張昱 任瑞平 萬(wàn)鵬 賀曉蘭

摘要：目的 構(gòu)建整合胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）分子亞型和免疫相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。方法 以GSE71729數(shù)據(jù)集（n=145）為訓(xùn)練集，整合PDAC鱗狀和非鱗狀亞型之間差異表達(dá)基因和差異免疫相關(guān)基因構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選發(fā)揮主調(diào)控鱗狀亞型的5個(gè)免疫標(biāo)志基因。基于患者生存信息和免疫標(biāo)志基因構(gòu)建整合免疫評(píng)分（IIS）模型來(lái)預(yù)測(cè)PDAC患者的臨床預(yù)后，并在5個(gè)驗(yàn)證集（n=758）中檢驗(yàn)其預(yù)測(cè)效能。結(jié)果 根據(jù)IIS將PDAC患者分為高危組和低危組。在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中，高危組患者的總體生存期均短于低危組（P均<0.001）。多變量Cox回歸分析顯示IIS是PDAC的獨(dú)立預(yù)后因子（HR=2.16，95%CI=1.50～3.10，P<0.001）。結(jié)論 IIS可用于PDAC患者的危險(xiǎn)分層，并可能成為PDAC潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：胰腺導(dǎo)管腺癌；免疫相關(guān)基因；預(yù)后

中圖分類號(hào)： R735.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A? 文章編號(hào)：1000-503X（2024）03-0354-07

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15736

Construction and Evaluation of a Prognostic Risk Prediction Model of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Based on Immune-Related Genes

ZHANG Yu，REN Ruiping，WAN Peng，HE Xiaolan

Cancer Radiotherapy and Chemotherapy Center，The Affiliated Peoples Hospital of Ningbo University，Ningbo，Zhejiang 315040，China

Corresponding author：ZHANG Yu Tel：0574-87017563，E-mail：zy95589034@163.com

ABSTRACT：Objective To construct a risk prediction model by integrating the molecular subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma （PDAC） and immune-related genes.Methods With GSE71729 data set （n=145） as the training set，the differentially expressed genes and differential immune-related genes between the squamous and non-squamous subtypes of PDAC were integrated to construct a regulatory network，on the basis of which five immune marker genes regulating the squamous subtype were screened out.An integrated immune score （IIS） model was constructed based on patient survival information and immune marker genes to predict the clinical prognosis of PDAC patients，and its predictive performance was tested with 5 validation sets （n=758）.Results PDAC patients were assigned into high risk and low risk groups according to the IIS.In both training and validation sets，the overall survival of patients in the high risk group was shorter than that in the low risk group （both P<0.001）.The multivariable Cox regression showed that IIS was an independent prognostic factor for PDAC （HR=2.16，95%CI=1.50-3.10，P<0.001）.Conclusion IIS can be used for risk stratification of PDAC patients and may become a potential prognostic marker for PDAC.

Key words：pancreatic ductal adenocarcinoma；immune-related gene；prognosis

Acta Acad Med Sin，2024，46（3）：354-360

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，占胰腺癌組織學(xué)類型的90%以上，是全球第七大癌癥相關(guān)死亡原因［1］，在我國(guó)其患病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)［2］。盡管近些年P(guān)DAC的治療策略有所改進(jìn)，但其預(yù)后情況仍然十分嚴(yán)峻，5年存活率僅為9%［3］。由于患者個(gè)體差異及疾病的異質(zhì)性，手術(shù)和化療的治療效果存在差異［4-5］。對(duì)PDAC患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層，有助于制訂精準(zhǔn)和個(gè)體化的治療方案，改善患者預(yù)后和臨床轉(zhuǎn)歸。高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，為揭示基因表達(dá)和修飾特性提供了有力支持，從而能夠更有效地開(kāi)發(fā)與PDAC預(yù)后評(píng)估緊密相關(guān)的生物標(biāo)志物［6-8］。根據(jù)表達(dá)譜聚類結(jié)果，PDAC可分為鱗狀亞型、胰腺祖細(xì)胞亞型、免疫原性亞型和內(nèi)/外分泌腺異常分化亞型，其中鱗狀亞型約占31%，侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，預(yù)后相對(duì)較差，中位生存期僅為13.3個(gè)月［9］。該亞型的主要分子特征包括TP53和KDM6A基因突變、TP63基因轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)上調(diào)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因高表達(dá)以及胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞命運(yùn)決定基因的甲基化［10］。識(shí)別鱗狀亞型的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制有助于PDAC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。此外，研究發(fā)現(xiàn)免疫微環(huán)境也與PDAC預(yù)后密切相關(guān)［11-12］。本研究擬通過(guò)整合分析鱗狀亞型PDAC中的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征和免疫相關(guān)基因的相互關(guān)系，利用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推理研究主調(diào)控鱗狀亞型的免疫標(biāo)志基因，構(gòu)建一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，為PDAC患者的精準(zhǔn)治療提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及處理

