摘要：通過分析發(fā)酵對蘋果品質(zhì)影響的內(nèi)在機(jī)制，為蘋果功能成分及代謝調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，助力蘋果產(chǎn)業(yè)縱深發(fā)展。采用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析了高溫高濕條件下蘋果加工過程產(chǎn)生的各類差異代謝化合物，分別使用主成分分析方法、聚類熱圖、偏最小二乘判別方法、KEGG 通路富集等對代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，通過主成分分析（PCA）顯示了不同發(fā)酵過程中蘋果代謝組成的顯著階段性變化，代謝物質(zhì)鑒定表明，存在334種代謝物，其中脂質(zhì)和類脂分子所占比例最大，達(dá)到44.61%。利用聚類樹圖和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）揭示了在發(fā)酵末期蘋果樣本的代謝物水平明顯高于未發(fā)酵樣本，有效地區(qū)分了不同發(fā)酵階段的蘋果樣本。通過KEGG路徑分析進(jìn)一步指出，蘋果的苯丙素生物合成和苯丙氨酸代謝途徑在發(fā)酵期間非?；钴S，并且在高溫條件下激活了玉米素生物合成和鞘脂代謝的特定途徑，這對蘋果的高溫適應(yīng)性和風(fēng)味的形成具有重要影響。

關(guān)鍵詞：非靶向代謝組學(xué)；蘋果；高溫發(fā)酵；代謝途徑；代謝產(chǎn)物；多樣性；質(zhì)量控制；風(fēng)味形成

中圖分類號：S661.1；TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）08-0711-13

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.08.005

Analysis of Metabolite Diversity in Apple Processing Based on High Temperature and High Humidity Conditions

SONG Juan 1， 2， KANG Sanjiang 1， ZHANG Haiyan 1， ZENG Chaozhen 1， YUAN Jing 1， MU Yuwen 1， GOU Lina 1

（1. Agricultural Product Storage and Processing Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： By analyzing the intrinsic mechanisms of how fermentation affects apple quality， this study provides a scientific basis for the functional components and metabolic regulation mechanisms of apples， supporting the in-depth development of the apple industry. In this research， non-targeted metabolomics technology was utilized to analyze the diverse differential metabolic compounds generated during the processing of apples under high temperature and high humidity conditions. Various methods such as principal component analysis（PCA）， cluster heat maps， partial least squares discriminant analysis（PLS-DA）， and KEGG pathway enrichment were utilized to evaluate the metabolomic data. PCA revealed significant stage-wise changes in the metabolic composition of apples during different fermentation processes. Metabolite identification indicated the presence of 314 metabolites， with lipids and lipid-like molecules accounting for the largest proportion， reaching 44.61%. Utilizing cluster dendrograms and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）， it was revealed that the metabolite levels in the apple samples at the end of fermentation were significantly higher than those in the unfermented samples， effectively distinguishing apple samples at different fermentation stages. Further， KEGG pathway analysis pointed out that the biosynthesis of phenylpropanoids and the metabolism of phenylalanine in apples were very active during fermentation， and specific pathways for the biosynthesis of cornoside and sphingolipid metabolism were activated under high temperature conditions， which have an important impact on the high-temperature adaptability and flavor formation of apples.

Key words： Non-targeted metabolomics; Apple; High-temperature fermentation; Metabolic pathway; Metabolic product; Diversity; Quality control; Flavor formation

蘋果作為一種全球性的水果，不僅種植遍布世界各地并深受消費(fèi)者青睞，而且因其豐富的營養(yǎng)價值和在食品工業(yè)中的多樣化用途而備受重視。蘋果在貯藏和加工過程中，微生物發(fā)酵使蘋果經(jīng)歷復(fù)雜的代謝變化，涵蓋多個生物化學(xué)反應(yīng)和路徑，對蘋果的質(zhì)量、口感和風(fēng)味提升起著決定性作用段［1 - 2 ］。非靶向代謝組學(xué)技術(shù)正日益成為揭示食品發(fā)酵過程中顯著變化的關(guān)鍵手段。該技術(shù)不僅顯著增強(qiáng)了食品發(fā)酵的效率與品質(zhì)，而且在提升食品安全標(biāo)準(zhǔn)方面發(fā)揮了重要作用［3 ］。

