宋曉兵 黃峰 湯亞飛 崔一平 凌金鋒 陳霞

摘要

2022年首次在廣州市發(fā)現(xiàn)園林植物雪花木小葉病病株，采用分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行植原體的種類鑒定。以雪花木葉片總DNA為模板，利用植原體16S?rRNA通用引物P1/P7進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得廣東雪花木小葉病植原體（BLLGD2022）16S?rRNA基因片段（1?811?bp，GenBank登錄號為OQ625536）。16S?rRNA序列相似性顯示，BLLGD2022與16SrVI組植原體株系的相似性最高，為97.05%～99.83%，其中與隸屬于16SrVID亞組的10個(gè)植原體株系相似性為99.21%～99.83%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，BLLGD2022與16SrVI組各植原體株系聚類在一個(gè)大分支，其中與16SrVID亞組成員聚類在一個(gè)小分支，親緣關(guān)系最近?；?6S?rRNA序列的iPhyClassifier限制性內(nèi)切酶虛擬RFLP分析表明，BLLGD2022與16SrVID亞組的參考株系Brinjal?little?leaf?phytoplasma?（GenBank登錄號為X83431）的酶切圖譜一致，相似系數(shù)為1.00?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，明確廣州市雪花木小葉病植原體隸屬16SrVID亞組成員。本研究首次在園林植物雪花木上檢測到植原體，通過16S?rRNA序列分析明確為16SrVID亞組成員，為開展16SrVID亞組植原體在蔬菜、花卉和園林植物的發(fā)生監(jiān)測及病害防控提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞

雪花木小葉病;?植原體;?16S?rRNA;?分子鑒定

中圖分類號：

S?436.85

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023159

First?report?of?little?leaf?disease?caused?by?phytoplasma?on?Breynia?disticha?in?China

SONG?Xiaobing*，?HUANG?Feng，?TANG?Yafei，?CUI?Yiping，?LING?Jinfeng，?CHEN?Xia

（Institute?of?Plant?Protection，?Guangdong?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Green?Prevention

and?Control?on?Fruits?and?Vegetables?in?South?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Guangdong?Provincial

Key?Laboratory?of?High?Technology?for?Plant?Protection，?Guangzhou?510640，?China）

Abstract

In?2022，?the?garden?plant?Breynia?disticha?exhibiting?little?leaf?symptom?was?firstly?observed?in?Guangzhou.?The?related?phytoplasma?was?identified?using?molecular?technology.?The?16S?rRNA?fragment?（1?811?bp，?GenBank?accession?no.OQ625536）?of?phytoplasma?associated?with?Breynia?disticha?little?leaf?disease?in?Guangdong?province?（BLLGD2022）?was?amplified?from?total?DNA?of?diseased?plants?using?universal?primers?P1/P7.?Sequence?similarity?analysis?based?on?16S?rRNA?sequence?showed?that?BLLGD2022?shared?the?higher?similarity?with?16SrVI?group?phytoplasma?strains，?which?was?97.05%-99.83%，?and?the?highest?similarity?（99.21%?to?99.83%）?with?10?phytoplasma?strains?belonging?to?the?16SrVID?subgroup.?Phylogenetic?analyses?showed?that?BLLGD2022?clustered?with?the?16SrVI?group?phytoplasmas?in?a?large?branch?and?with?the?16SrVID?subgroup?phytoplasmas?in?a?small?branch.?This?result?revealed?that?BLLGD2022?had?the?closest?genetic?relationship?to?the?16SrVID?subgroup?phytoplasmas.?Based?on?the?16S?rRNA?sequence，?virtual?restriction?fragment?length?polymorphism?analysis?using?iPhyClassifier?revealed?that?BLLGD2022?and?the?reference?strain?Brinjal?little?leaf?phytoplasma?（GenBank?Registration?no.X83431）?of?the?16S?rVID?subgroup?were?consistent，?with?a?similarity?coefficient?of?1.00.?Based?on?the?above?results，?the?phytoplasma?of?Breynia?disticha?little?leaf?disease?in?Guangzhou?is?a?strain?of?16SrVID?subgroup.?Phytoplasma?was?detected?firstly?on?the?garden?plant?B.disticha，?and?BLLGD2022?was?identified?to?belong?to?the?16SrVID?subgroup.?The?result?provides?scientific?basis?for?monitoring?the?occurrence?and?disease?prevention?and?control?of?16SrVID?subgroup?phytoplasma?in?vegetables，?flowers?and?garden?plants.

