細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，細(xì)胞內(nèi)部每時每刻都在進(jìn)行著成百上千種生物化學(xué)反應(yīng)以保證生命的持續(xù)維持。為實(shí)現(xiàn)這些反應(yīng)有序進(jìn)行并受到精準(zhǔn)嚴(yán)格的調(diào)控，細(xì)胞演化出細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，如生物氧化反應(yīng)主要在線粒體完成。另一種策略就是反應(yīng)組分之間進(jìn)行有序的可逆性聚集和分散，基于“合則共贏，散則俱敗”原則調(diào)控反應(yīng)的啟動和終止，如大家較熟悉的由大小亞基構(gòu)成的核糖體。核糖體是蛋白質(zhì)合成場所，無蛋白質(zhì)合成時大小亞基處于分散狀態(tài)，合成時大小亞基及輔助因子迅速聚集，合成結(jié)束后再次分開。細(xì)胞內(nèi)有多種完成這種功能過程的結(jié)構(gòu)，稱之為生物分子凝聚體（biomolecular condensate）或無膜細(xì)胞器。最近10余年的一系列研究揭示了驅(qū)動無膜細(xì)胞器形成的相分離（phase separation）機(jī)制，在進(jìn)一步理解諸多生命現(xiàn)象機(jī)制同時，也為疾病治療提供了新思路[1]。

相分離

相（phase）是物質(zhì)展現(xiàn)出的一種狀態(tài)，如水存在固相、液相和氣相，相變則是不同相之間的變化，加熱可使水從液相變?yōu)闅庀嗟恼羝?，而降溫則使水變?yōu)楣滔嗟谋虼讼嘧儸F(xiàn)象在自然界普遍存在。

兩種或兩種以上處于同相或不同相的物質(zhì)可通過物理過程（不涉及化學(xué)反應(yīng)）結(jié)合在一起形成混合物，如固相葡萄糖和液相水混合出糖水。混合物根據(jù)溶質(zhì)大小和分散程度分為均質(zhì)、非均質(zhì)和中間態(tài)：均質(zhì)混合物中溶質(zhì)小于1納米，性質(zhì)穩(wěn)定，如臨床上常用的0.9%氯化鈉和10%葡萄糖溶液；非均質(zhì)混合物溶質(zhì)大于100納米，穩(wěn)定性較差，如懸濁液和乳濁液，懸濁液溶質(zhì)是固體小顆粒（如泥水）、乳濁液是小液滴（如油水混合物）；中間態(tài)為膠體，溶質(zhì)大小在1納米到100納米之間（如蛋白質(zhì)溶液），穩(wěn)定性居于前二者之間。

相分離是指相對穩(wěn)定混合物產(chǎn)生不同相，進(jìn)而分離的過程。均質(zhì)化合物不發(fā)生相分離，不均質(zhì)化合物易發(fā)生相分離，這些現(xiàn)象在生活中隨處可見，如泥水發(fā)生分離形成上面水下面泥，油水混合物分離出油浮于水表層的現(xiàn)象（稱為液液相分離）。膠體溶液則是具有相分離趨勢，但需外部環(huán)境的影響。

早在1911年，法國生物學(xué)家勒杜克（S. Leduc）在《生命的機(jī)制》一書中就提出，生命研究最好從研究兩種不同液體接觸產(chǎn)生的物理化學(xué)現(xiàn)象開始，說明他已敏銳意識到相分離在細(xì)胞生命活動過程發(fā)揮著的重要作用。1913年，英國生物化學(xué)家諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者霍普金斯（F. G. Hopkins）在一次演講中提出，細(xì)胞可視為“多相系統(tǒng)的特定動態(tài)系統(tǒng)”。1920年代，蘇聯(lián)生物化學(xué)家奧巴林（A. I. Oparin）和英國進(jìn)化生物學(xué)霍爾丹（J. B. S. Haldane）提出生命起源的“原始湯”假說就認(rèn)為，生命早期大分子可能通過相分離形成液滴狀結(jié)構(gòu)，可看作生命的雛形。

