收稿日期Received：2022-09-25""" 修回日期Accepted：2023-03-24

基金項(xiàng)目：河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（200KJCXZK-RW-5）；河北省科技計(jì)劃（21326304D-3）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2020301053）；河北省農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（2022KJCXZX-CGS-2）。

第一作者：張馨方（971470601@qq.com），副研究員。

*通信作者：王廣鵬（wangguangpeng430@163.com），研究員。

引文格式：

張馨方，王廣鵬，張樹(shù)航，等. 不同抗螨性板栗差異次生代謝物篩選與分析. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2024，48（2）：234-240.

ZHANG X F， WANG G P， ZHANG S H， et al. Screening and analysis of differential secondary metabolites in Castanea mollissima" with different levels of resistance to Oligonychus ununguis . Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），2024，48（2）：234-240.

DOI：10.12302/j.issn.1000-2006.202209053.

摘要：【目的】篩選分析抗螨性不同的板栗（Castanea mollissima）葉片中的差異次生代謝物，為抗螨機(jī)理解析與高抗螨板栗品種選育提供參考。【方法】以板栗品種‘燕興’（‘Yanxing’）和‘麗抗’（‘Likang’）為材料，采用田間調(diào)查法進(jìn)行抗螨性鑒定，確定‘燕興’和‘麗抗’對(duì)針葉小爪螨的抗性等級(jí)；利用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，通過(guò)差異倍數(shù)（fold change）和VIP（variable importance in projection）值相結(jié)合的方法篩選差異代謝物，使用R軟件ComplexHeatmap包和MetaboAnalystR包分別繪制聚類(lèi)熱圖和OPLS-DA得分圖；利用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋?zhuān)赐奉?lèi)型分類(lèi)?！窘Y(jié)果】‘麗抗’和‘燕興’對(duì)針葉小爪螨的抗性等級(jí)分別為1級(jí)（高抗）和7級(jí)（感）；兩品種共檢測(cè)到704個(gè)次生代謝物，篩選出差異代謝物165個(gè)，有73個(gè)代謝物在 ‘麗抗’中的含量顯著高于‘燕興’，有92個(gè)差異代謝物在‘麗抗’中的含量比‘燕興’低；差異代謝物種類(lèi)包括酚酸（56個(gè)）、黃酮（60個(gè)）、木質(zhì)素和香豆素（19個(gè)）、鞣質(zhì)（4個(gè)）、生物堿（5個(gè)）、萜類(lèi)（16個(gè)）和其他類(lèi)（5個(gè)），差異代謝物中黃酮和酚酸類(lèi)占比較高，分別為36%和34%；僅在‘麗抗’中檢測(cè)到的代謝物有7個(gè)，分別是咖啡酰膽、6′-O-反式肉桂酰-8-表金吉苷酸、落葉松脂素-4′-O-葡萄糖苷、阿爾本酚B、地榆素H11、3-羥基-5甲基苯酚-O-葡萄糖苷和苜蓿素-7-O-葡萄糖醛酸苷等；僅存在于‘燕興’中的代謝物有15個(gè)，包括4-甲基-5-噻唑乙醇、2，4-二羥基苯甲酸、異嗪皮啶、水楊苷、刺梨酸等?！嗯d’和‘麗抗’中有33個(gè)差異代謝物被注釋到12條通路上?！窘Y(jié)論】感螨品種‘燕興’和高抗品種‘麗抗’次生代謝譜存在差異，可能與板栗抗螨性相關(guān)的次生代謝物有櫻黃素、表沒(méi)食子兒茶素、咖啡酸、阿魏酸、幾種木質(zhì)素以及4-甲基-5-噻唑乙醇；‘燕興’和‘麗抗’的差異次生代謝物主要注釋和富集在黃酮、黃酮醇生物合成及類(lèi)黃酮生物合成通路。

關(guān)鍵詞：板栗；針葉小爪螨；抗螨性；次生代謝物

中圖分類(lèi)號(hào)：S718；S763.3""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

文章編號(hào)：1000-2006（2024）02-0234-07

Screening and analysis of differential secondary metabolites in Castanea mollissima with different levels of resistance to Oligonychus ununguis

ZHANG Xinfang， WANG Guangpeng*， ZHANG Shuhang， LI Ying， GUO Yan

（Changli Institute of Pomology， Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Changli 066600， China）

