郭佳玲， 李暉， 曾子鍵， 陶雨靜， 董海艦

（成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 中心實驗室，四川 成都 610072）

多種器官可發(fā)生纖維化，器官內纖維結締組織增多，實質細胞減少，持續(xù)進展可致器官結構破壞和功能減退，乃至衰竭，嚴重威脅人類健康和生命[1]。據(jù)統(tǒng)計，重大纖維化相關疾病的年綜合發(fā)病比例約為0.2/10 萬[2]，造成巨大的臨床和經濟負擔。迄今為止，僅有吡非尼酮和尼達尼布兩種藥物被批準用于特發(fā)性肺纖維化，但療效不佳，毒性反應大，限制了臨床應用[3-4]，因而研發(fā)有效的器官纖維化治療方法具有重要意義。間充質干細胞來源的外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosomes, MSC-Exos）是一種新的無細胞療法，具有調節(jié)特性，通過生理屏障將功能性“物質”運送到靶細胞，發(fā)揮通信和調節(jié)活性，還具有體積小、免疫原性低、無致瘤作用、半衰期長、性質穩(wěn)定等優(yōu)勢，具有良好的應用前景，已成為再生醫(yī)學領域的研究熱點。近年來，MSC-Exos 在治療器官纖維化方面取得了一些進展，本文綜述了MSCExos 治療器官纖維化中可能存在的作用機制。

1 概述

間充質干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）來源于早期發(fā)育的中胚層，是一種具有較強增殖能力和多向分化潛能的成體干細胞，存在于人體各組織器官中，可以很容易地從骨髓、胎盤、臍帶、羊水、脂肪組織、牙髓、母乳和滑膜等組織來源中分離出來[5]，經靜脈注射給藥。其來源多樣，取材方便，具有低免疫原性、多能分化性、旁分泌特性及自動歸巢于損傷區(qū)域，在抗炎及抗纖維化治療中顯示出了良好的應用前景，已廣泛用于治療多種組織器官損傷。然而，盡管已經進行了約20 年的研究，但只有少數(shù)基于細胞的療法進入了常規(guī)實踐，其仍存在局限性：靜脈注射干細胞易在肺部毛細血管滯留，存在肺栓塞風險，須限制使用的細胞數(shù)量，難以大量歸巢；鑒于干細胞的分化傾向，其在長期培養(yǎng)過程中很難保持穩(wěn)定的表型[6]；MSCs 移植有腫瘤形成風險，細胞排斥和輸注毒性的風險仍存在[7]；需要提高MSCs 的歸巢效率和MSCs 在宿主中的存活率，以確保MSCs 能夠長期有效地在宿主體內發(fā)揮免疫調節(jié)和組織修復的作用[8]。上述MSCs 的應用局限推動了對替代治療策略的探尋，無細胞治療可能會克服基于細胞療法相關的限制。

MSCs 在靜息或活化條件下可分泌具有脂質雙層結構的細胞外囊泡，包括外泌體、微囊泡和凋亡小體[9]。其中，外泌體是細胞外囊泡中最重要的成分，直徑為30～150 nm，富含脂質、蛋白質、微RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA）等細胞特異性生物活性分子[8]；MSC-Exos 是天然存在的低毒性分泌囊泡，具有良好的耐受性和歸巢能力，在體內容易被膜吸收，通過改變外泌體表面分子可促進細胞類型的特異性靶向，是作為瞬時修飾靶細胞中特定過程的理想載體系統(tǒng)[10]。此外，MSC-Exos還參與誘導血管生成、抑制纖維化、增強神經元存活和分化、刺激細胞外基質重塑、消除局部炎癥反應以及調節(jié)免疫細胞活性[11]。MSC-Exos 具備MSCs 的生物學潛力，與MSCs 相比，其分泌能力強，更具針對性，具有體積更小、免疫原性更低、無致瘤作用、可以穿過血腦屏障等優(yōu)勢，更好地發(fā)揮免疫調節(jié)、抗炎和組織修復功能[10]，具有作為無細胞治療的潛力。