目前，眾多學(xué)者采用一系列尖端分析技術(shù)，包括高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）等，對食品發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入的定性與定量分析，旨在揭示其內(nèi)在特性和生物學(xué)功能［4 - 6 ］。在對食品發(fā)酵過程的研究主要集中在代謝物的分析和形成機(jī)理方面，Salazar-Orbea等［7 ］利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，識別出在高溫加工過程中草莓的關(guān)鍵代謝標(biāo)記物，包括丙氨酸、蝶酰谷氨酸、2-羥基-5-甲氧基苯甲酸以及2-羥基苯甲酸β-D-葡萄糖苷。Markkinen等［8 ］通過核磁共振代謝組學(xué)方法分析了植物乳桿菌對沙棘汁發(fā)酵過程中的46種代謝物的變化，在發(fā)酵的早期階段，L-蘋果酸、多種必需氨基酸和核苷類物質(zhì)被大量利用，而糖類物質(zhì)則主要在發(fā)酵末期被消耗。彭玉嬌等［9 ］運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）識別出6982種代謝物，其中7種黃酮類化合物和6種氨基酸及多肽類化合物對黑果枸杞與紅果枸杞的氨基酸代謝過程具有顯著影響。陳云麗等［10 ］采用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析了陳化7～11 a的廣陳皮中的化學(xué)成分變化，觀察到陳化時間對陳皮中黃酮類、萜類、氨基酸及其衍生物的含量有顯著的影響。然而，關(guān)于蘋果在高溫條件下發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物多樣性的系統(tǒng)分析仍相對缺乏，限制了對蘋果發(fā)酵機(jī)制的深入理解和產(chǎn)品品質(zhì)的精準(zhǔn)控制。

本研究通過建立蘋果高溫發(fā)酵過程中的代謝圖譜以揭示發(fā)酵對蘋果品質(zhì)影響的內(nèi)在機(jī)制；并綜合運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)（LC-MS/MS）對蘋果在各個發(fā)酵階段的代謝物質(zhì)進(jìn)行細(xì)致的分析和持續(xù)監(jiān)控。利用主成分分析（PCA）、聚類分析和KEGG代謝途徑等復(fù)雜多元統(tǒng)計方法，準(zhǔn)確地識別和定量評估蘋果在發(fā)酵過程中的關(guān)鍵代謝物。不僅增進(jìn)了對蘋果在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物多樣性的理解，而且為蘋果的長期保鮮及加工利用提供了理論依據(jù)。這對于后期蘋果的開發(fā)利用和增強(qiáng)蘋果相關(guān)產(chǎn)品在市場中的競爭力，以及滿足消費(fèi)者對高端蘋果產(chǎn)品的追求均具有極其重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

供試蘋果品種為紅富士，由甘肅省靜寧縣靜寧蘋果試驗站提供。

蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，檸檬酸（色譜純）、3-辛醇（色譜純）由美國Sigma公司提供，葡萄糖、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、甲醇、乙腈、甲酸（色譜純）均由上海源葉生物科技有限公司提供。

MRS肉湯液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，醋酸鈉5 g，檸檬酸2 g，硫酸鎂0.1 g，硫酸錳0.05 g，吐溫801.0 g，pH 6.2±0.2（25 ℃），蒸餾水1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9003電加熱恒溫干燥箱由上海景宏實驗室儀器有限公司提供，HH-2恒溫水浴鍋由赫維生物科技股份有限公司提供，AE1204J電子天平由上海研豐電子科技有限公司提供，UV-6100BS紫外可見分光光度計由上海子期實驗設(shè)備有限公司提供，Scientz-10ND原位普通型真空冷凍干燥機(jī)由寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司提供，TGL-22S高速冷凍離心機(jī)由上海錦玟儀器設(shè)備有限公司提供，ICS-3000離子色譜儀由美國Dionex公司提供，TSQ Quantum Access液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀由美國Thermo Scientific公司提供。

1.3 測定方法

將供試紅富士蘋果隨機(jī)分為4組，分別為A組（對照組，未添加乳酸菌組）、B組（乳酸菌發(fā)酵前期，1～30 d）、C組（乳酸菌發(fā)酵中期，30～60 d）和D組（乳酸菌發(fā)酵末期，60～90 d）。對照組的前處理是蘋果未添加乳酸菌，處理組的前處理是蘋果經(jīng)過徹底清潔并添加活性乳酸菌，啟動24 ～48 h的基礎(chǔ)發(fā)酵過程?？刂茰囟葹?0～90 ℃、相對濕度維持在50%～90%的環(huán)境條件下蘋果按實驗設(shè)計持續(xù)發(fā)酵，分別提取各處理組蘋果樣品以進(jìn)行分析研究。

