關(guān)鍵詞納米酶；晶格應(yīng)變；抗氧化劑；比色分析

天然抗氧化劑具有重要的生物學(xué)功能和藥理作用，能夠預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)疾病，如心血管疾病、癌癥和糖尿病等[1]，因此，發(fā)展針對(duì)這些抗氧化劑的定量檢測(cè)方法具有重要意義。常見(jiàn)的抗氧化劑的檢測(cè)方法包括氣相色譜法[2]、液相色譜法[3]、電化學(xué)分析法[4]和極譜法[5]等。盡管上述方法靈敏度較高，但需要昂貴的設(shè)備且操作步驟繁瑣，限制了其廣泛應(yīng)用。相比之下，比色法因具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)迅速、可重復(fù)性良好等特點(diǎn)備受關(guān)注[6-7]。

天然酶的催化活性高且特異性好，在比色分析中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[8]。但是，天然酶存在易失活、成本高及難儲(chǔ)存等缺點(diǎn)，限制了其在比色分析中的應(yīng)用[9]。納米酶是一類具有內(nèi)在類酶活性的納米材料，具有可調(diào)的催化活性、成本低及易儲(chǔ)存等優(yōu)勢(shì)，有望成為天然酶的有效替代物[10-11]。自2007年首次報(bào)道Fe3O4納米顆粒具有類過(guò)氧化物酶活性以來(lái)[12]，許多納米材料包括金屬氧化物[13]、金屬有機(jī)骨架[14]、碳基材料[15]和貴金屬[16]等被發(fā)現(xiàn)同樣具有類酶活性，其中，具有類過(guò)氧化物酶活性的貴金屬基納米酶被廣泛應(yīng)用于生物傳感、腫瘤治療和抗菌等領(lǐng)域[17-19]。貴金屬納米酶的催化活性與其顆粒尺寸密切相關(guān)。一般而言，減小粒徑有助于增強(qiáng)其催化效率，但小尺寸的貴金屬納米粒子由于表面能高，在催化反應(yīng)過(guò)程中容易聚集，使其催化活性不斷降低[20]。因此，尋找合適的載體用于穩(wěn)定和負(fù)載貴金屬納米酶對(duì)提高貴金屬納米顆粒的催化活性具有重要意義[21-22]。

本研究合成了一種均勻穩(wěn)定地負(fù)載在氮改性碳納米片上并且具有晶格應(yīng)變效應(yīng)的釕納米顆粒（RuNPs/NC）。其中，RuNPs的晶格應(yīng)變效應(yīng)以及NC基底中氮元素的引入有效提高了RuNPs/NC的穩(wěn)定性以及類過(guò)氧化物酶催化活性?；诳箟难幔ˋA）、沒(méi)食子酸（GA）和單寧酸（TA）對(duì)RuNPs/NC催化的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）-H2O2顯色反應(yīng)的抑制[23]，RuNPs/NC-H2O2-TMB體系被成功應(yīng)用于AA、GA和TA等的比色檢測(cè)。本研究不僅為調(diào)節(jié)貴金屬納米酶的催化活性提供了良好的思路，也為抗氧化劑的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便且有效的方法。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

SmartLab9KW型原位X-射線粉末衍射儀（XRD，日本理學(xué)公司）；JEM2100F透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會(huì)社）；K-AlphaX射線光電子能譜儀（XPS，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；UV-8000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；MagnettechESR5000電子順磁共振譜儀（EPR，德國(guó)布魯克公司）。

氯化釕（99.9%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；乙酸（99.8%）、AA（99%）、乙酸鈉（99%）和TMB（98%）（上海麥克林試劑有限公司）；TA（95%）、GA（99%）、乙醇（99.7%）、雙氰胺（99%）、均苯三甲酸（97%）、蔗糖（Sucrose）、果糖（Fru）、葡萄糖（Glu）和乳糖（Lac）（上海阿拉丁試劑有限公司）。

