摘要：【目的】克隆克氏原螯蝦（Procambarus clarki）Dmrtl基因（PcDmrt1），分析其在雌性和雄性克氏原螯蝦 不同組織中及不同發(fā)育時期性腺中的表達特征，為研究克氏原螯蝦性別分化與發(fā)育提供理論依據(jù)?！痉椒ā靠寺?PcDmrt1基因開放閱讀框（ORF），并對其進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR檢測PcDmrtl基因在雌性和雄性克氏原螯蝦不同組織及不同發(fā)育時期性腺中的表達特征?！窘Y果】PcDmrt1基因ORF長1752bp，共編碼583個氨基酸殘基。PcDmrt1蛋白分子量64.9kD，理論等電點（pI）為9.51，包含2個DM結構域。同源比對分析表明，克氏原螯蝦 PcDmrt1氨基酸序列與紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）Dmrt氨基酸序列同源性最高，為61.2%。基于Dmrt氨基酸 序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明，克氏原螯蝦與東澳巖龍蝦（Sagmariasus verreauxi）、紅螯螯蝦和美洲螯龍蝦 （Homarus americanus）親緣關系較近。PcDmrtl基因在克氏原螯蝦性腺、肝胰腺、鰓、腦、眼柄、肌肉和腸道7個組織中 均有表達，性腺中相對表達量最高，肝胰腺和眼柄次之，在其他組織中相對表達量較低，在性腺、肝胰腺和眼柄3個組 織中，雌性和雄性克氏原螯蝦Pcdmrt1基因相對表達量存在顯著（Plt;0.05）或極顯著（Plt;0.01，下同）差異。在克氏原螯蝦不同發(fā)育時期，PcDmrtl基因相對表達量在出膜后5d出現(xiàn)高峰，最高表達出現(xiàn)在出膜后40d，此時雄性幼蝦 PcDmrtl基因相對表達量極顯著高于雌性幼蝦?！窘Y論】克氏原螯蝦PcDmrt1蛋白含有2個DM結構域，屬于典型的Dmrt家族成員，在進化上保守。PcDmrtl基因廣泛表達于克氏原螯蝦各組織中并在性腺中高表達，基因相對表達量在發(fā)育早期呈上升趨勢，表明PcDmrtl基因可能在早期參與克氏原螯蝦性別分化與組織發(fā)育。

關鍵詞：克氏原螯蝦；Dmrtl基因；組織分布；性別調控

中圖分類號：S917.4

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1191（2024）04-1207-09

Gene cloning and expression characteristics of Dmrtl gene in Procambarus clarkiiLU Zhuan-ling1， JI Yue-xin2， DAI Long-xi2， WANG Da-peng1， GUO Zhong-bao1， XIAO Jun1， LIANG Zheng1， HUANG Bin-sheng1， YANG Dong-ling1， WEI You-chuan2*

（1Guangxi Academy of Fishery Sciences/China （Guangxi）-ASEAN Key Laboratory of Comprehensive Exploitation and Utilization of Aquatic Germplasm Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning， Guangxi 530021， China; 2College of AnimalScience and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China）

Abstract：【Objective】 The Dmrtl gene of Procambarus clarkii （PcDmrtl） was cloned， and its expression patterns were analyzed in different tissues of female and male P. clarkii， as well as in gonads during different developmental pe- riods. This study provided a theoretical basis for the investigation of sex differentiation and development in P. clarkii.【Method】The open reading frame （ORF） of PcDmrtl gene was cloned， and bioinformatics analysis was performed on it.The expression characteristics of the PcDmrtl gene in various tissues and gonads of female and male P. clarkii during dif-ferent developmental periods were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. [Result]The ORF of PcDmrtl gene was 1752 bp in length， encoding 583 amino acid residues. The PcDmrt1 protein had a molecular weight of 64.9 kD， a theoretical isoelectric point（pI） of 9.51 and contained two DM domains. Homology alignment analysis revealed that the amino acid sequence of PcDmrt1 had the highest homology with the Dmrt amino acid sequence of Cherax quadricarinatus（61.2%）. The phylogenetic evolutionary tree constructed based on the similarity of Dmrtl amino acid sequence showed that P. clarkii was closely related to Sagmariasus verreauxi， Cherax quadricarinatus and Homarus americanus. The PcDmrtl gene was expressed in seven tested tissues of gonad， hepatopancreas， gills， brain， eyestalks， muscles and intestine of P. clarki. The relative expression level in gonad was the highest， followed by hepatopancreas and eyestalk， and the relative expression level in other tissues was low. Significant （Plt;0.05） or extremely significant （Plt;0.01， the same below） differences were observed in the relative expression of the PcDmrtl gene in gonad， hepatopancrea and eyestalk between female and male P. clarkii. At various developmental periods of P. clarkii， the relative expression of PcDmrtl gene reached its peak at 5 d after hatching， with the highest expression observed in juvenile shrimp at 40 d after hatching. At this time， the relative expression of PcDmrtl gene in male P. clarki was found to be significantly higher than that in female P. clarkii. 【Conclusion] The PcDmrtl protein of P. clarkii contains two DM structural domains， which is typical Dmrt family member and is evolutionarily conserved. The PcDmrtl gene is widely expressed in various tissues of P.clarkii， with the highest expression observed in gonads. The relative expression level of the gene appears to increase during the early stages of development， suggesting a potential role for the PcDmrtl gene in sex differentiation and tissue development in P. clarki during this period.

