摘 要 貓兒山小鯢（Hynobius maoershanensis）已知僅分布于廣西貓兒山國家級自然保護區(qū)。2022 年3 月，在廣西壯族自治區(qū)桂林市全州天湖國家濕地公園（26°6'21″ N，110°54'14″ E；1 680 m）采集到小鯢標本，經(jīng)鑒定為貓兒山小鯢，這是繼2006年于貓兒山保護區(qū)首次發(fā)現(xiàn)后的第2處分布新紀錄。基于線粒體16S rRNA基因和COI基因片段進行系統(tǒng)發(fā)育分析，表明新紀錄所采小鯢標本與貓兒山原產(chǎn)地標本相聚構(gòu)成單系，遺傳距離0. 5%，進一步更新了貓兒山小鯢的分布海拔范圍，較之前記錄的分布海拔1 966 m以上降至1 680 m，提示該種有更廣闊的生態(tài)位，這一發(fā)現(xiàn)對今后該物種的科學管理及保護具有重要意義。

關(guān)鍵詞：貓兒山小鯢；DNA條形碼技術(shù)；新紀錄

中圖分類號：Q958. 1 文獻標識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0441 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240226

小鯢屬（Hynobius）是亞洲特有的有尾兩棲動物，現(xiàn)已知31種，占全科物種數(shù)（65種）的47. 7％［1?3］，我國現(xiàn)有小鯢屬物種12種，包括東北小鯢（H. leechii）、中國小鯢（H. chinensis）、楚南小鯢（H. sonani）、臺灣小鯢（H. formosanus）、觀霧小鯢（H. fucus）、阿里山小鯢（H. arisanensis）、義烏小鯢（H. yiwuensis）、安吉小鯢（H. amjiensis）、掛榜山小鯢（H. guabangshanensis）、貓兒山小鯢（H. maoershanensis）、南湖小鯢（H. gla?cialis）和虛竹小鯢（H. bambusicolus）［3］，其中，貓兒山小鯢為廣西壯族自治區(qū)的特有種［4］，分布十分狹窄，僅分布于廣西貓兒山國家級自然保護區(qū)海拔2 000 m的森林沼澤地及周邊地區(qū)，附近的植被多為鐵杉（Tsuga chinensis）和南方山頂矮林，棲息地植被繁茂。該物種對繁殖棲息地要求嚴格，僅在水質(zhì)清澈的靜水潭中繁殖產(chǎn)卵［5］。該物種頭較大，略扁；頭長大于寬；吻端圓，無唇褶；犁骨齒為“V”形；頭體光滑，頸褶明顯；背部中央從頭至尾基部有縱行嵴溝；掌和指、踱和趾均無掌突和踱突；前足4 指，后足5趾；體背面顏色一般為黑色或淺紫棕色，無斑紋；體腹、側(cè)呈灰色，散布許多白色小斑點；雄性肛部隆起，前緣有小乳突，肛孔縱裂，雌性肛孔呈圓形［5?7］。

2022年3月，在廣西桂林市全州天湖國家濕地公園湖泊淺水區(qū)采集到小鯢標本（圖1）（標本號TH22001，雌性）。由于小鯢屬物種均有其獨特的形態(tài)學特征，且變態(tài)發(fā)育過程中幼體與成體的形態(tài)特征差異較大，常因形態(tài)特征不穩(wěn)定等主觀因素影響鑒別［8?9］。鑒于DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定方面的準確有效性［10］，通過擴增和測序COI和16S rRNA兩種DNA條形碼序列，對全州天湖新紀錄物種進行鑒定，同時結(jié)合形態(tài)學特征進行鑒定，確定新紀錄種為貓兒山小鯢，這是繼2006年于廣西貓兒山國家級自然保護區(qū)首次發(fā)現(xiàn)貓兒山小鯢后的第2 處分布新紀錄。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