1.2RuNPs/NC-x復(fù)合材料的制備

采用濕化學(xué)-熱解法制備了RuNPs/NC[24]。將10mg氯化釕溶解在10mL乙醇中，攪拌直至完全溶解，得到溶液A。將10mg均苯三甲酸和1g雙氰胺溶解在30mL乙醇中，攪拌1h至完全溶解，得到溶液B。將上述A、B溶液充分混合后，置于80℃油浴中繼續(xù)攪拌至蒸干乙醇溶劑。隨后，將干燥的混合物在不同溫度（800、900和1000℃）的氮?dú)夥諊袩峤?h，得到一系列具有不同氮含量的RuNPs/NC-x（x代表熱解溫度）樣品。另外，以雙氰胺和均苯三甲酸為原料制備了NC-x。

1.3RuNPs/NC-x的類過(guò)氧化物酶活性測(cè)試

以TMB-H2O2顯色反應(yīng)考察RuNPs/NC的類過(guò)氧化物酶活性。在2mL離心管中依次加入10μLRuNPs/NC（0.1mg/mL）、50μLH2O2（0.1mol/L）、50μLTMB（5mmol/L）和890μLHAc-NaAc緩沖溶液（0.2mol/L，pH=4.0），混合均勻后，于室溫下反應(yīng)20min，然后記錄反應(yīng)體系在500～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。將RuNPs/NC在室溫下放置3個(gè)月后重復(fù)上述步驟，記錄其在500～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，考察其穩(wěn)定性。

在含有HAc-NaAc緩沖溶液（0.2mol/L，pH4.0）體系中，分別改變TMB和H2O2的濃度，記錄體系在652nm處的吸光度隨時(shí)間變化的曲線。利用Michaelis-Menten方程擬合計(jì)算反應(yīng)體系的動(dòng)力學(xué)參數(shù)[25]：

其中，v為反應(yīng)初速率，S為底物濃度，Km為Michaelis常數(shù)，vmax為最大反應(yīng)速率。

1.4比色法檢測(cè)抗氧化劑

配制不同濃度的抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)樣品（AA：1～10μmol/L；GA：2～16μmol/L；TA：0.25～3.5μmol/L）。將10μLRuNPs/NC（0.1mg/mL）、50μLTMB（5mmol/L）、50μLH2O2（0.1mol/L）和840μLHAc-NaAc緩沖溶液（0.2mol/L，pH=4.0）混合后，在室溫下反應(yīng)20min，然后分別加入不同濃度的3種抗氧化劑（50μL），孵育40s后，測(cè)定溶液的吸光度。通過(guò)抗氧化劑濃度與吸光度之間的線性關(guān)系進(jìn)行抗氧化劑的定量分析。

1.5實(shí)際樣品中抗氧化劑的檢測(cè)

檸檬和西紅柿富含AA，茶葉富含TA，五倍子和芒果果皮富含GA。因此，以上述物質(zhì)為代表，對(duì)實(shí)際樣品中的抗氧化劑進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估。檸檬、西紅柿、茶葉（紅茶和綠茶）和芒果均購(gòu)買于本地超市，五倍子購(gòu)買于本地中藥店。檸檬、西紅柿和芒果榨汁后，離心取上清液，稀釋5倍后備用；將1g茶葉和五倍子分別加入50mL沸水中，5min后取上清液，備用。除用實(shí)際樣品代替標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑溶液外，檢測(cè)步驟與1.4節(jié)的方法相同。

2結(jié)果與討論

2.1RuNPs/NC的結(jié)構(gòu)表征

將氯化釕、均苯三甲酸和雙氰胺混合乙醇溶液在80℃加熱，直至乙醇完全蒸發(fā)，得到的固體樣品在不同溫度下高溫處理1h，制得不同含量氮摻雜的RuNPs/NC-x樣品（圖1）。利用TEM對(duì)RuNPs/NC-x的形貌進(jìn)行了表征。如圖2A～2C所示，RuNPs均勻地分散在NC上，表明3種熱解溫度下獲得的RuNPs的形貌無(wú)明顯區(qū)別。