Key words： Procambarus clarkii; Dmrtl gene; tissue expression; gender regulation

Foundation items： Guangxi Science and Technology Key Project （Guike AA20302019-2） ; Open Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture （2023-A-01-01） ; Guangxi Agricultural Science and Technology Self-financing Project（Z2022212，Z202294）

0 引言

【研究意義】雙性和mab-3相關轉錄因子（Double- sex and Mab-3 relatated transcription factor，Dmrt）家 族基因是果蠅（Drosophila melanogaste）性別決定基 因Double-sex（Burtis and Baker，1989）和秀麗隱桿線 蟲（Caenorhabditis elegans）雄性調節(jié)基因Mab-3 （Raymond et al.，1998）的同源基因。該家族成員是一類轉錄調控因子，至少含有1個DM結構域，負責與DNA結合。Dmrtl是Dmrt家族基因之一，與性別 決定和組織分化有關，在性腺分化和發(fā)育過程中起 重要作用（Hong et al.，2007）?？耸显r（Procam- barus clarkii）為我國重要的經(jīng)濟淡水養(yǎng)殖蝦類， 2022年總產量為289.07萬t，總產值約4580億元（于 秀娟等，2023）。養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，性成熟的克氏原 螯蝦雄性個體明顯大于雌性，表明雄性個體生長性 能優(yōu)于雌性。因此，克隆分析與性腺分化和發(fā)育相 關的Dmrtl基因，對研究克氏原螯蝦性腺分化、發(fā)育 及雄性分子育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】 Dmrtl基因相關研究在多個物種中均有報道，小鼠（Mus musculus）Dmrtl基因影響體細胞和生殖細胞 分化（Zarkower et al.，2022），敲低雄性小鼠Dmrt1基因會抑制精子產生（Zhang et al.，2023a）。在雄雞（Gallus gallus）發(fā)育的早期階段，干擾Dmrtl基因可誘導性腺雌性化，并伴隨生理和分子變化（Lee et al.，2021）；雞胚胎的蛋白質組學研究結果表明， Dmrt1蛋白與雌性胚胎右側性腺退化有關（Qin etal.，2022）。在泰國斗魚（Betta splendens）（黃洋等， 2021）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）（Dai et al.，2021）、鱖（Siniperca chuatsi）（Han et al.，2021）和斑 鱧（Channa maculata）（Ou et al.，2022）等魚類研究 中，Dmrtl基因被證明在雄性個體精巢分化與發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在甲殼動物中，Dmrtl基因可正 向調控胰島素樣促雄性腺激素（Insulin-like andro- genic gland hormone，IAG）基因的表達，而LAG基因 是蝦蟹類性別分化過程的決定性基因（Farhadi et al.，2021;Yan et al.，2021）;中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）Dmrt家族基因在幼齡1階段開始豐富，EsiDMY和EsiDmrtla基因在雄激素腺中高度表達，并隨著RNA干擾導致LAG基因轉錄顯著減少，表明其在雄激素腺發(fā)育中發(fā)揮作用（Zhang et al.，2023b）； 對羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）的研究結 果表明，MroDmrtllE基因在精巢中顯著表達，通過 dsRNA敲低雄性蝦后期幼體的MroDmrtl1E基因可 實現(xiàn)完全且具有功能性的性逆轉（Xu et al.，2022）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關于克氏原螯蝦Dmrtl基因的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】克隆PcD-mrtl基因開放閱讀框（ORF），并對其進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR檢測PcDmrtl基因 在雌性和雄性克氏原螯蝦不同組織及不同發(fā)育時期 性腺中的表達特征，為研究克氏原螯蝦性別分化與 發(fā)育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

