梭菌綱，丁酸是具有多種重要功能的腸道菌群代謝物，是腸道上皮細胞偏好的能源物質(zhì)，并且具有抗炎、預防和緩解肥胖及胰島素抵抗、促進粘液合成等功能［25］。類固醇等內(nèi)分泌干擾物暴露問題在水環(huán)境中日益嚴重，野生環(huán)境中魚體可能接觸更多的類固醇，而腸道中的某些微生物能夠降解類固醇，如紅球菌等［26］。

4結(jié)論

不同環(huán)境下錦鯉腸道微生物不論是在數(shù)量上還是群落結(jié)構(gòu)上都有明顯差異。錦鯉腸道微生物主要影響新陳代謝、遺傳信息傳遞過程等功能，為探究錦鯉的環(huán)境適應性提供了參考。