通過(guò)XRD對(duì)RuNPs/NC-x的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。如電子版文后支持信息圖S1A所示，釕為六方密排堆積相（JCPDSNo.06-0663）[27]。與標(biāo)準(zhǔn)卡片相比，3種熱解溫度下獲得的RuNPs的衍射峰均向高角度方向移動(dòng)（圖2D），表明RuNPs與載體之間的強(qiáng)相互作用導(dǎo)致RuNPs的晶格壓縮[28]。其中，RuNPs/NC-900的偏移程度高于RuNPs/NC-800和RuNPs/NC-1000，表明在900℃下，RuNPs的晶格應(yīng)變程度更大[29]。

利用X-射線光電子能譜（XPS）研究了RuNPs/NC-x的化學(xué)組成和金屬價(jià)態(tài)。如圖3A所示，RuNPs/NC-x樣品中存在C、N、O和Ru元素。以RuNPs/NC-900為例，對(duì)其各元素存在形式進(jìn)行了分析。如圖3B所示，C1s的XPS擬合曲線顯示C—C（284.4eV）、C—N（285.4eV）和C—O（288.7eV）的特征峰。如圖3C所示，Ru3p的XPS擬合曲線顯示位于464.4、486.9、461.4和483.6eV處的4個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)Ru4+3p3/2、Ru4+3p1/2、Ru03p3/2和Ru03p1/2，表明釕的價(jià)態(tài)為0和4。N1s的XPS譜顯示了4種類型的氮物種，包括吡啶氮（398.1eV）、吡咯氮（399.5eV）、石墨氮（400.8eV）和氧化氮（402.3eV）（圖3D和3F）。由電子版文后支持信息圖S2A和S2B可知，RuNPs/NC-x的Ru3p和N1s的XPS衍射峰發(fā)生了相對(duì)位移，說(shuō)明在RuNPs和NC之間發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移。通過(guò)XPS結(jié)果計(jì)算氮含量，發(fā)現(xiàn)RuNPs/NC-900中氮含量最高（電子版文后支持信息圖S1B）。相對(duì)于RuNPs/NC-800和RuNPs/NC-1000，RuNPs/NC-900具有最高比例的吡啶氮（電子版文后支持信息圖S1C）。由于吡啶位點(diǎn)上的孤對(duì)電子可以與金屬原子形成強(qiáng)的化學(xué)鍵，從而限制了金屬原子的擴(kuò)散和聚集，使得納米顆?？梢愿臃€(wěn)定的負(fù)載在NC基底上[30]，有效提高了材料的類酶活性[31]。

2.2類過(guò)氧化物模擬酶活性評(píng)估及催化機(jī)理

如圖4A所示，只有當(dāng)H2O2、TMB和RuNPs/NC-900共存時(shí)（曲線a），在652nm處出現(xiàn)氧化態(tài)TMB（oxTMB）的特征吸收峰，表明RuNPs/NC-900具有類過(guò)氧化物酶活性。如圖4B所示，在含有TMB及H2O2的溶液中加入相同質(zhì)量的RuNPs/NC-800（曲線b）、RuNPs/NC-1000（曲線c）和NC（曲線d），發(fā)現(xiàn)RuNPs/NC-900的吸光度最大，表明RuNPs/NC-900具有最高的類過(guò)氧化物酶活性。上述結(jié)果表明，RuNPs/NC中氮含量越高，吡啶氮越多，其類過(guò)氧化物酶活性越好[32]。另外，由于NC的吸收峰與其它吸收峰相比可以忽略不計(jì)，表明RuNPs/NC-x的類酶活性主要源于RuNPs。