1.3.1 樣本前處理 參照周春娜等［11 ］的方法，稍有改動。在對蘋果樣本進(jìn)行質(zhì)量評估時，確保取樣環(huán)境嚴(yán)格無菌，以消除樣本間可能的交叉污染。精確量取100 μL樣本通過冷凍干燥法或使用液氮迅速凍結(jié)，磨成細(xì)粉狀，用甲醇和乙腈的混合液（體積比例為1∶1）進(jìn)行混合后放置于超聲波浴中持續(xù)震蕩30 min后，在4 ℃的條件下用高速離心機(jī)14 000 r/min處理10 min，利用0.22 μm孔徑的過濾膜進(jìn)行過濾，將得到的清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，保留干燥的樣品供后續(xù)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析（LC-MS/MS）使用。

1.3.2 QC制備 參照董春濤等［12 ］的方法，稍有改動。從各個樣本中提取10 μL稀釋液，將其混合以制備質(zhì)量控制樣本（QC樣本）進(jìn)行持續(xù)跟蹤和監(jiān)控分析，確保實驗過程中數(shù)據(jù)的一致性和可復(fù)制性。

1.3.3 色譜條件 參照Cortada-Garcia［13 ］、魏夢媛［14 ］的方法，稍有改動。使用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（Waters Corporation，Milford，USA）進(jìn)行液相色譜時，采用兩種流動相進(jìn)行梯度洗脫。流動相A為含有0.1%甲酸的超純水，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈。設(shè)置的梯度洗脫起始于95%的流動相A，持續(xù)5 min，隨后在10 min內(nèi)過渡至40% A，并在接下來的5 min內(nèi)進(jìn)一步減少至5% A，最后在5 min內(nèi)恢復(fù)至95% A并對色譜柱進(jìn)行平衡。設(shè)定流速為0.4 mL/min，色譜柱的溫度控制在40 ℃，每次注入5 μL的樣品進(jìn)行色譜分析。

1.3.4 質(zhì)譜條件 使用Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany）進(jìn)行代謝物的精確檢測［15 - 16 ］。離子源（ESI）參數(shù)設(shè)置：噴霧電壓3.5 KV，輔助氣體溫度400 ℃，鞘氣的流速為52 Arb，輔助氣的流速為14 Arb，儀器掃描的質(zhì)量范圍150～1 500 m/z，對每個檢測周期內(nèi)最高豐度的離子進(jìn)行5次的MS/MS掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Proteowizard V3.0.8789軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，通過保留時間（RT）和 m/z數(shù)據(jù)識別不同離子，記錄每個離子峰強(qiáng)度并最終輸出分子量、保留時間（RT）、峰面積和鑒定結(jié)果等信息。利用t檢驗檢測兩組樣本之間代謝物豐度差異，使用 FDR 對p值進(jìn)行多次校正（Benjamini-Hochberg）。利用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對代謝物進(jìn)行多變量分析，得到每個代謝物的變量投影重要度值（VIP）。同時滿足篩選條件 BenjaminiHochberg 校正值p -value < 0.05、PLS-DA 變量投影重要度值（VIP）>1、物質(zhì)倍數(shù)比值ratio≥2或者ratio≤1/2的代謝物被認(rèn)為是顯著差異代謝物。采用KEGG Mapper對篩選出的顯著差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。所有實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗質(zhì)控

2.1.1 QC相關(guān)性分析 在代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域中，使用質(zhì)量控制樣本（簡稱QC樣本）不僅可以評估實驗過程的穩(wěn)定性以及儀器性能，還可以確保實驗的一致性和數(shù)據(jù)的可靠性。從高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品QC相關(guān)性分析（圖1）可以看出，QC樣本QC-1、QC-2、QC-3的相關(guān)性分別為0.96、0.96、0.97，說明實驗采取的質(zhì)量控制措施非常有效，保證了得到的數(shù)據(jù)真實可靠。