Abstract： 【Objective】The differential secondary metabolites in chestnut （Castanea mollissima） leaves with different mite resistance levels were screened to provide a reference for the analysis of the mite（Oligonychus ununguis） resistance mechanism and the breeding of highly mite-resistant chestnut varieties.【Method】The chestnut varieties ‘Yanxing’ and ‘Likang’ were used to identify and determine the mite resistance levels to O. ununguis with the field investigation method. Metabolomics detection was performed using ultra-high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry， and the differential metabolites were screened using a combination of fold change and the variable importance in projection value. The R software （ComplexHeatmap and MetaboAnalystR package） was used to draw the clustering heat map and orthogonal partial least squares-discriminant analysis score map. Identified metabolites were annotated using the Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） database， and the annotation results were classified by pathway types.【Result】The resistance levels of ‘Likang’ and ‘Yanxing’ to O. ununguis were high resistance and susceptible， respectively. A total of 704 secondary metabolites were detected， including 165 differential metabolites. The content of 73 metabolites in ‘Likang’ was significantly higher than in ‘Yanxing’， and the content of 92 metabolites was lower in ‘Likang’ than in ‘Yanxing’. The types of differential metabolites included 56 phenolic acids， 60 flavonoids， 19 lignins and coumarins， four tannins， five alkaloids， 16 terpenoids and five other types. Flavonoids and phenolic acids accounted for 36% and 34%， respectively. Metabolites present only in ‘Likang’ included caffeoylcholine-4-O-glucoside， 3-hydroxy-5-methylphenol-1-O-（6′-galloyl）glucoside， tricin-7-O-glucuronide， 6′-trans-cinnamoyl-8-epikingisidic acid， lariciresinol-4′-O-glucoside， albanol B and sanguiin H11. There were 15 metabolites present only in ‘Yanxing’， including 4-methyl-5-thiazoleethanol， 2，4-dihydroxybenzoic acid， isofraxidin， salicin and roxburic acid. Thirty-three differential metabolites in ‘Yanxing’ and ‘Likang’ were annotated to 12 metabolic pathways.【Conclusion】 The secondary metabolic profiles between the mite-susceptible variety ‘Yanxing’ and the highly resistant variety ‘Likang’ differed. Secondary metabolites that may be related to chestnut mite resistance were prunetin， epigallocatechin， caffeic acid， ferulic acid， several lignans and 4-methyl-5-thiazoleethanol. The differential secondary metabolites were mainly annotated and enriched in the flavonoid biosynthesis pathway and the flavone and flavonol biosynthesis pathway.

Keywords：Castanea mollissima； Oligonychus ununguis；mite resistance；secondary metabolites

板栗（Castanea mollissima）為中國(guó)馴化利用最早的果樹(shù)之一，果實(shí)香甜糯俱佳，植株抗逆、耐瘠薄性強(qiáng)，在山區(qū)栽培分布極廣，也是我國(guó)現(xiàn)階段為數(shù)不多的具有出口優(yōu)勢(shì)的樹(shù)種之一。針葉小爪螨（Oligonychus ununguis）隸屬于葉螨科（Tetranychidae）小爪螨屬（Oligonychus），又名栗紅蜘蛛，是板栗生產(chǎn)上最主要的蟲(chóng)害之一。該蟲(chóng)多集中在葉片正面吸食汁液，造成葉片失綠、呈現(xiàn)灰白色枯斑，甚至全葉變褐干枯失去正常生理功能，嚴(yán)重影響板栗的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前生產(chǎn)上對(duì)針葉小爪螨的防治仍以化學(xué)藥劑為主，易造成環(huán)境污染，且殺傷天敵昆蟲(chóng)，不利于綠色生產(chǎn)。選育和應(yīng)用抗螨性強(qiáng)的板栗品種是從根本上預(yù)防和控制針葉小爪螨為害的有效措施。

抗蟲(chóng)性是植物與昆蟲(chóng)協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成的遺傳特性，明確植株抗蟲(chóng)性是蟲(chóng)害有效治理策略中的重要環(huán)節(jié)。代謝組學(xué)以代謝產(chǎn)物為研究對(duì)象，對(duì)植物特定組織中的整體代謝水平進(jìn)行比較，全面、高效而準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于植物的品質(zhì)鑒定、生理代謝、功能成分挖掘及抗性種質(zhì)篩選等領(lǐng)域。近年來(lái)，植物次生代謝物在抗蟲(chóng)性方面的研究備受關(guān)注，證實(shí)其對(duì)植食性昆蟲(chóng)具有引誘、驅(qū)避、毒殺、拒食等作用。目前已知與抗蟲(chóng)性有關(guān)的主要次生物質(zhì)有15 000多種。李菁等發(fā)現(xiàn)萜烯類(lèi)植物揮發(fā)物對(duì)舞毒蛾（Lymantria dispar）成蟲(chóng)具有良好的誘集效果；左彤彤等研究發(fā)現(xiàn)不同品系楊樹(shù)中的咖啡酸、肉桂酸和丁香酸對(duì)青楊脊虎天牛（Xylotrechus rusticus）有明顯驅(qū)避效果；楊振德等研究證實(shí)苦豆子生物堿及其單體對(duì)柳藍(lán)葉甲（Plagiodera versicolora）具有較強(qiáng)的拒食作用。