納米酶的催化活性與催化反應(yīng)孵育溫度和反應(yīng)體系的pH值有關(guān)。對(duì)溫度（25～55℃）和pH值（3.2～6.0）的影響進(jìn)行了考察。由電子版文后支持信息圖S3A和S3B可知，最佳反應(yīng)溫度為45℃，最佳pH為4.0。在25～55℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)納米酶的催化活性影響不大，因此選擇室溫進(jìn)行后續(xù)測(cè)試?？疾炝薘uNPs/NC的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。結(jié)果表明，RuNPs/NC在保存3個(gè)月之后其活性仍保持在初始活性的95%以上，證明其具有良好的穩(wěn)定性（圖4C）。以H2O2和TMB為底物，進(jìn)行了穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。如電子版文后支持信息圖S4和S5所示，在合適的底物濃度范圍內(nèi)，RuNPs/NC-x的催化反應(yīng)遵循典型的Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)模型[33]，計(jì)算得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)（電子版文后支持信息表S1），相對(duì)于天然酶及已報(bào)道的其它納米酶，RuNPs/NC-x在與底物的親和力和反應(yīng)速率方面均具有優(yōu)勢(shì)。另外，RuNPs/NC-900的動(dòng)力學(xué)常數(shù)優(yōu)于RuNPs/NC-800和RuNPs/NC-1000，也說(shuō)明RuNPs/NC-900具有最高的類酶活性[34]。

過(guò)氧化物酶活性與活性氧（ROS）的產(chǎn)生密切相關(guān)[35-37]。因此，為闡明RuNPs/NC的催化機(jī)理，對(duì)RuNPs/NC催化過(guò)程中的活性氧類型進(jìn)行了測(cè)試。首先，利用異丙醇、色氨酸和超氧化物歧化酶分別作為·OH、1O2和O2·的捕獲劑[38-40]，將上述捕獲劑分別加入到RuNPs/NC-H2O2-TMB體系中，測(cè)定其在652nm處的吸光度。結(jié)果表明，只有在加入色氨酸后，體系在652nm處的吸光度明顯降低，表明體系中產(chǎn)生了1O2（圖4D）。電子順磁共振（EPR）x∶y∶z三重峰的出現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了1O2的存在（圖4E）。

2.3抗氧化劑的檢測(cè)

考察了RuNPs/NC-H2O2-TMB體系用于AA、TA和GA檢測(cè)的可行性。當(dāng)向體系中分別加入3種抗氧化劑（圖4F曲線b、c和d）時(shí)，體系在652nm處的吸光度（A652nm）相對(duì)于未加入抗氧化劑（曲線a）時(shí)明顯降低，且A652nm隨抗氧化劑濃度升高而逐漸降低（圖5），證明RuNPs/NC-H2O2-TMB體系可用于AA、TA和GA的檢測(cè)。A652nm與AA、GA和TA的濃度分別在在1～10μmol/L、2～16μmol/L和0.25～3.50μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。根據(jù)3σ/S（σ表示空白樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S表示曲線的斜率）計(jì)算得到AA、GA、TA的檢出限分別為0.29、0.014和0.014μmol/L。與已報(bào)道的檢測(cè)AA/GA/TA的方法相比（電子版文后支持信息表S2），本體系對(duì)抗氧化劑AA、GA和TA的靈敏度更高。選擇食品和中藥中常見(jiàn)的氨基酸、離子、糖類以及其它抗氧化劑（兒茶酚、維生素E、維生素A）作為干擾物質(zhì)考察體系的選擇性。如電子版文后支持信息圖S6所示，加入干擾物質(zhì)后，體系的A652nm未發(fā)生明顯的變化，表明本體系對(duì)AA、TA和GA具有良好的選擇性。