標本采自廣西全州天湖國家濕地公園湖泊淺水區(qū)（26°6'21″ N，110°54'14″ E）。標本采用斷尾法取樣，保存在100%乙醇中用于DNA提取，剩余標本固定在10% 福爾馬林中，隨后轉(zhuǎn)移至75% 乙醇溶液中，現(xiàn)保存于廣西師范大學廣西珍稀瀕危動物生態(tài)學重點實驗室。

1. 2 DNA 提取、擴增及測序

采用Sanger測序法，利用Ezup柱式動物組織基因組DNA抽提試劑盒對樣品進行DNA提取，通過對樣品的16S rRNA 基因序列（5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'）、COI 基因序列（5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3'）進行PCR 擴增［11］，1% 瓊脂糖電泳檢測、膠回收等步驟，對擴增的PCR產(chǎn)物進行檢測及純化，使用3730XL測序儀對PCR產(chǎn)物測序，將獲得的COI基因序列在GenBank中進行BLAST［12］比對，所得序列已上傳到GenBank（16S rRNA序列：OQ586670；COI基因：OQ587615）。

1. 3 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中下載小鯢屬部分物種的16S rRNA及COI基因序列，所有分析物種的序列相關(guān)信息如表1所示，以商城肥鯢（Pachyhynobius shangchengen?sis）、極北鯢（Salamandrella keyserlingii）為外群進行系統(tǒng)發(fā)育分析。序列在BioEdit［13］中采用ClustalW比對。在PhyloSuite［14］中選擇ModelFinder模型進行優(yōu)化。使用MrBayes 3. 2. 6［15］在GTR+1+F模型（2個馬爾可夫鏈并行運行，2×105代）下構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹，每100代對系統(tǒng)發(fā)育樹進行抽樣，其中初始25% 的采樣數(shù)據(jù)被丟棄。使用MEGA X［16］中的Kimura雙參數(shù)模型計算小倪屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2. 1 形態(tài)特征

標本TH22001體型中等偏小；頭體略長于尾；頭大略扁，頭寬略小于頭長；吻端鈍圓，無唇褶，眼徑略大于鼻間距，鼻孔近吻端；舌橢圓形；犁骨齒呈“V”

形；體表光滑，頸褶明顯，背部有縱行嵴溝，體側(cè)溝肋；軀干及尾根部呈圓柱形，向后逐漸由側(cè)面變扁，尾末端鈍圓，背面體色呈黑色；腹部扁平，腹面及體側(cè)面呈灰色，散布密集白灰色小斑點；掌和指、踱和趾均無掌突和踱突，前足4指，指長順序：Ⅰlt;Ⅳlt;Ⅲlt;Ⅱ，后足5趾，趾長順序：Ⅰlt;Ⅴlt;Ⅱlt;Ⅳlt;Ⅲ；肛孔呈圓形（圖1）。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用的16S rRNA基因片段長度為609 bp，比對修剪后長度為436 bp，COI基因片段長度為709 bp，比對修剪后長度為567 bp。16S rRNA和COI基因序列在NCBI中進行BLAST比對，均與貓兒山小鯢序列相似性最高，其中16S rRNA 序列比對相似度為99. 49%，COI序列比對相似度為99. 41%，結(jié)合形態(tài)學特征初步確定該物種為貓兒山小鯢。

分別利用表1 中相關(guān)物種的16S rRNA 序列和COI基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2），兩種系統(tǒng)進化樹都表明本研究所采小鯢標本與貓兒山原產(chǎn)地標本相聚構(gòu)成單系。分子系統(tǒng)發(fā)育分析支持采集于全州天湖的小鯢標本為貓兒山小鯢。

2. 3 遺傳距離

基于Kimura 雙參數(shù)模型，分別用16S rRNA 和COI基因序列計算部分小鯢屬物種的遺傳距離，利用16S rRNA序列計算的結(jié)果表明，本研究所采用的小鯢屬物種間遺傳距離為0. 9%～7. 6%（表2），全州天湖的貓兒山小鯢標本與貓兒山小鯢原產(chǎn)地標本的遺傳距離為0. 5%，小于小鯢屬物種間的遺傳距離。表3顯示COI基因的部分小鯢屬物種間遺傳距離為3. 5%～15. 1%，全州天湖的貓兒山小鯢標本與貓兒山小鯢原產(chǎn)地標本的遺傳距離為0. 5%，同樣小于小鯢屬物種間的遺傳距離。