本研究納入6個(gè)公共數(shù)據(jù)集，共903例PDAC患者，其中GSE71729數(shù)據(jù)集（n=145）作為訓(xùn)練集，PACA-AU（n=242）、PACA-CA（n=193）、TCGA-PAAD（n=146）、GSE85916（n=80）和GSE131050（n=97）作為驗(yàn)證集。采用GEOquery包（V 1.0.7）［13］從基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取GSE71729、GSE85916和GSE131050數(shù)據(jù)集的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息。PACA-AU和PACA-CA數(shù)據(jù)集中標(biāo)準(zhǔn)化的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息來(lái)自國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟網(wǎng)站（https：//icgc.org/）。采用TCGAbiolinks包（V 2.18.0）［14］從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載TCGA-PAAD數(shù)據(jù)集的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)譜和相應(yīng)臨床信息。微陣列數(shù)據(jù)中的探針I(yè)D被轉(zhuǎn)換成基因符號(hào)，若有多個(gè)探針I(yè)D對(duì)應(yīng)同一種基因符號(hào)，則保留平均表達(dá)值最高的探針I(yè)D來(lái)表示該基因。GSE71729、PACA-AU以及TCGA數(shù)據(jù)集中的分子分型信息來(lái)源于Rashid等［15］的研究。

1.2 整合網(wǎng)絡(luò)分析

從Immport數(shù)據(jù)庫(kù)［16］獲取2498個(gè)免疫相關(guān)基因。采用R軟件limma包對(duì)PDAC樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析，以|log2FC|>0.5和校正后P<0.05為閾值篩選鱗狀和非鱗狀亞型之間差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因。采用RTN包（V 2.10.0）［17］整合差異表達(dá)基因并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。采用主調(diào)控分析計(jì)算各免疫基因調(diào)控單元中的鱗狀亞型特征基因的超幾何檢驗(yàn)P值，進(jìn)而得到主調(diào)控鱗狀亞型的免疫標(biāo)志基因。

1.3 模型構(gòu)建和驗(yàn)證

基于篩選的免疫標(biāo)志基因和患者生存信息，采用多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸構(gòu)建整合免疫評(píng)分（integrating immune score，IIS）模型，模型系數(shù)是基因的Cox回歸系數(shù)，基因值是FPKM。IIS風(fēng)險(xiǎn)賦分公式為：IIS=（0.0068×PLAU）+（0.2584×AQP9）+（-0.3970×COLEC12）+（0.0721×S100A2）+（0.3604×VIM），以上四分位數(shù)為閾值將患者分為高危組和低危組。采用Kaplan-Meier生存分析，在5個(gè)獨(dú)立的驗(yàn)證集中對(duì)IIS模型進(jìn)行性能評(píng)估。此外，納入其他臨床因素作為協(xié)變量，采用單變量和多變量Cox回歸分析檢驗(yàn)IIS是否為PDAC患者的獨(dú)立預(yù)后因子。

1.4 基因集富集分析

為探究高危組中富集的信號(hào)通路，采用R軟件HTS包（V 2.3.5）［18］進(jìn)行基因集富集分析，設(shè)定P<0.05為顯著性閾值，置換檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)置為1000。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

采用CIBERSORT算法表征高危組和低危組患者的腫瘤組織基因表達(dá)譜中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度。CIBERSORT是一種反卷積算法，可以估算出每個(gè)腫瘤組織樣本中22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相對(duì)比例。將標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)譜上傳至CIBERSORT網(wǎng)站（https：//cibersort.stanford.edu/），運(yùn)行參數(shù)設(shè)定為1000次隨機(jī)排列，以LM22作為已知參考集，分析樣本中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R軟件limma包（V 3.42.2）［19］進(jìn)行PDAC鱗狀和非鱗狀亞型之間的差異分析。采用R軟件plotly包對(duì)PDAC鱗狀和非鱗狀亞型之間的差異基因進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。采用列線圖對(duì)多個(gè)影響因素進(jìn)行整合并構(gòu)建評(píng)分，繪制校準(zhǔn)曲線評(píng)估列線圖的預(yù)測(cè)性能。采用R軟件（V 3.6.1）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫標(biāo)志基因的篩選