目前，關(guān)于抗螨板栗品種已有報(bào)道，亦證實(shí)了不同品種對(duì)針葉小爪螨的抗性有顯著差異。雷恒久等通過(guò)研究板栗葉片的形態(tài)特征和組織結(jié)構(gòu)，從物理防御層面初探了板栗對(duì)針葉小爪螨的抗性機(jī)制。但整體來(lái)說(shuō)業(yè)界對(duì)于板栗抗螨性機(jī)制的研究極少，而基于代謝組學(xué)層面的板栗抗螨機(jī)制研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究選取生產(chǎn)實(shí)踐上對(duì)針葉小爪螨抗性有顯著差異的2個(gè)代表性品種，首先進(jìn)行抗螨性驗(yàn)證，再通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)解析2個(gè)品種之間的次生代謝物差異，從而為板栗抗螨機(jī)理解析和高抗螨品種培育提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

以多年生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)的抗螨板栗品種‘麗抗’（‘Likang’）和感螨板栗品種‘燕興’（‘Yanxing’）為材料，試材取自河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹(shù)研究所板栗品種比較園（119°15′E， 39°72′N(xiāo)），砧木、樹(shù)齡及栽培管理措施一致。試驗(yàn)地屬中國(guó)東部季風(fēng)區(qū)暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性氣候，年均氣溫12.2" ℃，年均降水量643 mm，年均日照2 663.7 h，海拔20 m，砂壤土。2021年8月，同品種隨機(jī)選取生長(zhǎng)勢(shì)基本一致健康樹(shù)3株，取每株樹(shù)冠外圍營(yíng)養(yǎng)枝上20片葉混合在一起為1次生物學(xué)重復(fù)，做3次重復(fù)。葉片用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后即刻清除昆蟲(chóng)等雜質(zhì)，液氮速凍后置于-80" ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2" 抗螨性指標(biāo)測(cè)定

參考《板栗種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì)針葉小爪螨的抗螨性鑒定采用田間調(diào)查法。每品種選取生長(zhǎng)勢(shì)基本一致的健康樹(shù)體10株，其中5株為調(diào)查樹(shù)，5株為對(duì)照樹(shù)，調(diào)查樹(shù)與對(duì)照樹(shù)相距12 m左右，中間設(shè)兩列植株作為保護(hù)行、保護(hù)株隔離。調(diào)查樹(shù)在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)不進(jìn)行病蟲(chóng)害防治，對(duì)照樹(shù)根據(jù)針葉小爪螨發(fā)生時(shí)期，葉面噴施稀釋1 000倍螨死凈（杭州慶豐農(nóng)化有限公司）控制害螨數(shù)量，達(dá)到有蟲(chóng)不成災(zāi)。2021年8月初調(diào)查針葉小爪螨為害情況，每株樹(shù)隨機(jī)調(diào)查營(yíng)養(yǎng)枝50片葉的失綠面積，葉片失綠面積共分為5級(jí)，劃分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

根據(jù)失綠等級(jí)計(jì)算失綠指數(shù)，計(jì)算公式為：

I = ∑（x×n）X×N×100%。

式中：I為失綠指數(shù)；x為失綠等級(jí)代表值；n為對(duì)應(yīng)失綠等級(jí)的葉片數(shù)；X為最高失綠等級(jí)代表值；N為總?cè)~片數(shù)。板栗對(duì)針葉小爪螨的抗性等級(jí)分為：1級(jí)，高抗（I＜15%）；3級(jí)，抗（15%≤I＜25%）；5級(jí)，中抗（25%≤I＜35%）；7級(jí)，感（35%≤I＜60%）；9級(jí)，高感（I≥60%）。

1.3" 次生代謝物檢測(cè)