Premix Taq和pMD18-T Vector Cloning Kit均購 自日本TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、 2×SYBR Green qPCR Mix 和 TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit均購自北京艾德萊生物科技有 限公司。克氏原螯蝦由廣西水產科學研究院水產養(yǎng)殖 基地提供，養(yǎng)殖水溫（25±2）℃，每天7：00和19：00分 別投喂1次配合飼料。動物試驗由廣西水產科學研究 院動物實驗倫理委員會批準，批準號GAFS2023010。

1.2總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法提取克氏原螯蝦精巢組織總 RNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總RNA質 量，并使用Multiskan SkyHigh全波長酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]檢測總RNA濃度。根據(jù)cDNA反轉錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈。

1.3克氏原螯蝦PcDmrt1基因ORF克隆

根據(jù)NCBI已公布的預測克氏原螯蝦Dmrtl基 因序列（XM_045769959.1），運用Oligo6.7設計巢式PCR引物（表1）。第1輪PCR擴增反應體系50.0μL：cDNA模板2.5 uL，PcDmrt1-F1和PcDmrt1-R1各 2.5uL，Premix Tag 25.0 uL，ddH2O補足至50.0 uL。擴增程序：94℃預變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，進行5個循環(huán)；94℃30s，58℃30s，72℃2min，進行5個循環(huán)；94℃30s，56℃30s，72℃2min，進行25個循環(huán)；72℃延伸10min。以 第1輪PCR擴增產物稀釋20倍為模板進行第2輪PCR擴增，以PcDmrt1-F2和PcDmrt1-R2為引物，其他步驟與第1輪PCR擴增相同。第2輪PCR擴增產 物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，采用瓊脂糖凝 膠純化回收試劑盒進行膠回收，純化后的產物連接 至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR驗證后，將陽性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4生物信息學分析

利用DNAstar的SeqMan對測序結果進行分析，運用ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orf-finder/）預測ORF;采用SMART（https：//smart.embl.de/）預測PcDmrt1蛋白結構域；應用Protparam（https：// web.expasy.org/protparam/）預測蛋白理化性質；利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預測蛋白親疏水性；使用TMHMM 2.0（https：//services.health- tech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測蛋白跨膜結 構，采用SignalP 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/）預測信號肽；運用Softberry （http：//linux1.softberry.com）預測PcDmrt1功能位點；分別應用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）和I-TASSER（https：//zhanggroup.org/I-TASSER/）預測蛋 白二、三級結構；分別使用DNAstar的MegAlign和 ClustalX進行氨基酸序列同源性分析和多序列比對；并采用MEGA 5.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap設為1000次。

1.5實時熒光定量PCR檢測

隨機選取90日齡的健康雌性和雄性克氏原螯 蝦各15尾并分為3組，每組各采集5尾蝦的性腺、肝 胰腺、鰓、腦、眼柄、肌肉和腸道7個組織，采集克氏 原螯蝦無節(jié)幼體與溞狀幼體和出膜后5、10、20、30、 40、60、90及120d的性腺附近組織（雌雄各3尾），提 取總RNA并采用反轉錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，β-actin為內參基因，PcDmrtl-qF和PcDmrt1-qR為特異性引物（表1），檢測PcDmrt1基 因在不同性別克氏原螯蝦各組織及不同發(fā)育時期 性腺中的表達情況。實時熒光定量PCR反應體系25.0 uL： 2×SYBR Green qPCR Mix 12.5 uL， cDNA 模板1.0μL，上、下游引物各0.5μL，ddH2O補足至25.0μL。擴增程序：95℃預變性2min；95°℃15s，60℃20s，72℃30s，進行40個循環(huán)。每個樣品設 3個平行，采用2AAa法計算PcDmrtl基因相對表達量，使用SPSS19.0進行單因素方差分析。