但對生物相分離系統(tǒng)研究則開始于2009年對P顆粒（P granule）形成機(jī)制的探索。

P顆粒

自19世紀(jì)上半葉細(xì)胞學(xué)說提出后，研究人員就對細(xì)胞展開了廣泛研究。1858年，瑞士植物學(xué)家馮·內(nèi)格里（C. W. von N？geli）在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒。19世紀(jì)末，英國生物學(xué)家哈迪 （W. B. Hardy）和美國細(xì)胞生物學(xué)家威爾遜（E. B. Wilson）就將細(xì)胞質(zhì)看作膠體，其中還懸浮著許多小液滴，這一說法意味著細(xì)胞質(zhì)具有相對穩(wěn)定性（膠體性質(zhì)）和相分離趨勢（小液滴的存在）的雙重性。細(xì)胞生物學(xué)家隨后借助電子顯微鏡等工具在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量不被膜包圍的結(jié)構(gòu)，它們可產(chǎn)生獨(dú)立的微小空間，就像細(xì)胞中出現(xiàn)的相對隔絕的“世外桃源”，著名的如核仁等。

線蟲（C. elegans）是一種多細(xì)胞生物，所有細(xì)胞都來源于一個共同細(xì)胞——受精卵，受精卵經(jīng)多次分裂和分化后產(chǎn)生多種類型細(xì)胞進(jìn)而形成組織和器官，如肌肉、血液、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等，最初細(xì)胞與后來分化細(xì)胞的先后連續(xù)關(guān)系稱為譜系（cell lineage），與人類族譜概念相似，如線蟲P譜系的名稱源于首次分裂后位于后部（posterior）。1982年，美國科羅拉多大學(xué)斯特羅姆（S. Strome）和伍德（B. Wood）在研究線蟲胚胎過程中，偶然發(fā)現(xiàn)兔IgG血清可識別一種“顆粒”狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)僅存在于P譜系，故命名P顆粒[2]。進(jìn)一步借助電子顯微鏡在果蠅等其他物種生殖種系（germline）也觀察到類似結(jié)構(gòu)，證明其普遍性。電子顯微鏡圖像顯示P顆粒內(nèi)部具有致密結(jié)構(gòu)；借助綠色熒光蛋白標(biāo)記和共聚焦顯微鏡可觀察到P顆粒具有液體樣結(jié)構(gòu)。

P顆粒是一種生殖顆粒，存在線蟲整個生命周期，隨機(jī)分布于受精前的卵子中，受精后向后端集聚，在隨后細(xì)胞分裂過程中發(fā)生不對等分配，保留P顆粒的細(xì)胞才能最終發(fā)育為生殖細(xì)胞——卵細(xì)胞[3]。

線蟲的P顆粒成分主要是兩類RNA結(jié)合蛋白：RGG結(jié)構(gòu)域蛋白（如PGL-1和PGL-3）和DEAD盒蛋白（如GLH-1到GLH-4），現(xiàn)在的問題是P顆粒如何實(shí)現(xiàn)從分散到集中，最初認(rèn)為這是細(xì)胞質(zhì)定向流動的緣故，但后續(xù)的研究否定了這一看法。

P顆粒與相分離

布朗溫（C. P. Brangwynne）是一位美國材料科學(xué)家，大學(xué)期間原本喜歡西班牙語，后來卻對細(xì)胞生物學(xué)產(chǎn)生濃厚興趣，并跟隨老師開展一些科學(xué)研究，卻陰差陽錯選擇了研究材料科學(xué)，但并未放棄生物學(xué)，主要因?yàn)樗私獾讲牧峡茖W(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的融合將會非常有趣，又獲悉生物學(xué)家大多對材料學(xué)一無所知，更談不上如何在研究中應(yīng)用材料學(xué)知識。因此，布朗溫在完成本職學(xué)業(yè)同時，盡可能抽出時間開展細(xì)胞生物學(xué)方面的研究，理解并掌握細(xì)胞擴(kuò)散、自組織等知識。

布朗溫在隨后的哈佛大學(xué)博士期間，主要研究軟物質(zhì)材料的物理學(xué)性質(zhì)，重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞骨架中微管的生物力學(xué)和動態(tài)平衡，實(shí)現(xiàn)材料科學(xué)和生物學(xué)的融合。2006年，在即將畢業(yè)之際，布朗溫參加了美國海洋生物實(shí)驗(yàn)室舉辦的著名生理學(xué)課程，并被其內(nèi)容深深吸引，更堅(jiān)定了從事細(xì)胞生物學(xué)研究的決心，他喜歡旅游和開闊視野的性格，讓他選擇到德國馬克斯·普朗克分子細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)研究所海曼（A. A. Hyman）實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究[4]。