將樣品置于凍干機(jī)（Scientz-100F，寧波新芝）進(jìn)行真空冷凍干燥，剪碎后再利用研磨儀（MM 400，Retsch，德國(guó)）在30 Hz條件下研磨1.5 min；稱(chēng)取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中，于4 ℃冰箱過(guò)夜，其間渦旋混勻；之后以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用孔徑0.22 μm的微孔濾膜（SCAA-104，ANPEL公司，上海）過(guò)濾，濾液用于超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析（UPLC，Exera X2，SHIMADZUN，日本；MS，QTRAP 4500，SCIEX，美國(guó)）。次生代謝組學(xué)檢測(cè)由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。

基于邁維自建數(shù)據(jù)庫(kù)（Metware database），根據(jù)二級(jí)譜信息進(jìn)行物質(zhì)定性，代謝物定量則利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring）分析完成。

1.4" 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，分別使用R 2.8.0 ComplexHeatmap包和R 1.0.1 MetaboAnalystR包繪制聚類(lèi)熱圖和OPLS-DA得分圖。利用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋?zhuān)瑢?duì)注釋結(jié)果按照KEGG通路類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)，利用R 3.5.1 barplot軟件包繪制KEGG分類(lèi)圖。

1.5" 差異代謝物篩選

基于OPLS-DA得分結(jié)果，從獲得的多變量分析OPLS-DA模型的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP），初步篩選差異代謝物，同時(shí)結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）值來(lái)進(jìn)一步篩選出差異代謝物。代謝物應(yīng)滿足FC值≥2.0或FC值≤0.5，同時(shí)VIP值≥1.0才被認(rèn)定是差異代謝物。

2" 結(jié)果與分析

2.1" ‘燕興’和‘麗抗’的抗螨性鑒定

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，板栗‘燕興’和‘麗抗’調(diào)查樹(shù)的失綠指數(shù)均顯著高于對(duì)照樹(shù)，‘麗抗’的失綠指數(shù)為13.75%，‘燕興’的失綠指數(shù)為46.96%，表明品種‘麗抗’ 和‘燕興’ 對(duì)針葉小爪螨的抗性等級(jí)分別為高抗（1級(jí)）和感（7級(jí)）。

2.2" 次生代謝組輪廓及主成分分析

對(duì)‘燕興’和‘麗抗’的葉片進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，共得到704個(gè)次生代謝物，包括酚酸（217個(gè)）、黃酮（245個(gè)）、木質(zhì)素和香豆素（48個(gè)）、鞣質(zhì)（42個(gè)）、生物堿（56個(gè)）、萜類(lèi)（72個(gè)）、甾體（1個(gè)）和其他類(lèi)（23個(gè)）。

在主成分分析中，第1主成分的貢獻(xiàn)率為65.58%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為9.42%，2種主成分貢獻(xiàn)率之和為75%，表明2種主成分能夠反映‘燕興’和‘麗抗’的主要特征信息。

2.3" 次生代謝物聚類(lèi)熱圖分析

不同樣品中代謝物的積累模式差異可以通過(guò)聚類(lèi)熱圖（圖1）進(jìn)行分析。由圖1可知，次生代謝物在不同組間有明顯差異，可分為3簇。左側(cè)實(shí)線方框內(nèi)的代謝物在‘燕興’中含量較高，而在‘麗抗’中含量較低；虛線方框內(nèi)的代謝物在‘麗抗’中含量較高，在‘燕興’中含量較低；右側(cè)實(shí)線方框內(nèi)的代謝物在兩個(gè)品種中均有分布，說(shuō)明‘燕興’和‘麗抗’中的次生代謝物種類(lèi)和含量具有明顯差異。此外，不同的生物學(xué)重復(fù)之間也同樣聚成一簇，表明生物學(xué)重復(fù)之間具有良好同質(zhì)性和數(shù)據(jù)的高可靠性。

2.4" 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

OPLS-DA分析是一種有監(jiān)督模式識(shí)別的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠剔除與研究無(wú)關(guān)的影響因子從而篩選差異代謝物。分析結(jié)果（圖2）可知，R2X=0.746；說(shuō)明該模型對(duì)自變量X的解釋程度為74.6%；R2Y=1.000，說(shuō)明該模型對(duì)分類(lèi)變量Y的解釋程度為100%；Q2=0.985，表示該模型對(duì)樣本變量的預(yù)測(cè)程度為98.5%，比較組的Q2值高于0.9，說(shuō)明構(gòu)建的模型合適可靠且預(yù)測(cè)程度高。OPLS-DA得分圖顯示，‘燕興’和‘麗抗’發(fā)生明顯分離。