越來越多的證據(jù)表明，MSC-Exos 作為一種新的無細胞療法，優(yōu)于相應的MSCs，可能成為一種有效的替代方案，探究MSC-Exos 在纖維化疾病中的作用及機制有利于提升臨床疾病的診療水平。

2 MSC-Exos在不同器官纖維化中的作用

纖維化是細胞外基質（extracellular matrix, ECM）蛋白過度沉積，導致組織結構扭曲和細胞穩(wěn)態(tài)喪失，最終誘發(fā)瘢痕形成的過程[12]，其標志包括肌成纖維細胞和膠原沉積物的存在和持久性[13]，一旦發(fā)生纖維化，多難以完全逆轉，臨床治療較為棘手。目前已有研究證實MSC-Exos 治療后的纖維化動物模型中炎癥因子、膠原纖維的表達量顯著降低，纖維化通路相關分子表達下調，器官纖維化得到明顯改善[14]。MSC-Exos 在組織修復中的具體作用機制尚不清楚，可能與抑制甚至逆轉纖維化、促進原有細胞增殖修復等有關。

2.1 MSC-Exos在肝纖維化中的作用

肝纖維化是由慢性肝損傷和炎癥反應引起肝星狀細胞（hepatic stellate cell, HSC）活化和ECM 過度沉積的病理過程，持續(xù)進展可導致肝硬化、肝癌等嚴重并發(fā)癥?；罨腍SCs 增殖并轉化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞合成ECM 并釋放大量基質金屬蛋白酶抑制劑，通過抑制間質膠原酶活性來減少ECM 降解，導致ECM 積累[15]。有研究證明MSC-Exos 可以發(fā)揮與親代細胞類似的治療效果[16]，可抑制HSCs 的活化，抑制膠原蛋白的分泌，減少ECM 的沉積以達到抗纖維化作用。ZHANG 等[17]通過實驗表明，MSC-Exos 能夠內化并整合到LX-2 細胞中，通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路在細胞周期的G1期使細胞周期停滯并誘導細胞凋亡，進而調節(jié)細胞表型，抑制HSCs 增殖，下調膠原蛋白I 和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）表達，抑制上皮到間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和降解ECM，進而抑制肝纖維化。AFARIN 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 通過體外和體內介導NADPH 氧化酶（NOX）信號通路，有效地降低了活化HSCs 中的NOX1、NOX2 和NOX4 mRNA 表達，Smad3 蛋白的磷酸化和活性氧產生，抑制活化HSCs 并誘導其細胞凋亡，進而發(fā)揮抗纖維化作用。另有研究者發(fā)現(xiàn)，富含MSC-Exos 的microRNA-618通過靶向Smad4 減弱了肝纖維化的進展[19]；富含MSC-Exos 的microRNA-148a 通過Kruppel 樣因子6/STAT3 信號調節(jié)肝內巨噬細胞功能，并為肝纖維化提供了潛在的治療靶點[20]。MSC-Exos 已成為天然生物相容性藥物遞送載體；木犀草素（Luteolin,LUT）是一種植物類黃酮，在治療肝纖維化方面很有優(yōu)勢，ASHOUR 等[21]制備了LUT 負載的外泌體（LUT-Ex），通過實驗證明LUT-Ex 具有很好的抗纖維化活性，同時證實了MSC-Exos 具有抗纖維化、抗氧化、免疫調節(jié)和再生活性增強藥物作用的效果。綜上所述，MSC-Exos 抗肝纖維化的機制十分復雜，目前研究仍未能完全明確闡述，仍需要研究者不斷地探索。

2.2 MSC-Exos在腎纖維化中的作用

腎纖維化是多種致病因素刺激，其固有細胞受損，發(fā)展到后期出現(xiàn)大量膠原沉積和積聚，造成腎實質逐漸硬化，形成瘢痕，直至腎臟完全喪失臟器功能。據(jù)估計，慢性腎臟?。╟hronic kidney disease, CKD）影響全球8%～16%的人口，被認為是第16 大死因[22]。腎纖維化是CKD 常見的進行性和不可逆的病理特征和最終表現(xiàn)，其形態(tài)特征包括腎小球硬化、腎小管萎縮、間質性慢性炎癥和纖維化，以及血管稀疏[23]，目前尚無有效的腎纖維化治療藥物。