海曼是一位英國細(xì)胞生物學(xué)家，在劍橋大學(xué)學(xué)習(xí)期間，對線蟲的胚胎發(fā)育產(chǎn)生了濃厚興趣，博士后期間開始利用物理學(xué)方法研究微管動力學(xué)，相信從物理學(xué)視角去研究細(xì)胞生物學(xué)，會獲得獨(dú)特見解。海曼加入馬克斯·普朗克研究所后，重回線蟲胚胎發(fā)育的研究工作，不過這次是借助物理學(xué)方法研究線蟲細(xì)胞質(zhì)組裝過程和功能。

布朗溫和海曼經(jīng)過深入討論后，決定研究P顆粒的不對稱分離機(jī)制。布朗溫使用共聚焦成像和粒子示蹤法，確定細(xì)胞質(zhì)流動不會導(dǎo)致P顆粒分離；相反，P顆粒穩(wěn)定性存在時空調(diào)節(jié)，胚胎一側(cè)的P顆粒會逐漸縮小直至消失，而另一側(cè)的會逐漸增長。布朗溫還開發(fā)了一些簡單聚集模擬，試圖解析P顆粒的形成原因，但未成功。

2008年夏，布朗溫和海曼被邀去美國海洋生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生理學(xué)方面的講學(xué)。其間，布朗溫讓學(xué)生拍攝了一系列顯微鏡下觀察P顆粒融合過程的視頻，在分析視頻時驚奇地發(fā)現(xiàn)這些顆粒像氣泡一樣進(jìn)行碰撞和聚集，其行為看起來非常像“液滴”，而不是固體顆粒[5]。他們立刻意識到P顆粒并不像最初命名時認(rèn)為的那樣擁有堅(jiān)硬內(nèi)核，相反它們更像油滴，先分散后融合，并混合成更大的液滴。這一發(fā)現(xiàn)使布朗溫豁然開朗，擁有材料科學(xué)和軟物質(zhì)物理學(xué)深厚背景的他，立刻意識到自己以前膠體物理、表面張力、黏度和液滴聚集動力學(xué)等方面的知識非常有用，這種現(xiàn)象非常容易解釋，因?yàn)槟蔷褪前l(fā)生了相變，膠體通過相分離成為乳濁液。

布朗溫和海曼回到馬普研究所后又補(bǔ)充了體外實(shí)驗(yàn)，將充滿P顆粒的線蟲性腺粘在兩塊薄薄玻璃板之間，然后將玻璃板相互滑過，P顆粒會像雨點(diǎn)般融合、滴落和凝結(jié)，這進(jìn)一步證實(shí)了他們最初的推測。

2009年，這項(xiàng)研究發(fā)表在《科學(xué)》（Science）雜志上[6]，標(biāo)志著這個新領(lǐng)域的誕生。這一發(fā)現(xiàn)的重要性在于提出相分離是某些大分子從無序的分散狀態(tài)濃縮形成有序的凝聚體過程的重要驅(qū)動力。

最初科學(xué)家對此持一定的懷疑態(tài)度，2011年，布朗溫和海曼進(jìn)一步證明細(xì)胞核中核仁也表現(xiàn)出液液相分離機(jī)制，說明這種現(xiàn)象是普遍存在的。

全面研究

2009年之前，一些科學(xué)家其實(shí)已在體外觀察到相分離，如蛋白質(zhì)晶體制備過程中蛋白質(zhì)從溶液中析出可看作固液相分離，但很少人關(guān)注這一現(xiàn)象，也沒有將其與無膜細(xì)胞器相關(guān)聯(lián)。2009年后，多家實(shí)驗(yàn)室開始關(guān)注相分離。