2.5" 差異次生代謝物火山圖

以FC值≥2.0或≤0.5，結(jié)合OPLS-DA模型中VIP值≥1.0篩選差異代謝物，見(jiàn)圖3。在圖3中，橫坐標(biāo)絕對(duì)值越大，表明該物質(zhì)在兩品種間相對(duì)含量差異越大；縱坐標(biāo)絕對(duì)值越大，表明差異越顯著，篩選到的代謝物越可靠。共篩選出165個(gè)差異代謝物，其中有73個(gè)代謝物表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明有73個(gè)代謝物在‘麗抗’中的含量高于‘燕興’；有92個(gè)代謝物表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明有92個(gè)次生代謝物在‘麗抗’中的含量比‘燕興’中低。165個(gè)差異代謝物包括56個(gè)酚酸、60個(gè)黃酮、19個(gè)木質(zhì)素和香豆素、4個(gè)鞣質(zhì)、5個(gè)生物堿、16個(gè)萜類(lèi)和5個(gè)其他類(lèi)。差異代謝物中黃酮和酚酸類(lèi)占比較高，分別為36%和34%，生物堿、鞣質(zhì)和其他類(lèi)占比較低，分別為3%、2%和3%，木質(zhì)素和香豆素以及萜類(lèi)分別占12%和10%。

2.6" 差異代謝物KEGG通路分類(lèi)結(jié)果

將篩選出的差異代謝物匹配KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)從而獲得代謝物參與的通路信息。板栗‘燕興’和‘麗抗’中有33個(gè)差異代謝物被注釋到12條通路上（圖4），包括苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、花青素生物合成（anthocyanin biosynthesis）、類(lèi)黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇生物合成（flavone and flavonol biosynthesis）等通路。其中注釋到代謝通路（metabolic pathways）和次生代謝物合成通路（biosynthesis of" secondary metabolites）的差異代謝物個(gè)數(shù)較多。

2.7" 差異次生代謝物分析

板栗‘燕興’和‘麗抗’共篩選出165個(gè)差異次生代謝物。僅在‘麗抗’中檢測(cè)到的代謝物有7個(gè)，包括咖啡酰膽、6′-O-反式肉桂酰-8-表金吉苷酸、落葉松脂素-4′-O-葡萄糖苷、阿爾本酚B、地榆素H11、3-羥基-5甲基苯酚-1-O-葡萄糖苷和苜蓿素-7-O-葡萄糖醛酸苷等；僅存在于‘燕興’中的代謝物有15個(gè)，包括4-甲基-5-噻唑乙醇、2，4-二羥基苯甲酸、異嗪皮啶、水楊苷、刺梨酸等。

在‘燕興’和‘麗抗’中共篩選出60種黃酮類(lèi)物質(zhì)存在顯著差異，包括查耳酮、二氫黃酮醇、花青素、黃酮、黃酮醇、黃酮碳糖苷、黃烷醇和異黃酮等。其中，‘燕興’中有30種黃酮類(lèi)物質(zhì)含量高于‘麗抗’，差異最大的是3-O-甲基槲皮素，‘燕興’含量是‘麗抗’的7.33×103倍。在‘麗抗’中有30種黃酮類(lèi)物質(zhì)含量高于‘燕興’，包括槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、山柰酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷等，差異最大的是苜蓿素-7-O-葡萄糖醛酸苷，在‘麗抗’中含量是‘燕興’的3.44×103倍。兩份材料共篩選出包括咖啡酸、阿魏酸等56種酚酸類(lèi)物質(zhì)差異表達(dá)，其中‘燕興’中有30種酚酸類(lèi)物質(zhì)含量高于‘麗抗’，差異最大的是1-O-對(duì)香豆?？鼘幩幔凇嗯d’中含量是‘麗抗’的1.15×107倍。在‘麗抗’中有26種酚酸類(lèi)物質(zhì)含量高于‘燕興’，差異最大的是3-羥基-5-甲基苯酚-1-O-（6′-沒(méi)食子酰）葡萄糖苷。

‘燕興’和‘麗抗’中共有14種木質(zhì)素和5種香豆素存在顯著差異。其中，在‘麗抗’中有8種木質(zhì)素和1種香豆素含量高于‘燕興’，‘燕興’中有10種木質(zhì)素和香豆素含量高于‘麗抗’，其中包括秦皮乙素、異莨菪亭、去氫二異丁香酚等活性物質(zhì)。有16種萜類(lèi)在‘燕興’和‘麗抗’中存在顯著差異，‘麗抗’中有3種萜類(lèi)物質(zhì)含量高于‘燕興’，分別為桃葉珊瑚苷、乙酰梓醇、2α，3α，19α-三羥基熊果酸，‘燕興’中有13種萜類(lèi)物質(zhì)含量高于‘麗抗’。在其他類(lèi)中，只有物質(zhì)Solatuberenol A在‘麗抗’中的含量高于‘燕興’，包括4-甲基-5-噻唑乙醇在內(nèi)的其余4種物質(zhì)在‘燕興’中的含量高于‘麗抗’。