研究結(jié)果表明，16S rRNA和COI基因序列計算的遺傳距離結(jié)果與上述構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果一致，同樣支持采集于全州天湖的小鯢標本為貓兒山小鯢。

3 討論

貓兒山小鯢現(xiàn)有記錄僅發(fā)現(xiàn)于廣西貓兒山國家級自然保護區(qū)海拔1 966 m以上的森林沼澤地及周邊地區(qū)，棲息范圍十分狹小，野外種群數(shù)量極低［5，21?22］，為貓兒山國家級自然保護區(qū)特有種。本研究新增記錄點為全州天湖國家濕地公園（26°6'21″ N，110°54'14″ E；1 680 m），該記錄分布海拔范圍較之前記錄的1 966 m有所擴大，提示該種有更廣闊的生態(tài)位，隨著生物多樣性調(diào)查和研究不斷深入，新的分布區(qū)有望被發(fā)現(xiàn)。貓兒山和全州天湖國家濕地公園同屬于越城嶺山脈（圖3），越城嶺山脈是云貴高原的東南端、南嶺山系的西北支，高山地區(qū)，土壤肥沃，植被繁茂，水資源豐富，常年大霧，相對濕度大［23］，兩處記錄分布點的生境特點尤為相似，因而兩地可能有著相似的物種組成，其獨特的山地環(huán)境和適宜氣候也為貓兒山小鯢提供了良好的棲息庇護場所。同時也提示該區(qū)域兩棲動物多樣性此前可能被低估，該區(qū)域也許有著較高的兩棲動物多樣性［24?25］。

我國有尾兩棲類物種的遺傳多樣性水平普遍比較低，主要原因為該種類物種進化緩慢，適應(yīng)性差，因而許多物種數(shù)量驟減，甚至瀕臨滅絕［26］，與此同時，人類活動的日益頻繁，導致自然棲息地大面積縮小，環(huán)境污染、自然資源過度開發(fā)等也是造成小鯢科（Hynobiidae）動物衰退和滅絕的重要原因［27］。貓兒山小鯢遷移距離短，對環(huán)境依賴性強，適應(yīng)力弱，近年來，由于人類活動的影響和全球氣候的變化，導致其種群數(shù)量也在不斷減少［22］，而貓兒山與全州天湖國家濕地公園均屬于旅游景區(qū)，人為活動頻繁，旅游設(shè)施的建設(shè)等因素對棲息地環(huán)境的破壞力度不容小覷，隨著人類活動等因素影響的持續(xù)惡化，貓兒山小鯢的生存狀況堪憂。此次在全州天湖國家濕地公園發(fā)現(xiàn)該物種，填補了貓兒山小鯢現(xiàn)有紀錄單一分布的空缺，對今后研究貓兒山小鯢的地理分布和演化具有重要意義。

參考文獻：

［1］ FROST D， American Museum of Natural History. Amphibian spe?cies of the world 6. 2， an online reference.［ DB/OL］.［ 2023-08-08］. https：// amphibiansoftheworld. amnh. org/.

［2］ 熊建利， 劉秀英， 皮兵， 等. 中國小鯢屬物種的分類學研究進展［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學， 2010， 49（8）：1990-1992.

XIONG J L， LIU X Y， PI B， et al. Research advances of tax?onomy in Chinese Hynobius species［J］. Hubei Agricultural Sci?ences， 2010， 49（8）：1990-1992.

［3］ 中國科學院昆明動物研究所.“ 中國兩棲類”信息系統(tǒng)［DB/OL］.［ 2023-08-08］. http：// www. amphibiachina. org/.Kunming Institute of Zoology. The database of Chinese amphib?ians［ DB/OL］.［ 2023-08-08］. http：//www. amphibiachina. org/.