羅森（M. K. Rosen）是一位美國結(jié)構(gòu)生物學(xué)家，他主要采用磁共振光譜和生物化學(xué)方法，研究細(xì)胞骨架控制的信號通路，其中N-WASP蛋白是其研究內(nèi)容之一。2008年，羅森研究組決定探索N-WASP和它的多價結(jié)合蛋白（Nck）間關(guān)系，多價結(jié)合蛋白是指兩種蛋白的結(jié)合是一對多，而非一對一，因此更容易形成多聚體而不是二聚體，這種現(xiàn)象在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物中較為常見。他們發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白的濃度超過一定數(shù)值（如30微摩爾）時，溶液會立即變得渾濁，最初假定形成一種大的聚合物，但進(jìn)行離心操作使溶液變得澄清時，離心管底部并未發(fā)現(xiàn)沉淀，震蕩后渾濁重新出現(xiàn)。進(jìn)一步借助顯微鏡觀察，驚喜地發(fā)現(xiàn)溶液中充滿著微小液滴，類似于乳濁液中的油。這些小液滴對光具有散射效應(yīng)，故溶液出現(xiàn)渾濁；但形成的小液滴由于體積太小，離心后無法發(fā)現(xiàn)，因此未能發(fā)現(xiàn)沉淀[7]。這是在體外證實(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生相分離形成液滴的現(xiàn)象。

麥克奈特（S. L. McKnight）是一位美國生物化學(xué)家，主要研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。麥克奈特組發(fā)現(xiàn)構(gòu)成RNA顆粒中的RNA結(jié)合蛋白，可在特定化合物介導(dǎo)下發(fā)生凝聚形成水凝膠樣結(jié)構(gòu)，顯微鏡下觀察到它們由均勻的淀粉樣纖維組成，與致病性纖維不同，這些結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)動態(tài)變化，一直處于聚合和解聚的平衡之中[8]。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了相分離的重要性。

這兩項(xiàng)研究表明相分離可在試管中以如此簡單的方式重現(xiàn)，從而極大簡化這一領(lǐng)域的研究，推動了后續(xù)研究的快速發(fā)展。2015年，多個研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，不同蛋白均可通過相分離機(jī)制形成凝聚體進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)活性，這使相分離的重要性逐漸得到科學(xué)界認(rèn)可。

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，大量無膜細(xì)胞器如卡哈爾體（Cajal body， CB）、核孔復(fù)合物、核散斑（nuclear speckle）、P小體（processing body， P-body）、應(yīng)激顆粒（stress granule， SG）等，都通過相分離過程形成進(jìn)而完成相應(yīng)的生理功能，包括RNA代謝、核糖體生成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

生理功能

細(xì)胞內(nèi)正常相分離對生物功能的完成至關(guān)重要[9]。相分離產(chǎn)生無膜細(xì)胞器的意義主要體現(xiàn)在三個方面：一是制造相對獨(dú)立的密閉空間，保證反應(yīng)過程少受周圍環(huán)境影響，有利于反應(yīng)物濃縮；二是這些細(xì)胞器的構(gòu)成本身成分可作為反應(yīng)物參與生化反應(yīng)；三是作為聚集體形成的組織中心。參與生物凝聚體形成的蛋白質(zhì)通常具有多價結(jié)合能力，如攜帶多個富含脯氨酸基序性，或擁有多個內(nèi)在無序區(qū)域（intrinsically disordered region， IDR）等。

轉(zhuǎn)錄是細(xì)胞內(nèi)最為重要的生物過程，其中負(fù)責(zé)mRNA轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶Ⅱ及其借助相分離形成的凝聚體最為關(guān)鍵。許多RNA結(jié)合蛋白擁有IDR，可與RNA結(jié)合，因此與RNA聚合酶Ⅱ共定位于啟動子或增強(qiáng)子，有利于轉(zhuǎn)錄的啟動。RNA拼接過程也具有類似機(jī)制。

最早發(fā)現(xiàn)具有明確生理功能的高動態(tài)細(xì)胞內(nèi)凝聚體，是Wnt信號通路成分借助相分離形成的超分子復(fù)合物（Wnt信號體）。Dvl蛋白通過特定結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞質(zhì)中聚集形成信號體，從而啟動下游信號。

疾病發(fā)生

細(xì)胞需時刻保持內(nèi)部的高度有序，相分離異常容易破壞有序性，引發(fā)功能紊亂進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生，常見的如神經(jīng)退行性疾病和癌癥等[10]。

神經(jīng)退行性疾病是一類表現(xiàn)為認(rèn)知功能喪失或運(yùn)動功能缺陷等的疾病，前者有阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease， AD）和額顳葉癡呆（frontotemporal dementia， FTD）等，后者包括亨廷頓舞蹈癥（Huntington disease， HD）、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis， ALS）和帕金森?。≒arkinson’s disease， PD）等。這類疾病的一個共同特征是，某些關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞內(nèi)特定區(qū)域出現(xiàn)異常聚集并沉積，破壞神經(jīng)元活性，最終造成功能性喪失而出現(xiàn)多種癥狀。