3" 討" 論

針葉小爪螨發(fā)育歷期短、為害寄主范圍廣泛，在我國(guó)板栗產(chǎn)區(qū)已成為生產(chǎn)上最主要的蟲(chóng)害。如何利用板栗抗螨性進(jìn)行害螨防治，并培育抗螨新品種，解析板栗次生代謝物構(gòu)成是第一步。次生代謝物是植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)的結(jié)果。由于植物本身不能移動(dòng)，在進(jìn)化過(guò)程中就不得不依賴次生物質(zhì)來(lái)減輕昆蟲(chóng)或疾病造成的危害，這也是次生代謝物最原始、最主要的生態(tài)功能。

本研究在板栗品種‘燕興’和‘麗抗’中共檢測(cè)到704個(gè)次生代謝物，其中黃酮類(lèi)和酚酸類(lèi)包括的次生代謝物數(shù)量最多，這兩類(lèi)物質(zhì)也是篩選出的差異代謝物中占比較高的。前人研究表明，黃酮類(lèi)物質(zhì)有助于提高植物的抗逆性。比如，大豆（Glycine max）中異黃酮含量的增加提高了其對(duì)大豆花葉病毒的抗性；水稻（Oryza sativa）中的櫻黃素對(duì)真菌病原體有效，柚皮素對(duì)細(xì)菌病原體更有效；沒(méi)食子兒茶素參與類(lèi)黃酮生物合成及植物防御反應(yīng)；類(lèi)黃酮物質(zhì)積累可以提高水稻抗褐飛虱（Nilaparvata lugens）的能力。本研究也篩選出了櫻黃素、表沒(méi)食子兒茶素等黃酮類(lèi)差異物質(zhì)。此外，槲皮素-3-O-洋槐糖苷、蘆丁、山柰酚-3-O-洋槐糖苷、山柰酚-3-葡萄糖鼠李糖苷等這些黃酮醇類(lèi)物質(zhì)在高抗螨品種中的含量顯著高于感螨品種，推測(cè)櫻黃素、表沒(méi)食子兒茶素以及這幾種黃酮醇類(lèi)物質(zhì)可能參與板栗葉片抵御針葉小爪螨為害，可能是板栗葉片產(chǎn)生抗蟲(chóng)性的生理基礎(chǔ)。另外，已有報(bào)道證實(shí)咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸等酚酸物質(zhì)參與大豆抵御核盤(pán)菌侵染，咖啡酸、肉桂酸、丁香酸對(duì)楊樹(shù)天牛（Xylotrechus rusticus）也有明顯的驅(qū)避效果。本次研究發(fā)現(xiàn)咖啡酸和阿魏酸在‘麗抗’和‘燕興’中含量具有顯著差異，推測(cè)其也可能是導(dǎo)致葉片產(chǎn)生抗螨性的生理因子。

此外，還有一些其他類(lèi)差異代謝物值得關(guān)注。4-甲基-5-噻唑乙醇在‘燕興’中的含量顯著高于‘麗抗’，以往研究表明這種物質(zhì)是一種具有特殊香味的香料，針葉小爪螨可能對(duì)這種特殊香味具有偏好而傾向選擇此種物質(zhì)含量更高的感螨品種。因此，不同品種在抗螨性表現(xiàn)出的差異，從次生物質(zhì)構(gòu)成方面分析原因，除了抗螨品種可能含有對(duì)昆蟲(chóng)具有驅(qū)避或拒食功效的某些活性物質(zhì)外，也有可能是感螨品種具有某種含量更豐富的對(duì)昆蟲(chóng)具有引誘作用的物質(zhì)。