通過(guò)差異基因分析從GSE71729數(shù)據(jù)集中篩選出差異表達(dá)的95個(gè)免疫相關(guān)基因和1269個(gè)差異表達(dá)基因。PCA法篩選出5個(gè)主調(diào)控鱗狀亞型的免疫標(biāo)志基因，分別為PLAU（P<0.001）、AQP9（P=0.011）、VIM（P=0.032）、S100A2（P=0.040）和COLEC12基因（P=0.041）（圖1A）。在TCGA-PAAD驗(yàn)證集中，與非鱗狀亞型比較，鱗狀亞型PLAU、VIM、S100A2和COLEC12基因的表達(dá)均增高（P均<0.001）（圖1B）。

2.2 IIS模型的預(yù)測(cè)效能

高危組Bailey分型的鱗狀亞型（P<0.001）、Moffitt分型的類基底細(xì)胞亞型（P<0.001）及死亡患者（P<0.001）的比例高于低危組（圖2A）。PCA結(jié)果顯示，訓(xùn)練集中IIS可以有效地區(qū)分鱗狀和非鱗狀亞型（圖2B）。此外，腫瘤分化程度越低IIS越高，且轉(zhuǎn)移灶中的IIS高于原發(fā)灶和正常組織（P均<0.001）（圖2C）。

2.3 IIS模型驗(yàn)證

受試者工作特征曲線分析顯示，相較于單個(gè)免疫標(biāo)志基因，IIS對(duì)患者2年生存時(shí)間的預(yù)測(cè)能力更強(qiáng)，其曲線下面積達(dá)到0.73（圖3A）。生存分析顯示，訓(xùn)練集（HR=2.3，95% CI=1.4～3.8，P<0.001）和PACA-AU（HR=2.0，95% CI=1.4～2.9，P<0.001）、PACA-CA（HR=1.9，95% CI=1.3～2.8，P<0.001）、TCGA-PAAD（HR=1.6，95% CI=1.0～2.7，P<0.001）、GSE85916（HR=1.9，95% CI=1.1～3.4，P<0.001）、GSE131050（HR=4. 95% CI=1.7～10.0，P<0.001）驗(yàn)證集中高危組患者的總體生存期均明顯低于低危組（圖3B～G）。納入性別、TNM分期和分化程度等臨床因素作為協(xié)變量，進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸分析，結(jié)果顯示IIS是PDAC的獨(dú)立預(yù)后因子（HR=2.16，95%CI=1.50～3.10，P<0.001）。

2.4 列線圖的預(yù)測(cè)效能

納入IIS與年齡、性別、TNM分期和腫瘤分級(jí)等變量構(gòu)建列線圖，對(duì)患者1年和3年生存率進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖4A）；校準(zhǔn)曲線顯示1年和3年生存率的預(yù)測(cè)校準(zhǔn)曲線趨近標(biāo)準(zhǔn)曲線，說(shuō)明該模型對(duì)PDAC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力較高（圖4B）。

2.5 IIS模型多組學(xué)功能分析

基因集富集分析顯示，血管生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、細(xì)胞周期、絲裂原活化蛋白激酶、WNT等相關(guān)通路顯著富集于高危組，而DNA修復(fù)缺陷通路則在高危組中相對(duì)下調(diào)（圖5A）。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析顯示，高危組中M0巨噬細(xì)胞比例顯著增加（P<0.001），低危組中單核細(xì)胞和未活化的CD4記憶性T細(xì)胞比例顯著增加（P<0.00 P=0.009）（圖5B）。