2.1.2 樣本總體PCA分析 采用主成分分析（PCA）研究蘋果在發(fā)酵周期不同階段的代謝特征，由高溫發(fā)酵處理對蘋果樣本總體PCA分析（封三圖2）可知，蘋果樣本在2個主成分上共解釋了72.4%的數(shù)據(jù)變異，表明PCA技術(shù)能夠有效揭示蘋果在發(fā)酵過程中的主要代謝變化。特別是未添加乳酸菌的高溫發(fā)酵（A組）與乳酸菌高溫發(fā)酵末期（D組）的蘋果之間分離度顯著提高，表明發(fā)酵過程中蘋果的代謝特性發(fā)生了顯著的變化。然而，乳酸菌高溫發(fā)酵前期（B組）和中期（C組）的樣本雖然在PCA圖上有區(qū)別，但這些區(qū)別比較微小。這可能表明在發(fā)酵的前中期階段，蘋果的代謝路徑變化不夠劇烈，或者變化程度還沒有達(dá)到在PCA圖上能夠清晰區(qū)分的水平。用于質(zhì)量控制（QC）的樣本點(diǎn)聚集緊密，表明實驗操作的一致性。

2.2 代謝物鑒定分析

通過代謝物鑒定分析可以了解蘋果發(fā)酵過程中的生化反應(yīng)和代謝途徑的變化。從高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品的代謝物鑒定分析結(jié)果（封三圖3）可以看出，在高溫發(fā)酵條件下，蘋果樣本中檢測到的代謝物種類高達(dá)334種，覆蓋了蘋果中眾多的生物化學(xué)反應(yīng)和代謝通道。在這些代謝物中，脂質(zhì)和類脂物質(zhì)占據(jù)了顯著的比例，達(dá)到44.61%，這些成分在蘋果的氧化和水解等關(guān)鍵反應(yīng)中起著中心作用。苯丙素和聚酮類占比18.56%，主要包括黃酮和木質(zhì)素等成分，對蘋果的色澤和香氣等感官品質(zhì)有著重要影響。此外，有機(jī)含氧化合物和苯類化合物分別占11.98%和11.38%，這些物質(zhì)在蘋果的抗氧化防御和植物保護(hù)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有機(jī)酸及其衍生物和雜環(huán)化合物均占比5.99%，它們對于維持生物體內(nèi)的酸堿平衡和促進(jìn)代謝反應(yīng)的順利進(jìn)行起著至關(guān)重要的作用。盡管生物堿、核苷及均相非金屬化合物的比例較小，分別為0.60%、0.30%，但它們在細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞和基因表達(dá)調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。這些發(fā)現(xiàn)不僅在蘋果的研究中具有重要價值，而且與枸杞、鱖魚、桃紅葡萄酒等其他食品體系中的研究結(jié)果類似［9， 17 - 18 ］，進(jìn)一步證實了代謝物在多種食品加工和質(zhì)量控制中的普遍性和重要性。代謝物的這些功能對于提升食品的風(fēng)味特性和營養(yǎng)價值起著核心作用。

2.3 兩兩比較分析

2.3.1 正交偏最小二乘判別分析 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）作為一種有效的監(jiān)督學(xué)習(xí)工具，在識別樣本間差異及驗證模型穩(wěn)定性方面展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。由高溫發(fā)酵處理對蘋果正交偏最小二乘判別分析（圖4）可知，未添加乳酸菌的高溫發(fā)酵蘋果（A組）與乳酸菌發(fā)酵不同階段的蘋果樣本（B組、C組、D組）之間存在顯著性差異（P < 0.05），表明了發(fā)酵過程對蘋果樣本的化學(xué)組成產(chǎn)生了顯著影響。這些樣本之間的差異貢獻(xiàn)率則體現(xiàn)了發(fā)酵過程中化學(xué)成分變化程度，其中A組與B組、C組、D組的差異貢獻(xiàn)率分別是64.1%、69.6%、81.8%；而從發(fā)酵前期（B組）到中期（C組），再到發(fā)酵末期（D組）的差異貢獻(xiàn)率分別增加至68.7%和77.4%，尤其是在乳酸菌發(fā)酵末期的樣本（D組）的差異貢獻(xiàn)率達(dá)到83.1%，表明在乳酸菌發(fā)酵的最后階段，蘋果的化學(xué)成分變化最為劇烈。這一發(fā)現(xiàn)與其他食品如陳皮、石榴汁、黑糯米酒、牛奶等研究所得結(jié)果相似［10， 19 - 21 ］，表明在食品發(fā)酵的末期可能形成了一些關(guān)鍵生物標(biāo)志物，這些標(biāo)志物在評價樣本的化學(xué)變異性中起了決定性的作用。