2結果與分析

2.1PcDmrtl基因克隆及序列分析結果

從精巢組織中克隆的PcDmrtl基因ORF長 1752bp，共編碼583個氨基酸殘基（圖1）。SMART預測結果表明，PcDmrt1蛋白含有2個DM結構域 （圖2）。Protparam預測結果表明，PcDmrt1蛋白分子式為C2818H481N849O844S36，蛋白分子量為64.9kD，理論等電點（pI）為9.51，不穩(wěn)定系數(shù)為55.59，屬于不穩(wěn) 定蛋白。ProtScale預測結果表明，PcDmrt1蛋白平 均親水性系數(shù)為-0.673，屬于親水性蛋白（圖3）。TMHMM2.0預測結果表明，PcDmrt1蛋白無跨膜結構（圖4）。SignalP4.1預測結果表明，PcDmrt1蛋白無信號肽（圖5）。Softberry預測蛋白功能位點結果表明，PcDmrt1蛋白含有1個N-糖基化位點（位于第 364位氨基酸），2個糖胺聚糖附著位點（分別位于第 127和140位氨基酸），2個cAMP和cGMP依賴性蛋 白激酶磷酸化位點（分別位于第14和211位氨基 酸），11個蛋白激酶C磷酸化位點（分別位于第60、76、87、116、170、208、214、264、368、381和452位氨基酸），8個酪蛋白激酶ⅡI磷酸化位點（分別位于第51、241、301、351、425、431、440和460位氨基酸），2個酪氨酸激酶磷酸化位點（分別位于第14和15位 氨基酸），12個N-肉豆蔻酰化位點（分別位于第128、138、141、142、145、148、154、158、162、166、445和479位氨基酸），3個異戊烯基結合位點（分別位于第 90、202和205位氨基酸），9個微體C端靶向信號（分別位于第9、27、31、96、99、307、425、455和572位氨基酸）。使用SOPMA和I-TASSER預測PcDmrt1蛋白二、三級結構，結果如圖6所示，PcDmrt1蛋白二級 結構中無規(guī)則卷曲占56.95%，a-螺旋占30.19%，延 伸鏈占8.06%，β-轉角僅占4.80%。

2.2PcDmrt1氨基酸序列同源比對分析和系統(tǒng)發(fā)育 進化樹構建

將克氏原螯蝦PcDmrt1氨基酸序列與其他物種 的Dmrt氨基酸序列進行比對，結果如表2所示。PcDmrt1氨基酸序列與紅螯螯蝦（Cherax quadricari- natus）Dmrt氨基酸序列同源性最高，為61.2%，與哺 乳類、鳥類、魚類和爬行類的同源性較低，在21.0%以下。多序列比對分析結果如圖7所示，各物種 Dmrt氨基酸序列的DM結構域均有6個保守的半胱 氨酸殘基（C），可形成2個鋅結合位點（CCHC和HCCC）?；诓煌锓NDmrt氨基酸序列相似性構 建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖8所示，鳥類、爬行類、哺乳類、魚類和甲殼類各自聚為一支；在甲殼類這一分 支中，克氏原螯蝦與東澳巖龍蝦（Sagmariasus ver- reauxi）（SviDmrtl）、紅螯螯蝦（CqDmrt）和美洲螯龍 蝦（Homarus americanus）（HaiDmrt1-like）聚為一類，親緣關系較近。

2.3PcDmrt1基因在成年克氏原螯蝦不同組織中的 表達情況

采用實時熒光定量PCR檢測PcDmrtl基因在不 同性別克氏原螯蝦7種組織中的表達情況。結果如 圖9所示，在雌性克氏原螯蝦中，Pcdmrtl基因在性 腺和肝胰腺中的相對表達量較高，眼柄次之，在鰓、 腦、肌肉和腸道中的相對表達量較低。雄性克氏原 螯蝦中，Pcdmrtl基因在性腺中的相對表達量最高， 其次是肝胰腺和眼柄，在鰓、腦、肌肉和腸道中的相 對表達量較低。在性腺、肝胰腺和眼柄3個組織中， 雌性和雄性克氏原螯蝦Pcdmrtl基因相對表達量存 在顯著（Plt;0.05）或極顯著（Plt;0.01，下同）差異，在其他組織中無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.4PcDmrt基因在不同發(fā)育時期克氏原螯蝦性腺中的表達情況