Key?words

Breynia?disticha?little?leaf?disease;?phytoplasma;?16S?rRNA;?molecular?identification

植原體（phytoplasma）原稱類菌原體，為專性寄生于昆蟲和植物韌皮部細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌［1］。植原體無細(xì)胞壁，屬細(xì)菌界Bacteria柔膜菌綱Mollicutes植原體暫定屬Candidatus?genus?Phytoplasma［2］，主要通過取食韌皮部的刺吸式口器昆蟲以持續(xù)增殖的方式傳播。植原體在世界范圍內(nèi)引起98科1?000多種植物發(fā)?。?4］，常引起植株表現(xiàn)叢枝、畸形、花變?nèi)~、小葉、黃化等典型癥狀，嚴(yán)重影響世界各地的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)［57］。由于植原體迄今還不能在人工培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，目前主要依據(jù)其16S?rRNA序列差異，以及rp、secY等保守基因序列、媒介昆蟲、天然植物寄主等進(jìn)行鑒定與分類［8］。植原體暫定屬下的分類單元有種（species）、組（group）和亞組（subgroup），截至2019年6月，已鑒定命名的植原體種共有52個(gè)，歸屬34個(gè)組［9］。

雪花木Breynia?disticha，為葉下珠科（原大戟科）黑面神屬Breynia常綠灌木，葉色鮮明，葉緣有白色斑點(diǎn)或乳白色斑紋，同一植株有綠白兩色葉，又稱彩葉山漆莖，起源于玻利維亞，喜高溫，能適應(yīng)我國南方省市栽培。雪花木是一種常綠彩葉植物，具有較高的觀賞價(jià)值，在現(xiàn)代園林建設(shè)中越來越受到重視［1011］，在我國嶺南地區(qū)作為園林植物廣泛栽培。2022年，在廣東省廣州市天河區(qū)市政綠化道發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為小葉、節(jié)間縮短、葉片聚生等癥狀的雪花木小葉病病株，疑似由植原體侵染所導(dǎo)致。本文采用分子生物學(xué)方法，對疑似病樣進(jìn)行檢測，進(jìn)一步對相關(guān)植原體的16S?rRNA進(jìn)行克隆和序列分析，明確其分類地位，為防治該病害提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料和試劑

雪花木小葉病的病樣于2022年9月采集自廣東省廣州市天河區(qū)市政綠化道。植物基因組DNA提取試劑盒（Easypure?Plant?Genomic?DNA?Kit）和大腸桿菌Escherichia?coli?T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;Premix?TaqTM、pMD?19T?Vector購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2?病樣總DNA的提取

取雪花木病樣約100?mg，利用植物DNA提取試劑盒提取其總DNA，具體步驟參照試劑盒說明書。所獲總DNA溶解于50?μL?ddH2O中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?16S?rRNA基因的擴(kuò)增

利用擴(kuò)增植原體16S?rRNA的通用引物P1（5′AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT3′）/P7（5′CGTCCTTCATCGGCTCTT3′）［12］，對疑似病樣總DNA進(jìn)行PCR檢測，預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為1.8?kb。反應(yīng)體系30.0?μL：待測樣品總DNA?1.0?μL，?Ex?TaqTM?Premix?15.0?μL，引物P1/P7（10?μmol/L）各1.0?μL，ddH2O?12.0?μL。反應(yīng)程序：95℃?預(yù)變性4?min;95℃?1?min，55℃?1?min，72℃?90?s，35個(gè)循環(huán);72℃?延伸10?min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4?基因克隆與測序

將所獲目的片段進(jìn)行純化，連接至pMD19T載體，采用熱激法將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞，吸取80?μL菌液涂布在含100?μg/mL?Amp、40?μL/mL?Xgal的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜;挑取陽性單菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5?序列分析

利用DNAStar的SeqMan對序列拼接，將所獲得的完整序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn搜索，確定是否為植原體基因序列;利用在線分析工具M(jìn)USCLE?（https：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）將所獲得的16S?rRNA序列與已報(bào)道的相關(guān)序列進(jìn)行相似性分析。采用MEGA?6.0的最大似然法（maximum?likelihood，ML）［13］構(gòu)建基于16S?rRNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1?000。進(jìn)一步將16S?rRNA序列通過植原體在線分類軟件iPhyClassifier（https：∥plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi）進(jìn)行虛擬RFLP分析和計(jì)算相似系數(shù)，確定其分類地位［14］。