2.3.2 差異物質(zhì)篩選 差異物質(zhì)篩選作為一種強(qiáng)有力的可視化工具，有效地揭示了不同樣本間代謝物差異的數(shù)量。由高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品差異物質(zhì)篩選分析（圖5）可知，蘋果在不同發(fā)酵階段存在顯著的代謝物差異（P < 0.05）。特別是在未添加乳酸菌的高溫發(fā)酵階段（A組）與乳酸菌發(fā)酵前期階段（B組）的轉(zhuǎn)變期間，有242種代謝物表現(xiàn)出顯著變化。其中193種代謝物表達(dá)上調(diào)，49種代謝物表達(dá)下調(diào)，表明在發(fā)酵前期階段，代謝活動非?；钴S，新的代謝物產(chǎn)生很可能是微生物活動和酶促反應(yīng)共同作用的結(jié)果。這一階段對于蘋果代謝途徑的轉(zhuǎn)換及其代謝物的多樣性顯得尤為關(guān)鍵。然而，在蘋果的發(fā)酵過程中，從乳酸菌發(fā)酵前期階段（B組）到中期階段（C組）的轉(zhuǎn)變，發(fā)酵中的代謝物種類和數(shù)量并未出現(xiàn)明顯的變化，表明蘋果在此發(fā)酵階段的代謝系統(tǒng)展現(xiàn)了一定的穩(wěn)定性。這可能是蘋果適應(yīng)持續(xù)高溫環(huán)境的結(jié)果，同時也反映了代謝物可能在此階段繼續(xù)累積。當(dāng)進(jìn)入到乳酸菌發(fā)酵的末期階段（D組），差異代謝物的總數(shù)減少至125種，其中111種差異代謝物表達(dá)上調(diào)，14種差異代謝物表達(dá)下調(diào)，表明蘋果在發(fā)酵的末期階段的代謝活動開始趨于平穩(wěn)，代謝途徑和代謝物的組成可能已經(jīng)形成一種動態(tài)平衡。這一發(fā)現(xiàn)與咖啡、發(fā)酵糙米等研究的結(jié)果類似［22 - 23 ］，表明食品的代謝穩(wěn)定性及其累積可能與其處于高溫發(fā)酵條件時的生理調(diào)整有著密切關(guān)系。

2.3.3 差異物質(zhì)聚類分析 差異物質(zhì)聚類分析是一種揭示發(fā)酵過程中關(guān)鍵代謝物和生物途徑的重要工具。從高溫發(fā)酵處理對蘋果樣品代謝物差異物質(zhì)聚類分析（封三圖6）可知，蘋果樣本在未添加乳酸菌（A）以及添加乳酸菌發(fā)酵前期（B）、發(fā)酵中期（C）和發(fā)酵末期（D）的代謝物表達(dá)量變化顯著（P <0.05），顏色從藍(lán)色漸變到紅色，形象地表現(xiàn)了隨著發(fā)酵進(jìn)程的推移，代謝物表達(dá)量的顯著變化。特別是在乳酸菌發(fā)酵末期（D），樣本普遍呈現(xiàn)出濃烈的紅色，表明這一階段代謝活動的顯著增強(qiáng)。此外，聚類圖中發(fā)現(xiàn)未添加乳酸菌發(fā)酵的蘋果樣本（A1、A2、A3）在聚類中分布緊密，表明這些樣本的代謝物組成具有較高的一致性和穩(wěn)定性，主要由基礎(chǔ)代謝產(chǎn)物如糖和有機(jī)酸構(gòu)成。乳酸菌發(fā)酵前期（B1、B2、B3）和中期樣本（C1、C2、C3）也形成了清晰的集群，表明代謝物在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化，可能與代謝活動的增強(qiáng)或降低有關(guān)。然而，乳酸菌發(fā)酵末期樣本（D1、D2、D3）展現(xiàn)了一個獨(dú)立的分支，表明在發(fā)酵的最后階段，蘋果內(nèi)部代謝物的組成變得更加多樣化和穩(wěn)定，這與板芪研究結(jié)果類似［24 ］，表明這些代謝物與可能對食品形成獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味起到關(guān)鍵作用。此外，圖中的質(zhì)量控制樣本（QC）的集中分布進(jìn)一步證實了實驗操作和分析的高度一致性，這對于確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。