2.4抗氧化劑對(duì)RuNPs/NC類過(guò)氧化物酶活性的抑制機(jī)理

AA、GA和TA作為抗氧化劑，可抑制RuNPs/NC催化TMB的氧化反應(yīng)，如圖6A所示。AA作為抗氧化劑和自由基清除劑，可有效抑制酶引發(fā)的顯色反應(yīng)[41]。通過(guò)猝滅動(dòng)力學(xué)[42]研究了AA對(duì)RuNPs/NC催化的TMB-H2O2反應(yīng)的抑制作用。如圖6B所示，將AA加入到預(yù)先反應(yīng)的RuNPs/NC-H2O2-TMB體系中，652nm處的吸光度迅速下降（曲線a），證實(shí)AA可還原氧化的TMB（oxTMB）。如在反應(yīng)的初始階段引入AA時(shí)（曲線b），RuNPs/NC催化的TMB的氧化反應(yīng)被抑制；隨著AA被消耗，氧化反應(yīng)逐漸恢復(fù)，證明AA可以清除來(lái)自RuNPs/NC-H2O2-TMB體系的1O2。上述結(jié)果表明，AA通過(guò)還原oxTMB及消耗1O2抑制RuNPs/NC催化TMB的氧化反應(yīng)。TA和GA作為抗氧化劑，能夠抑制RuNPs/NC催化TMB的氧化反應(yīng)。通過(guò)抑制動(dòng)力學(xué)研究了TA和GA對(duì)RuNPs/NC催化TMB-H2O2反應(yīng)的抑制作用[43]。抑制動(dòng)力學(xué)遵循Michaelis-Menten方程。TA和GA的Lineweaver-Burk曲線圖如6C和6D所示，各曲線線性關(guān)系良好，并且相交于第二象限。由公式（1）和（2）計(jì)算得到的Km和vmax見(jiàn)表1，可見(jiàn)隨著TA和GA濃度的增大，Km增大，vmax減小，表明TA和GA抑制RuNPs/NC催化TMB氧化的機(jī)理為混合型抑制[44]。

2.5實(shí)際樣品的比色分析

考察了RuNPs/NC-H2O2-TMB體系在檢測(cè)實(shí)際樣品中抗氧化劑的應(yīng)用潛能，測(cè)定結(jié)果如圖7A所示。同時(shí)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)添加回收實(shí)驗(yàn)，回收率為96.0%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%（電子版文后支持信息表S3），表明本方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有較高的準(zhǔn)確性和較好的重現(xiàn)性。為了評(píng)價(jià)本體系對(duì)真實(shí)樣品的識(shí)別和區(qū)分能力，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行了主坐標(biāo)分析（PCoA）[45]。將制備的檸檬、番茄、芒果果皮、五倍子、紅茶和綠茶待測(cè)液分別加入到RuNPs/NC-H2O2-TMB體系中，測(cè)量A652nm，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次。通過(guò)PCoA分析對(duì)數(shù)據(jù)降維處理，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為兩個(gè)規(guī)范因子，如圖7B所示。可以看出，這6種樣品分別形成了6個(gè)不重疊的區(qū)域，說(shuō)明通過(guò)PCoA可將不同的樣品很好地區(qū)分開(kāi)。

3結(jié)論

采用簡(jiǎn)單的濕化學(xué)-熱解法制備了均勻分散在NC基底上的RuNPs。通過(guò)不同的熱解溫度處理對(duì)RuNPs/NC中的氮含量以及吡啶氮、吡咯氮、石墨氮和氧化氮的相對(duì)含量進(jìn)行了有效調(diào)控。結(jié)果表明，吡啶氮的相對(duì)含量越多，RuNPs/NC可表現(xiàn)出更優(yōu)異的類過(guò)氧化物酶活性。晶格應(yīng)變的壓縮增強(qiáng)了催化活性位點(diǎn)與底物之間的結(jié)合強(qiáng)度，從而提高了RuNPs/NC的類過(guò)氧化物酶活性。RuNPs/NC-H2O2-TMB體系被成功應(yīng)用于AA、GA和TA的檢測(cè)。本研究不僅提供了一種合成穩(wěn)定釕基納米酶的簡(jiǎn)便方法，并且拓展了納米酶在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。