本研究首次解析了板栗葉片中次生代謝物的構(gòu)成，并比較分析了對(duì)針葉小爪螨抗性不同的板栗葉片中差異代謝物的類(lèi)型，為篩選抗螨活性物質(zhì)、選育抗螨板栗新品種提供了參考。然而，植物中的初生代謝物和次生代謝物數(shù)量龐大，可達(dá)20萬(wàn)至100萬(wàn)種。任何單一的平臺(tái)都不能檢測(cè)到所有的代謝物信息，因此未來(lái)可以利用多個(gè)檢測(cè)平臺(tái)獲取更全面的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，同時(shí)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)挖掘主要代謝途徑及關(guān)鍵調(diào)控因子，逐步解析板栗對(duì)針葉小爪螨抗性差異的遺傳基礎(chǔ)，為選育抗螨板栗新品種提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)（reference）：

［1］溫素卿．燕山地區(qū)板栗針葉小爪螨的重發(fā)原因分析及綜合防治．河北果樹(shù)，2021（2）：50-52．WEN S Q．Cause analysis and comprehensive control of the recurrence of Tetranychus viennensis in chestnut in Yanshan area．Hebei Fruits，2021（2）：50-52．DOI： 10.19440/j.cnki.1006-9402.2021.02.030.

［2］張文輝，劉光杰．植物抗蟲(chóng)性次生物質(zhì)的研究概況．植物學(xué)通報(bào)，2003，20（5）：522-530．ZHANG W H，LIU G J．A review on plant secondary substances in plant resistance to insect pests．Chin Bull Bot，2003，20（5）：522-530．

［3］NICHOLSON J K，LINDON J C．Metabonomics．Nature，2008，455（7216）：1054-1056．DOI： 10.1038/4551054a.

［4］袁平麗，何楠，趙勝杰，等．籽瓜、黏籽和普通西瓜的果實(shí)代謝組比較．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，54（19）：4179-4195．YUAN P L，HE N，ZHAO S J，et al．Metabolomics comparative study on fruits of edible seed watermelon，egusi and common watermelon．Sci Agric Sin，2021，54（19）：4179-4195．DOI： 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.013.

［5］CHEN W，GONG L，GUO Z L，et al．A novel integrated method for large-scale detection，identification，and quantification of widely targeted metabolites：application in the study of rice metabolomics．Mol Plant，2013，6（6）：1769-1780．DOI： 10.1093/mp/sst080.

［6］TRIPODI P，CARDI T，BIANCHI G，et al．Genetic and environmental factors underlying variation in yield performance and bioactive compound content of hot pepper varieties （Capsicum annuum） cultivated in two contrasting Italian locations．Eur Food Res Technol，2018，244（9）：1555-1567．DOI： 10.1007/s00217-018-3069-5.

［7］王景順，吳秋芳，路志芳．植物次生代謝物與林木抗蟲(chóng)性研究進(jìn)展．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（8）：4-7．WANG J S，WU Q F，LU Z F．Research progress on plant secondary metabolites and insect resistance of forest trees．J Jiangsu Agric Sci，2015，43（8）：4-7．DOI： 10.15889/j.issn.1002-1302.2015.08.002.

［8］軒?kù)o淵，王輔．植物抗蟲(chóng)性概論．成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1991．XUAN J Y，WANG F．Introduction to plant insect resis-tance．Chengdu：Sichuan Scientific amp; Technical Publishers，1991．

［9］李菁，駱有慶，石娟，等．利用植物源引誘劑監(jiān)測(cè)與控制舞毒蛾．北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（4）：85-90．LI J，LUO Y Q，SHI J，et al．Use of phyto-attractant in monitoring and controlling gypsy moth．J Beijing For Univ，2011，33（4）：85-90．DOI： 10.13332/j.1000-1522.2011.04.010.

左彤彤，遲德富，王牧原，等．不同品系楊樹(shù)酚酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)青楊脊虎天牛的驅(qū)避作用．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35（2）：160-164．ZUO T T，CHI D F，WANG M Y，et al．Repellent effects of phenolic acids in different strain poplars to Xylotrechus rusticus．J Plant Prot，2008，35（2）：160-164．DOI： 10.3321/j.issn：0577-7518.2008.02.013.

楊振德，趙博光．苦豆子生物堿對(duì)柳藍(lán)葉甲產(chǎn)卵行為的影響．林業(yè)科學(xué)，2013，49（1）：152-160．YANG Z D，ZHAO B G．Effects of alkaloids from Sophora alopecuroides on oviposition behavior of Plagiodera versicolora．Sci Silvae Sin，2013，49（1）：152-160．DOI： 10.11707/j.1001-7488.20130122.

欒風(fēng)福，劉玉剛，魯剛，等．板栗新品種麗抗的選育．中國(guó)果樹(shù)，2003（4）：1-2． LUAN F F，LIU Y G，LU G，et al．Breeding of a new chestnut variety ‘Likang’．China Fruits，2003（4）：1-2．DOI： 10.16626/j.cnki.issn1000-8047.2003.04.001.