［4］ 陳偉才. 廣西兩棲動物概況［J］. 廣西林業(yè)， 2017（8）： 25-26.CHEN W C. Overview of amphibians in Guangxi ［J］. GuangxiForestry， 2017（8）： 25-26.

［5］ 周放， 蔣愛伍， 蔣得斌. 中國兩棲類一新種（有尾目， 小鯢科）［J］. 動物分類學報， 2006， 31（3）： 670-674.

ZHOU F， JIANG A W， JIANG D B. A new species of the genusHynobius from Guangxi Zhuang Autonomous Region， China （Cau?data， Hynobiidae）［J］. Acta Zootaxonomica Sinica， 2006， 31（3）：670-674.

［6］ 蔣锝斌， 羅遠周， 王紹能， 等. 廣西貓兒山國家級自然保護區(qū)的兩棲爬行動物［J］. 四川動物， 2006， 25（2）： 294-297；封三.

JIANG D B， LUO Y Z， WANG S N， et al. Amphibians and rep?tiles in Maoershan National Nature Reserve ［J］. Sichuan Journalof Zoology， 2006， 25（2）： 294-297； inside back cover.

［7］ 費梁， 葉昌媛， 江建平. 中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒［M］. 成都： 四川科學技術(shù)出版社， 2012： 40-41.

FEI L， YE C Y， JIANG J P. Colored atlas of Chinese amphibiansand their distributions［ M］. Chengdu： Sichuan Science and Tech?nology Press， 2012： 40-41.

［8］ ORLOV N L， DUTTA S K， GHATE H V， et al. New species ofTheloderma from Kon Tum Province （Vietnam） and NagalandState （India） ［Anura： Rhacophoridae］［J］. Russian Journal ofHerpetology， 2006， 132（2）： 135-154.

［9］ POYARKOV N A， Jr， ORLOV N L， MOISEEVA A V， et al.Sorting out moss frogs： mtDNA data on taxonomic diversity andphylogenetic relationships of the Indochinese species of the genusTheloderma（ Anura， Rhacophoridae）［J］. Russian Journal of Her?petology， 2015， 22（4）： 241-280.

［10］ KIM H J， HAN J， KIM B J， et al. New records of two deep-seaeels collected from the Western Pacific Ocean based on COI and 16S rRNA genes［J］. Molecular Biology Reports， 2021， 48（7）：5795-5801.

［11］ XIA Y， GU H F， PENG R， et al. COI is better than 16S rRNAfor DNA barcoding Asiatic salamanders （Amphibia： Caudata：Hynobiidae）［J］. Molecular Ecology Resources， 2012， 12（1）：48-56.

［12］ MCGINNIS S， MADDEN T L. BLAST： at the core of a powerfuland diverse set of sequence analysis tools［J］. Nucleic Acids Re?search， 2004， 32： W20-W25.

［13］ HALL T. BioEdit： an important software for molecular biology［J］. GERF Bulletin of Biosciences， 2011， 2（1）： 60-61.

［14］ ZHANG D， GAO F L， JAKOVLI I， et al. PhyloSuite： an inte?grated and scalable desktop platform for streamlined molecularsequence data management and evolutionary phylogenetics stud?ies［J］. Molecular Ecology Resources， 2020， 20（1）： 348-355.

［15］ RONQUIST F， TESLENKO M， VAN DER MARK P， et al.MrBayes 3. 2： efficient Bayesian phylogenetic inference andmodel choice across a large model space［J］. Systematic Biol?ogy， 2012， 61（3）： 539-542.

［16］ KUMAR S， STECHER G， LI M， et al. MEGA X： molecularevolutionary genetics analysis across computing platforms［J］.Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）： 1547-1549.