2?結(jié)果與分析

2.1?田間癥狀

雪花木小葉病病株主要表現(xiàn)為小葉、節(jié)間縮短、葉片聚生，多數(shù)葉片邊緣向內(nèi)皺縮，與正常植株差異明顯（圖1）。該病害影響雪花木的光合作用，導(dǎo)致植株抗逆性逐步減弱，后期造成植株早衰，葉片易脫落。

2.2?PCR檢測結(jié)果

利用擴(kuò)增植原體16S?rRNA的引物P1/P7對6份雪花木小葉病病樣進(jìn)行PCR檢測，電泳結(jié)果顯示（圖2），所有病樣中均擴(kuò)增出約1.8?kb大小的條帶，而健康植株中未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。這一結(jié)果表明，所采集的6份雪花木疑似病樣中存在植原體，并命名為廣東雪花木小葉植原體（BLLGD2022）。

2.3?16S?rRNA序列分析

利用擴(kuò)增植原體16S?rRNA序列的通用引物P1/P7，從廣東雪花木小葉病樣總DNA中PCR擴(kuò)增獲得該基因片段，大小為1?811?bp?（GenBank登錄號為OQ625536），該片段包含16S?rRNA基因（1～1?530?nt）、含有rRNA?Ile的16S23S?rRNA間區(qū)（1?531～1?781?nt）和部分23S?rRNA基因序列（1?782～1?811?nt）。BLAST分析結(jié)果顯示，BLLGD2022與隸屬于16SrVI組（苜蓿增生植原體組，Clover?proliferation?group）植原體株系的相似性較高。進(jìn)一步利用在線MUSCLE軟件對BLLGD2022與其他32個(gè)植原體相關(guān)序列進(jìn)行核苷酸相似性分析，結(jié)果表明（表1），BLLGD2022與16SrVI組各植原體株系的相似性最高，為97.05%～99.83%，與其他組植原體的相似性較低，為89.19%～96.56%;其中與來自印度的隸屬于16SrVID亞組的木豆植原體clone?62株系以及茄子小葉植原體BLL25、LLB_MKS3、LLB_MKS5和LLB_MKS6株系相似性最高，均為99.83%;其次，與印度、孟加拉國和加拿大報(bào)道的16SrVID亞組的茄子植原體和茄子小葉植原體其他5個(gè)株系的16S?rRNA序列相似性為99.28%～99.82%;與中國報(bào)道的隸屬于16SrVI組的芥菜花變?nèi)~植原體OM1株系、芥菜叢枝植原體OM3株系相似性均為98.89%。

以柑橘黃龍病菌亞洲種（Candidatus?Liberibacter?asiaticus?isolate?B4）（MH368771）的16S?rRNA序列為外群，利用MEGA?6.0的最大似然法對BLLGD2022與32個(gè)植原體株系進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示（圖3），BLLGD2022與隸屬16SrVI組的25個(gè)植原體株系聚類在一個(gè)大分支，親緣關(guān)系較近;進(jìn)一步與隸屬16SrVID亞組的茄子小葉植原體8個(gè)株系及木豆、印楝樹植原體相關(guān)株系聚類在一個(gè)小分支，親緣關(guān)系更近;而與隸屬于16SrVII、16SrIX、16SrI、16SrII組的7個(gè)植原體株系親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4?16S?rRNA序列的iPhyClassifier在線分析

利用植原體在線分類軟件iPhyClassifier對BLLGD2022的16S?rRNA序列進(jìn)行虛擬RFLP分析，結(jié)果顯示（圖4）：基于Taq?I、Ssp?I、Rsa?I、Mse?I、Sau3A?I、Kpn?I、Hpa?II、Hpa?I、Hinf?I、Hha?I、Hae?III、EcoR?I、Dra?I、BstU?I、Bfa?I、BamH?I和Alu?I共17種限制性內(nèi)切酶的虛擬RFLP圖譜，BLLGD2022與16SrVID亞組的參考株系Brinjal?little?leaf?phytoplasma（GenBank登錄號為X83431）的酶切圖譜一致，相似系數(shù)為1.00，表明BLLGD2022屬于16SrVID亞組成員。