MSC-Exos 因其抗凋亡、抗炎和促血管生成作用而成為有希望治療腎纖維化的新策略。miRNA 在腎臟發(fā)育和腎功能的維持中起著重要作用，是纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中細胞生物學功能的主要調節(jié)因子[24]。MSC-Exos 可通過microRNA-21a-5p 介導糖酵解限速酶肌肉磷酸果糖激酶（muscle phosphofructose kinase, PFKM），靶向減弱腎小管上皮細胞的糖酵解來改善腎纖維化[25]。解整合素金屬蛋白酶19（a disintegrin metalloproteinase 19, ADAM19）高表達與腎小球纖維化和炎癥有關，其在轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）誘導的腎細胞中表達增加，并促進腎臟腎小管EMT；富含MSC-Exos 的microRNA-335-5p 通過降低ADAM19 蛋白水平來改善TGF-β1誘導的HK-2 細胞的EMT 和炎癥，增強抗炎細胞因子表達，進而改善腎纖維化[26]。也有研究證明，MSC-Exos 治療對腎纖維化的緩解是由microRNA-122a 介導的；microRNA-122a 緩解腎小管上皮細胞纖維化的策略調節(jié)了自噬和mTOR 相關的信號通路，通過自噬信號通路和自噬流減輕HK-2 中TGF-β 引起的纖維化[27]。

近年來進行的實驗研究表明，以MSC-Exos 為基礎的治療對腎臟損傷修復及功能恢復具有一定效果，甚至可逆轉纖維化進程，為腎纖維化的治療提供了新的選擇。

2.3 MSC-Exos在肺纖維化中的作用

肺纖維化是多種原因導致的以成纖維細胞增殖及大量ECM 沉積、肺組織結構破壞為特征的間質性肺疾病的終末期肺臟改變[28]。肺纖維化是大多數(shù)慢性呼吸系統(tǒng)疾病的主要臨床結局，如塵肺和特發(fā)性肺纖維化，其疾病譜范圍廣，病死率高，至今仍缺乏有效的治療方法[2，29]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 可修復不可再生的組織或器官，其治療肺纖維化疾病的潛能引起研究者的廣泛關注。放射誘發(fā)的肺纖維化是胸部放療的常見并發(fā)癥，體外和體內輻射使上皮極性喪失，上皮標志物E-鈣黏蛋白表達下調，間質標志物Vimentin 表達上調，干擾受體細胞中的基因表達， 誘導EMT 和肺損傷， 富含MSC-Exos 的microRNA-466f-3p 通過抑制Akt/GSK3β 通路可逆轉上述改變，發(fā)揮抗纖維化作用[30-31]。此外，MSCExos 通過抑制TGF-β1/Smad2/3 信號通路，抑制肺上皮間質轉化過程，緩解博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化[32]。還有研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 體內移植減少膠原蛋白積累，降低促纖維化因子TGF-β1的水平，抑制了肺纖維化組織中Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的表達，抑制EMT 的進展，有效緩解了二氧化硅誘導的肺纖維化[33]。

由此可見，MSC-Exos 可能是治療肺纖維化較理想的方法，但將其應用于臨床前還需通過大量實驗進行驗證。

2.4 MSC-Exos在心肌纖維化中的作用

心肌纖維化是一個持續(xù)進展且不可逆的病理過程，不同心臟病病因均可發(fā)生。心肌纖維化特征是心臟成纖維細胞過度增殖和ECM 蛋白沉積，引起進行性心臟舒縮功能障礙，最終導致慢性心力衰竭、心律失常及心臟驟停等心血管事件[34]。