［17］ LIN B J， HUANG H Y， WEI Z H， et al. Isolation and character?ization of 25 polymorphic microsatellite loci from the Hynobiusmaoershanensis（ Caudata： Hynobiidae）［J］. Conservation Genet?ics Resources， 2015， 7（1）： 243-245.

［18］ CHEN C S， YANG J， WU Y K， et al. The breeding ecology of acritically endangered salamander， Hynobius amjiensis （Caudata：Hynobiidae）， endemic to eastern China［J］. Asian Herpetologi?cal Research， 2016， 7（1）： 53-58.

［19］ HOU W S， CHANG Y H， CHUANG T F， et al. Effect of eco?logical engineering design on biological motility and habitat envi?ronment of Hynobius arisanensis at high altitude areas in Taiwan［J］. Ecological Engineering， 2010， 36（6）： 791-798.

［20］ 米小其， 鄧學建， 郭克疾，等. 掛榜山小鯢早期胚胎發(fā)育初步觀察［J］. 四川動物， 2007， 26（2）： 377-378； I0007.MI X Q， DENG X J， GUO K J， et al. Early embryonic develop?ment of Hynobius guabangshanensis［J］. Sichuan Journal of Zool?ogy， 2007， 26（2）： 377-378； I0007.

［21］ HUANG H Y， LIN B J， GUO C， et al. The complete mitochon?drial genome of the Hynobius maoershanensis （Caudata： Hynobi?idae）［J］. Mitochondrial DNA， 2016， 27（1）： 173-174.

［22］ 黃華苑， 卜榮平， 謝海， 等. 貓兒山小鯢（ Hynobius maoersha?nensis）繁殖期生境選擇［J］. 生態(tài)學報， 2019， 39（17）： 6443-6451.

HUANG H Y， BU R P， XIE H， et al. Habitat selection byHynobius maoershanensis during its breeding period［J］. ActaEcologica Sinica， 2019， 39（17）： 6443-6451.

［23］ 牟禮忠. 蒼茫的越城嶺［J］. 廣西林業(yè)， 2011（10）： 36-38.MU L Z. The vast Yuecheng Ridge［J］. Guangxi Forestry， 2011（10）： 36-38.。

［24］ 蔣才云. 廣西5個自然保護區(qū)兩棲動物多樣性分析［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學， 2013， 40（18）： 153-154； 176.

JIANG C Y. Diversity of amphibian in 5 nature reserves inGuangxi［J］. Guangdong Agricultural Sciences， 2013， 40（18）：153-154； 176.

［25］ 萬雅瓊， 吳軍， 莫運明， 等. 廣西11種兩棲動物的分布及占域分析［J］. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學報， 2017， 33（3）： 281-287.

WAN Y Q， WU J， MO Y M， et al. Distribution and site occu?pancy analysis of 11 species of amphibians in Guangxi［J］. Jour?nal of Ecology and Rural Environment， 2017， 33（3）： 281-287.

［26］ 江建平， 謝鋒， 臧春鑫， 等. 中國兩棲動物受威脅現(xiàn)狀評估［J］. 生物多樣性， 2016， 24（5）： 588-597.

JIANG J P， XIE F， ZANG C X， et al. Assessing the threat sta?tus of amphibians in China［J］. Biodiversity Science， 2016， 24（5）： 588-597.

［27］ 王耕， 常暢， 韓冬雪， 等. 老鐵山自然保護區(qū)景觀格局與生境質(zhì)量時空變化［J］. 生態(tài)學報， 2020， 40（6）： 1910-1922.

WANG G， CHANG C， HAN D X， et al. Temporal-spatialchanges of landscape pattern and habitat quality in LaotieshanNature Reserve［J］. Acta Ecologica Sinica， 2020， 40（6）：1910-1922.

基金項目：國家自然科學基金項目（31860609）；廣西自然科學基金項目（2023GXNSFAA026501）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項目（2021KY0059）；廣西陸域生物多樣性保護優(yōu)先區(qū)域調(diào)查與評估（GXZC2022-G3-001173-JGJD）