利用實時熒光定量PCR檢測PcDmrtl基因在不同發(fā)育時期克氏原螯蝦性腺中的表達情況。結果如圖10所示，PcDmrt1基因相對表達量從無節(jié)幼體 期開始逐漸升高，在出膜后5d出現(xiàn)高峰，隨后開始 下降，30d再次升高并在40d達最高，此時雄性幼 蝦PcDmrtl基因相對表達量極顯著高于雌性幼蝦。

3討論Dmrt家族最早發(fā)現(xiàn)于果蠅當中，該家族成員的 主要特征是至少含有1個能與DNA結合的保守結 構域（DM結構域），DM結構域中含有6個保守的半胱氨酸殘基（C）和2個保守的組氨酸殘基（H），可 形成2個鋅結合位點（CCHC和HCCC）（Zhu et al.，2000）。在甲殼動物中，Dmrt基因以鋅指結構與目 的序列結合，通過調節(jié)目的基因的轉錄參與性別 決定過程（Raymond et al.，1998）。此外，Dmrt基因還與胚胎發(fā)育（Bellefroid et al.，2013）、配子形成 （Zarkower，2013）和神經(jīng)發(fā)育（Kikkawa and Osumi， 2021）有關。

本研究成功克隆了克氏原螯蝦PcDmrt1基因 ORF，分析結果表明PcDmrt1蛋白含有2個DM結構域，屬于典型的Dmrt家族成員。多序列比對結果表明，克氏原螯蝦與其他物種Dmrt氨基酸序列的DM 結構域高度保守且含有2個鋅結合位點，但結構域 以外的部分同源性卻很低，與趙子貴等（2012）的研究結果一致，可能是由于不同物種在進化過程中選 擇了不同的繁衍方式和生存環(huán)境所導致。系統(tǒng)發(fā)育 進化樹分析表明，克氏原螯蝦與東澳巖龍蝦、紅螯螯 蝦和美洲螯龍蝦親緣關系較近，進一步驗證Dmrt基因在進化過程中具有高度保守性。PcDmrtl基因在 成熟克氏原螯蝦的性腺、肝胰腺、鰓、腦、眼柄、肌肉 和腸道7個組織中均有表達，且在性腺中的相對表 達量最高，與日本對蝦（Wang et al.，2019）和擬穴青蟹（Zhang et al.，2021）的相關研究結果一致。在暗 紋東方鲀（Takifugu obscures）（高瑩瑩等，2020）、大 黃魚（Larimichthys crocea）（Wan et al.，2020）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）（Feng et al.，2021）和 斑鱾（Girella punctata）（溫思民等，2022）等魚類的研究中，Dmrt基因被證明參與魚類的性別分化并在精 巢（或睪丸）中特異性表達。與其他物種不同的是，在烏米爾鹵蟲（Artemia urmiana）和孤雌鹵蟲（Arte- mia parthenogenetica）的研究中，Dmrt基因僅在雌性 性腺中表達，可能與其孤雌生殖的特性有關（Faraz-mand et al.，2010）。

本研究進一步檢測不同發(fā)育時期克氏原螯蝦性 腺中的PcDmrtl基因表達情況，探究其在生長發(fā)育及性別分化過程中的作用。結果顯示，PcDmrtl基 因相對表達量分別在出膜后5和40d出現(xiàn)高峰，出 膜后40d雄性克氏原螯蝦的PcDmrt1基因相對表達 量極顯著高于雌性。在羅氏沼蝦（Yu et al.，2014）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）（Li et al.， 2018）和中華絨螯蟹（Zhang et al.，2023b）的研究中， 通過沉默Dmrt家族成員可顯著降低IAG基因的表達量。通過dsRNA敲低雄性羅氏沼蝦后期幼體的MroDmrtllE基因可實現(xiàn)羅氏沼蝦的性逆轉（Xu etal.，2022）。PcDmrtl基因相對表達量的2個高峰可 能與克氏原螯蝦第二性征形成有關。

4結論

克氏原螯蝦PcDmrt1蛋白含有2個DM結構域，屬于典型的Dmrt家族成員，在進化上保守。PcDmrtl 基因廣泛表達于克氏原螯蝦各組織中并在性腺中高 表達，基因相對表達量在發(fā)育早期呈上升趨勢，表明 PcDmrtl基因可能在早期參與克氏原螯蝦性別分化 與組織發(fā)育。

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