目前已有諸多研究表明，MSC-Exos 可通過內部的miRNA 將信息傳遞至靶細胞參與并調節(jié)心肌纖維化的病理形成過程。有研究者對富含MSC-Exos的miRNA 進行了網絡分析，結果表明MSC-Exos 中含量較高的microRNA-1246、microRNA-23a-3p 和microRNA-451a 能明顯抑制人心肌成纖維細胞膠原的生成[35]。ZHENG 等[36]研究發(fā)現(xiàn)通過靶向血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶16（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 16,ADAMTS16）來上調富含MSC-Exos 的microRNA-29b-3p，可改善心肌血管生成和心室重塑，減少心肌纖維化，增加毛細血管密度和血管內皮生長因子表達，并抑制心肌梗死大鼠心肌細胞的凋亡。另外，WANG 等[37]通過復制大鼠心臟缺血再灌注損傷模型和體外心臟微血管內皮細胞缺氧/再灌注模型，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 通過調節(jié)血小板衍生的生長因子受體β，增強應激條件下的微血管再生，抑制纖維化的發(fā)展，改善心功能。MSC-Exos 通過增強心肌血管生成和免疫調節(jié)以及控制心肌細胞凋亡和纖維化，已被證明并被廣泛認可其在心臟修復和心臟再生中的作用。

2.5 MSC-Exos在子宮腔粘連中的作用

子宮腔粘連（intrauterine adhesion, IUA）是子宮內膜嚴重損傷修復引起膠原纖維沉積在宮腔內造成內膜纖維化，導致的宮腔部分或全部粘連閉塞，其本質是一種纖維化疾病[38]。IUA 可引起月經異常、周期性腹痛、不孕及反復流產等一系列并發(fā)癥，嚴重威脅女性的生殖健康，已成為臨床上待解決的難題，目前無論是藥物治療還是手術治療均未取得較為滿意的效果[38-39]。近年研究發(fā)現(xiàn)，MSCExos 在促進損傷子宮內膜再生修復和纖維化中發(fā)揮重要作用。LI 等[40]采用不同濃度的TGF-β1構建IUA 細胞模型，發(fā)現(xiàn)富含MSC-Exos 的microRNA-145-5p 改善了子宮內膜纖維化。TAN 等[41]的研究表明，MSC-Exos 可促進體外和體內子宮內膜修復，microRNA-29 的過表達可降低TGF-β 的表達，從而抑制Smad3 的活性，實現(xiàn)抗纖維化。YAO 等[42]復制IUA 兔模型，發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 可通過抑制TGF-β1/Smad 信號通路減少內膜纖維化區(qū)域，增加子宮內膜腺體數(shù)量，增加維持子宮內膜細胞完整性的細胞骨架蛋白CK-19 的表達，而下調Vimentin 的表達，證實了MSC-Exos 通過逆轉EMT 對損傷內膜的修復作用。

2.6 MSC-Exos在其他器官纖維化中的作用

幾乎所有組織器官損傷修復的終末階段均可引起纖維化。無細胞治療作為一種新型療法，在多種損傷性疾病中均有報道。有研究發(fā)現(xiàn)富含MSC-Exos 的microRNA-214 可通過阻斷IL-33/ST2 軸來緩解皮膚纖維化[43]。MSC-Exos 可有效減輕高糖腹透液誘導的小鼠腹膜纖維化，為抑制腹膜纖維化提供了新方法[44]。

3 總結與展望

纖維化疾病的高病死率和復雜的發(fā)病機制使臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)。MSC-Exos 在治療纖維化疾病方面具有強大的應用前景，近年來應用MSCExos 治療各種纖維化的實驗研究不斷涌現(xiàn)，并已取得一定的進展，但在臨床應用方面仍有很多困難。如何精準誘導MSCs 產生特定類型的外泌體治療特定的疾病是亟待解決的問題；需進一步確定MSCExos 內容物的表征、疾病治療的特定分子機制及運輸方式，以確保其安全性和有效性；目前外泌體的應用大多數(shù)局限于體外實驗，臨床應用較少，缺乏豐富的臨床實驗數(shù)據(jù)，其在人體細胞中的作用機制及具體療效還需繼續(xù)深入探索。相信隨著MSC-Exos 相關研究的不斷深入，上述這些問題會逐步解決，MSC-Exos 將展現(xiàn)出良好的治療前景。