2.3.4 差異物質(zhì)相關(guān)性分析 在研究蘋果發(fā)酵過程中代謝物關(guān)系的趨勢圖中，用灰色表示正相關(guān)性，即代謝物之間的協(xié)同作用；用黑色表示負(fù)相關(guān)性，反映了代謝物之間的抑制作用。由高溫發(fā)酵蘋果的差異物質(zhì)相關(guān)性分析（圖7）可知，隨著蘋果從未添加乳酸菌發(fā)dPdkOblaIDe4N83ZoMf3pA==酵狀態(tài)到乳酸菌發(fā)酵各階段的轉(zhuǎn)變，代謝物間的相互作用也發(fā)生了顯著變化（P <0.05）。從未添加乳酸菌發(fā)酵狀態(tài)到乳酸菌發(fā)酵的早期階段（A-vs-B），觀察到多個代謝物間的正相關(guān)性顯著增強(qiáng)，表明在發(fā)酵前期，新的代謝途徑被激活，代謝活動開始加速。隨著乳酸菌發(fā)酵進(jìn)入中期（A-vs-C）和末期（A-vs-D）時，這種正相關(guān)性進(jìn)一步加強(qiáng)，達(dá)到頂峰，這可能與蘋果對高溫環(huán)境的響應(yīng)以及代謝物的調(diào)整有關(guān)，反映了代謝過程中對環(huán)境變化的適應(yīng)性。然而，隨著發(fā)酵過程的延長，負(fù)相關(guān)性有所減少，這可能與某些代謝通路的阻斷或者代謝物積累相關(guān)。從乳酸菌發(fā)酵前期到中期（B-vs-C），代謝物間的協(xié)作持續(xù)增強(qiáng)，而競爭關(guān)系逐步消退，顯示了代謝過程從競爭性向合作性轉(zhuǎn)變，表明代謝網(wǎng)絡(luò)在自我優(yōu)化以提高效率。當(dāng)從乳酸菌發(fā)酵前期到末期（B-vs-D），雖然正相關(guān)性有所下降，負(fù)相關(guān)性可能略有上升。最終從乳酸菌發(fā)酵中期到末期（C-vs-D），代謝物間的正負(fù)相關(guān)性趨于平穩(wěn)，表明代謝路徑已經(jīng)成熟，代謝活動達(dá)到了一種穩(wěn)定狀態(tài)，這與脫水蘋果的研究結(jié)果類似［26 ］，顯示了代謝過程在長期發(fā)酵中的穩(wěn)定性。此外，研究中還識別出了一些在整個發(fā)酵過程中普遍存在的代謝物，如糠醇乙酸酯、草蒿素以及酪氨酸等，它們可能對蘋果發(fā)酵產(chǎn)品的整體品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)。同時，也發(fā)現(xiàn)了一些特定階段特有的代謝物，例如1，2-十七烷酰磷脂酰膽堿在乳酸菌發(fā)酵末期（A-vs-D）階段特有；而4-羥基香豆素和6-羥基麥角甾-4，22-二烯-3-酮分別在乳酸菌發(fā)酵中期到末期（C-vs-D）和乳酸菌發(fā)酵的早期（A-vs-B）階段特有；紅藻素 F的出現(xiàn)則在乳酸菌發(fā)酵的早期（A-vs-B）和乳酸菌發(fā)酵進(jìn)入中期（A-vs-C）階段，這可能暗示了這些代謝物在特定發(fā)酵階段的生物學(xué)功能和重要性。