幾種RNA結(jié)合蛋白，如TDP-43（TAR DNA binding protein of 43 kDa）和FUS（Fused in Sarcoma）等突變，與FTD和ALS相關(guān)，部分致病原因在于正常相分離被破壞。這些蛋白質(zhì)的突變一方面引發(fā)了應(yīng)激顆粒過度形成和蛋白質(zhì)大量堆積，另一方面還破壞了解離過程。體外實(shí)驗(yàn)表明，突變的TDP-43或FUS首先通過相分離形成小液滴，但隨著時間推移，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)小顆粒而易沉淀，該過程稱為體外老化，模擬了FTD和ALS發(fā)生過程。此外，蛋白異常翻譯后修飾，如FUS精氨酸低甲基化和TDP-43過度磷酸化也可破壞相分離平衡，造成過量凝聚體形成。tau蛋白具有微管結(jié)合功能，在正常神經(jīng)元中通過相分離促進(jìn)微管蛋白聚集實(shí)現(xiàn)微管成核作用。但是，AD相關(guān)的tau蛋白突變或異常翻譯后修飾，也將導(dǎo)致相分離失衡而使凝聚體增多，并促進(jìn)隨后的固化和聚集，造成疾病發(fā)生。

TP53是人類癌癥中最常見的突變基因，在超過50%的腫瘤中觀察到其突變。部分突變造成TP53蛋白更容易形成聚集體，該現(xiàn)象已在乳腺癌、皮膚癌和前列腺癌等中發(fā)現(xiàn)，且與臨床不良預(yù)后相關(guān)。

近年來，在確定各種人類疾病遺傳原因方面取得快速進(jìn)展。借助遺傳學(xué)或者基因組測序方法鑒定出多種致病基因，但這些突變基因如何導(dǎo)致疾病表型大多尚不清晰。部分原因在于傳統(tǒng)分子生物學(xué)研究模式更多關(guān)注的是單一分子功能改變與復(fù)雜疾病表型的線性對應(yīng)關(guān)系，較少對多分子相互作用進(jìn)行研究。相分離現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)無疑為探索這些基因致病機(jī)制提供新方向。

重要意義

相分離很好地解釋了細(xì)胞內(nèi)，生物大分子的時空分配、無膜細(xì)胞器形成和解離過程，進(jìn)一步對諸多生命現(xiàn)象有了新理解。自2009年取得突破以來，相分離研究已成為當(dāng)前生命科學(xué)的一個前沿領(lǐng)域和研究熱點(diǎn)。相分離概念的提出和深入研究將為許多生命現(xiàn)象的理解提供了新的緯度，有望為疾病治療提供新的策略。

在相分離研究過程中做出奠基性貢獻(xiàn)的多位科學(xué)家正在逐漸得到科學(xué)界認(rèn)可。2021年，布朗溫、海曼和羅森分享了第19屆威利生物醫(yī)學(xué)科學(xué)獎；布朗溫和海曼還獲得2023年生命科學(xué)突破獎等。

經(jīng)過十幾年的發(fā)展，生物液液相分離和無膜細(xì)胞器領(lǐng)域已取得一系列重要發(fā)展，對不同外界因素（如靜電效應(yīng)、溫度、pH等）和蛋白內(nèi)部特定結(jié)構(gòu)域在無膜細(xì)胞器組裝和形成過程中的作用已有較全面的理解，并對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變異造成疾病發(fā)生的機(jī)制有了初步認(rèn)識，有望在治療手段和效果方面取得突破。但也應(yīng)看到相對于傳統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域，相分離領(lǐng)域的研究手段和深度較為有限，許多問題尚待進(jìn)一步闡明，如相分離發(fā)生過程中特定結(jié)構(gòu)隨時間的變化、無膜細(xì)胞器形成和解離過程的詳細(xì)機(jī)制、凝聚物從液態(tài)轉(zhuǎn)化為老化態(tài)（易沉淀）的內(nèi)在原因等。但隨著越來越多研究人員的關(guān)注和加入，生物相分離研究的前進(jìn)步伐在逐漸加快，也有望在應(yīng)用方面大展身手。

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關(guān)鍵詞：相分離 無膜細(xì)胞器 生物凝聚體 神經(jīng)退行性疾病 ■