張繼亮，馬玉敏，孫海偉，等．栗紅蜘蛛對(duì)板栗不同品種的危害調(diào)查．落葉果樹(shù)，2004，36（5）：50-51．ZHANG J L，MA Y M，SUN H W，et al．Investigation on damage of chestnut red mite to different chestnut varieties．Deciduous Fruits，2004，36（5）：50-51．DOI： 10.13855/j.cnki.lygs.2004.05.027.

雷恒久，蘇淑釵，張海成．板栗對(duì)板栗紅蜘蛛和桃蛀螟的抗性機(jī)制初探．河北林果研究，2009，24（1）：73-76．LEI H J，SU S C，ZHANG H C．A preliminary study on the resistance mechanism of chestnut to Oligonychus ununguis（Jacobi） and Dichocrocis punctiferalis Guenee．Hebei J For Orchard Res，2009，24（1）：73-76．DOI： 10.3969/j.issn.1007-4961.2009.01.020.

劉慶忠，孫山，張力思，等．板栗種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：67-68．LIU Q Z，SUN S，ZHANG L S，et al．Descriptors and data standard for chestnut （Castanea mollissima Blume）．Beijing：China Agriculture Press，2006：67-68．

焦蕊，許長(zhǎng)新，于麗辰，等．針葉小爪螨的研究進(jìn)展．河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，17（1）：61-64．JIAO R，XU C X，YU L C，et al．Research progress of Oligonychus ununguis Jacobi．J Hebei Agric Sci，2013，17（1）：61-64．DOI： 10.16318/j.cnki.hbnykx.2013.01.008.

ZHANG P P，DU H Y，WANG J，et al．Multiplex CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering increases soyabean isoflavone content and resistance to soya bean mosaic virus．Plant Biotechnol J，2020，18（6）：1384-1395．DOI： 10.1111/pbi.13302.

MURATA K，KITANO T，YOSHIMOTO R，et al．Natural variation in the expression and catalytic activity of a naringenin 7-O-methy-ltransferase influences antifungal defenses in diverse rice cultivars．Plant J，2020，101（5）：1103-1117．DOI： 10.1111/tpj.14577.

SEYBOLD H，DEMETROWITSCH T J，HASSANI M A，et al．A fungal pathogen induces systemic susceptibility and systemic shifts in wheat metabolome and microbiome composition．Nat Commun，2020，11（1）：1910．DOI： 10.1038/s41467-020-15633-x.

DAI Z Y，TAN J，ZHOU C，et al．The OsmiR396-OsGRF8-OsF3H-flavonoid pathway mediates resistance to the brown planthopper in rice （Oryza sativa）．Plant Biotechnol J，2019，17（8）：1657-1669．DOI： 10.1111/pbi.13091.

RANJAN A，WESTRICK N M，JAIN S，et al．Resistance against Sclerotinia sclerotiorum in soybean involves a reprogramming of the phenylpropanoid pathway and up-regulation of antifungal activity targeting ergosterol biosynthesis．Plant Biotechnol J，2019，17（8）：1567-1581．DOI： 10.1111/pbi.13082.

李樹(shù)安．肉香型香料4-甲基-5-噻唑乙醇的合成．精細(xì)化工，2005，22（7）：521-523．LI S A．Synthesis of meat flavor perfume 4-methyl-5-thiazoleethanol．Fine Chem，2005，22（7）：521-523．DOI： 10.3321/j.issn：1003-5214.2005.07.011.

劉玲玲，武彥文，袁亞榮，等．雞味脂肪香精的制備、香氣成分分析和抗氧化性研究．食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（10）：107-111．LIU L L，WU Y W，YUAN Y R，et al．The preparation，aromatic components analysis and antioxidation activity of chicken fat flavor．Food Ferment Ind，2010，36（10）：107-111．DOI： 10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2010.10.025.

FANG C Y，F(xiàn)ERNIE A R，LUO J．Exploring the diversity of plant metabolism．Trends Plant Sci，2019，24（1）：83-98．DOI： 10.1016/j.tplants.2018.09.006.

WANG S C，ALSEEKH S，F(xiàn)ERNIE A R，et al．The structure and function of major plant metabolite modifications．Mol Plant，2019，12（7）：899-919．DOI： 10.1016/j.molp.2019.06.001.

（責(zé)任編輯" 王國(guó)棟）