3?結(jié)論與討論

植原體的分類鑒定是植原體研究和防控病害的基礎(chǔ)，植原體組和亞組的劃分標(biāo)準(zhǔn)基于17種限制性內(nèi)切酶對16S?rRNA序列進(jìn)行多態(tài)性對比分析。通過與所有已發(fā)表的植原體16S?rRNA序列比較，相似系數(shù)F>0.97，劃分為已有16Sr亞組的不同株系或變種;相似系數(shù)F介于0.85～0.97，劃分為一個(gè)新的16Sr亞組;相似系數(shù)F≤0.85，劃分為一個(gè)新的植原體16Sr組［1516］。截至2019年6月，已鑒定出植原體為52個(gè)暫定種、34個(gè)組和100多個(gè)亞組［9］。16SrVI組為苜蓿增生植原體組（clover?proliferation?group），于2004年被正式命名，包括引起苜蓿叢枝、甜菜綠化、茄子小葉、三葉草增生、馬鈴薯叢枝、馬鈴薯黃化、番茄巨芽、百香果叢枝、柳樹叢枝等癥狀的植原體［1719］。2022年，本團(tuán)隊(duì)在廣東省廣州市首次發(fā)現(xiàn)了雪花木小葉病，PCR檢測表明該病樣感染了植原體，命名為廣東雪花木小葉植原體（BLLGD2022），通過16S?rRNA序列分析明確與廣東雪花木小葉病相關(guān)的植原體屬于16SrVID亞組。本研究首次在雪花木上檢測到植原體，并鑒定該株系為16SrVID亞組植原體，為研究植原體群體多樣性、病害監(jiān)測以及防控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

據(jù)報(bào)道，16SrVID亞組植原體在印度廣泛侵染茄子、生菜、芹菜、甘藍(lán)、萵苣等蔬菜，尤其是茄子小葉病已造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［2021］，在我國16SrVID亞組植原體病害尚未見報(bào)道。植原體大量存在于寄主植物的韌皮部篩管細(xì)胞中，自然條件下植原體大多依賴于通過取食韌皮部汁液的半翅目媒介昆蟲以持久性傳播的方式在其宿主間實(shí)現(xiàn)高效的傳播，主要植原體媒介昆蟲有葉蟬科、飛虱科和木虱科等植食性昆蟲［22］。例如茶樹小綠葉蟬Empoasca?flavescens傳播花生叢枝植原體［23］，擬帕小綠葉蟬Empoasca?（Matsumurasca）?paraparvipenis傳播喜樹叢枝植原體［24］，異沙葉蟬Psammotettix?alienus傳播小麥藍(lán)矮植原體［25］等。在感染茄子小葉病的菜場采集到已知的5種葉蟬，只有1種葉蟬Hishimonas?phycitis的唾液腺中檢測到16SrVID亞組植原體，表明其是16SrVID亞組植原體的重要媒介昆蟲［21］。16SrVID亞組植原體借助媒介昆蟲傳播的范圍更廣，具有更為廣泛的宿主范圍和傳播能力，因此對該亞組植原體株系的研究具有重要的流行病學(xué)意義。

廣東省地處熱帶和亞熱帶地區(qū)，常年高溫高濕，物種資源豐富，植物和介體昆蟲周年可生長與繁殖，為植原體引發(fā)的植物病害發(fā)生提供了有利條件［26］。本研究首次在雪花木上鑒定到16SrVID亞組植原體侵染引起的雪花木小葉病，該病害的病原與廣泛發(fā)生在印度的茄子小葉病的病原分類地位一致，均為16SrVID亞組植原體。據(jù)報(bào)道，16SrVID亞組植原體還侵染芝麻、多種觀賞植物和藥用植物等［2728］，由此推測，該亞組植原體病害未來極有可能通過介體昆蟲在廣東地區(qū)蔓延，引起多種蔬菜、園林植物植原體病害，因此需要重點(diǎn)關(guān)注。由于目前還缺乏有效防治植原體病害的藥劑，防治傳病介體昆蟲對防控該類病害的擴(kuò)散和發(fā)生至關(guān)重要。因此，下一步亟須開展傳菌介體昆蟲種類鑒定、介體昆蟲的帶菌情況監(jiān)測等研究工作，為16SrVID亞組植原體病害的防控提供科學(xué)依據(jù)。

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