2.3.5 差異代謝物富集 通過全面分析蘋果在不同發(fā)酵階段的KEGG代謝路徑，揭示蘋果在發(fā)酵過程中顯著的代謝適應(yīng)性和變化規(guī)律。由高溫發(fā)酵蘋果的差異代謝物富集分析（圖8）可知，在整個發(fā)酵過程中，蘋果通過激活或抑制特定的生物合成和代謝通路來應(yīng)對環(huán)境的變化，尤其對高溫環(huán)境的適應(yīng)和特殊風(fēng)味的形成起到了關(guān)鍵作用。特別是苯丙素的合成路徑在發(fā)酵過程的多個階段都表現(xiàn)出高活性，說明它對蘋果的適應(yīng)性至關(guān)重要。這一路徑不僅助于蘋果抵抗高溫壓力，還直接貢獻(xiàn)于其風(fēng)味和香氣的形成。另一方面，苯丙氨酸的代謝涉及生成多種生物活性分子，進(jìn)而促進(jìn)蘋果風(fēng)味的形成。在發(fā)酵的不同階段，還有其他幾個關(guān)鍵路徑顯示出活性變化。例如，代謝過程中甘油磷脂和輔酶的生物合成路徑保持活躍，這對于維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和基本的代謝功能至關(guān)重要。此外，環(huán)境信息處理機(jī)制也顯示了蘋果能夠感知并響應(yīng)發(fā)酵過程中的環(huán)境變化。和未添加乳酸菌的蘋果相比，乳酸菌發(fā)酵過程中特定的代謝路徑如玉米素生物合成在發(fā)酵前期（A-vs-B）和中期階段（A-vs-C）得到了激活，這可能與其在蘋果適應(yīng)高溫環(huán)境緊密相關(guān)。同樣，鞘脂代謝路徑在乳酸菌發(fā)酵的末期階段（A-vs-D）特別活躍，表明它在細(xì)胞信號傳遞中可能發(fā)揮重要作用。在經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵前期轉(zhuǎn)變到中期階段（B-vs-C）時，特定的抗氧化化合物如芪類和二苯庚烷類的活性表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)，表明這些成分可能在蘋果的防御體系中具有重要的保護(hù)功能。同時，嘌呤代謝路徑在乳酸菌發(fā)酵前期轉(zhuǎn)變到末期階段（B-vs-D）得到顯著提升，這關(guān)系到嘌呤類物質(zhì)的生產(chǎn)與分解，推測與DNA的合成和能量轉(zhuǎn)換過程緊密相關(guān)。此外，丁酸代謝在乳酸菌發(fā)酵中期轉(zhuǎn)變到發(fā)酵末期階段（C-vs-D）也有明顯上升，這可能與DNA合成及細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞機(jī)制關(guān)聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)與其他發(fā)酵食品如發(fā)酵茶、發(fā)酵紅豆、刺梨汁、蘋果渣等的研究結(jié)果相似［26 - 29 ］，反映了某些代謝路徑在多種發(fā)酵食品間的一致特征，表明食品在不同生長環(huán)境中的適應(yīng)性以及風(fēng)味的多樣性。

3 結(jié)論與討論

為揭示發(fā)酵對蘋果品質(zhì)影響的內(nèi)在機(jī)制，為蘋果功能成分及代謝調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，本研究通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，對高溫高濕條件下未添加乳酸菌的發(fā)酵蘋果（對照組）以及添加乳酸菌的發(fā)酵前期（1～30 d）、中期（30～60 d）和末期（60～90 d）的蘋果樣本在發(fā)酵過程產(chǎn)生的各類差異代謝化合物進(jìn)行了深入的代謝途徑分析，通過精確的實驗設(shè)計與嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)控，保障了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。利用主成分分析（PCA），揭示了蘋果在不同發(fā)酵階段的代謝活動存在顯著差異。通過代謝物的鑒定，發(fā)現(xiàn)在整個高溫高濕發(fā)酵過程中，共識別出334種代謝物，其中脂質(zhì)和類脂分子子所占比例最大，占比高達(dá)44.61%。采用聚類熱圖和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）更進(jìn)一步有效地區(qū)分了不同發(fā)酵階段的蘋果樣本和不同發(fā)酵階段間的顯著代謝差異，特別是在乳酸菌發(fā)酵的末期階段蘋果樣本的代謝物水平明顯高于未發(fā)酵樣本。通過KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，苯丙素的生物合成和苯丙氨酸的代謝在蘋果的整個發(fā)酵過程中非?；钴S，并且在高溫條件下激活了玉米素生物合成和鞘脂代謝的特定途徑，推測與蘋果適應(yīng)高溫環(huán)境以及最終產(chǎn)品的風(fēng)味形成密切相關(guān)。特別指出，高溫發(fā)酵有助于激活特定的代謝途徑，如玉米素的生物合成及鞘脂的代謝，這可能與發(fā)酵過程中的高溫應(yīng)激響應(yīng)有關(guān)，這對蘋果的高溫適應(yīng)性和風(fēng)味的形成具有重要影響。本研究不僅拓展了對蘋果在高溫發(fā)酵過程中的代謝變化的理解，還提供了通過代謝工程優(yōu)化蘋果發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)和功能的理論依據(jù)。未來的研究將可能深入探討脂質(zhì)代謝在蘋果發(fā)酵中的角色，以及如何通過調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵代謝途徑以提升蘋果發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和營養(yǎng)價值。

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