3 討論

PDAC是胰腺癌中最常見(jiàn)的一種類型，其病情隱匿且進(jìn)展迅速，預(yù)后極差。全身化療是針對(duì)進(jìn)展期和復(fù)發(fā)PDAC患者最主要的治療手段，但由于嚴(yán)重的不良反應(yīng)和患者低耐受性，患者臨床收益有限［20］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及腫瘤免疫微環(huán)境的深入研究，以程序性細(xì)胞死亡蛋白1/ 程序性死亡配體1抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4抑制劑為代表的免疫療法在肺癌、黑色素瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤中表現(xiàn)出較好的效果，顯著改善了患者預(yù)后［21］。然而對(duì)于PDAC免疫療法收效甚微，目前的證據(jù)表明處于高度免疫抑制狀態(tài)的腫瘤微環(huán)境是阻礙免疫療法有效性的主要因素。不同的基質(zhì)和免疫浸潤(rùn)細(xì)胞類型與PDAC患者的預(yù)后相關(guān)［22］。因此，探究腫瘤微環(huán)境中的免疫狀態(tài)對(duì)于PDAC整體評(píng)估和治療策略的制訂具有重要意義。近年來(lái)，癌癥分子分型研究揭示了PDAC的分子特征，基于表達(dá)譜的特征聚類分析，PDAC被分為鱗狀亞型、胰腺祖細(xì)胞亞型、免疫原性亞型和內(nèi)/外分泌腺異常分化亞型，其中鱗狀亞型惡性程度最高［9］。本研究篩選了鱗狀亞型和非鱗狀亞型之間的差異表達(dá)基因和差異免疫基因，構(gòu)建了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出主調(diào)控鱗狀亞型的5個(gè)免疫標(biāo)志基因，分別是PLAU、AQP9、VIM、S100A2和COLEC12基因。這些基因廣泛參與免疫信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，PLAU在胃癌中呈高表達(dá)，其相關(guān)基因參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、耐藥形成等信號(hào)通路，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)削弱，提示患者預(yù)后不良［23］。AQP9是存在于多種免疫細(xì)胞中的一類水甘油通道蛋白，高表達(dá)于乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中，與較差預(yù)后顯著相關(guān)，且參與調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)［24］。VIM是一種間充質(zhì)狀態(tài)標(biāo)志物，在多種轉(zhuǎn)移性腫瘤中呈高表達(dá)［25］。S100A2屬于S100蛋白家族，是一類高度保守的EF-手型鈣結(jié)合蛋白［26］，其表達(dá)失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)［27］。Li等［28］研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)S100A2通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解重編程促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。COLEC12是一種清道夫受體，作為固有免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別分子，與宿主防御相關(guān)的多種功能有關(guān)［29］，參與白細(xì)胞募集和癌癥轉(zhuǎn)移［30］。本研究成功構(gòu)建IIS模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)PDAC患者的危險(xiǎn)分層，不同于以往的單基因或多基因標(biāo)志物，該模型結(jié)合免疫系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄組水平的分子亞型特征，有效減少了腫瘤異質(zhì)性的干擾。經(jīng)IIS危險(xiǎn)分層后，生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)高危組患者的總體生存期明顯低于低危組，且在5個(gè)驗(yàn)證集中的表現(xiàn)一致。納入其他臨床因素作為協(xié)變量，單變量和多變量Cox回歸分析證實(shí)IIS是PDAC預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

本研究構(gòu)建了基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)的PDAC預(yù)后模型，盡管納入了多中心樣本并進(jìn)行了深入分析和驗(yàn)證，但仍存在一些局限性。首先，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)操作流程復(fù)雜，獲取的數(shù)據(jù)需要依賴專門的計(jì)算資源和軟件進(jìn)行處理和解析；其次，不同測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)不一，限制了模型的臨床適用性；最后，由于本研究為回顧性分析，樣本量有限，統(tǒng)計(jì)效力不足。未來(lái)工作需結(jié)合更多前瞻性數(shù)據(jù)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步優(yōu)化和完善該模型。

綜上，本研究結(jié)果表明，基于PDAC亞型分類和免疫相關(guān)基因構(gòu)建的IIS模型，在PDAC患者危險(xiǎn)分層方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，有助于個(gè)體化治療的實(shí)施。

利益沖突 所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 張昱：研究選題設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、起草和修改文章；任瑞平：數(shù)據(jù)收集和整理、數(shù)據(jù)分析、起草論文；萬(wàn)鵬：數(shù)據(jù)分析、修訂論文學(xué)術(shù)內(nèi)容；賀曉蘭：研究選題設(shè)計(jì)、文稿審閱和格式修訂

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（收稿日期：2023-06-20）