李詩怡 王康 黃菊 張澳 張培培 謝迎賓

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科，濱州 256603

目前，手術仍是白內(nèi)障患者復明的唯一方式，術后殘留的人晶狀體上皮細胞（HLECs）出現(xiàn)增殖、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使后囊膜出現(xiàn)混濁與纖維化，稱為后發(fā)性白內(nèi)障（PCO）。盡管手術方式及人工晶狀體材質(zhì)與設計的改進均在一定程度上降低了PCO的發(fā)病率，但仍改變不了其為白內(nèi)障術后最常見的并發(fā)癥。Nd∶YAG激光后囊膜切開術作為PCO唯一有效治療手段，仍無法避免黃斑水腫、視網(wǎng)膜脫離、眼壓升高及人工晶狀體損傷等并發(fā)癥的出現(xiàn)［1］。因此，有效抑制HLECs增殖、遷移及EMT成為防治PCO的關鍵。近年來，羥基紅花黃色素A（HSYA）被發(fā)現(xiàn)可抑制脂多糖誘導的非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲、遷移及EMT［2］，也有研究發(fā)現(xiàn)HSYA可延緩心、肺、腎等臟器纖維化［3-5］?，F(xiàn)在HSYA在眼科，尤其是在晶狀體相關疾病中的研究較少［6-7］。本研究通過體外實驗觀察HSYA對人晶狀體上皮細胞系SRA01/04（HLEC-SRA01/04）增殖、遷移及EMT的影響，旨在探討HSYA在PCO防治中的價值。

材料與方法

1.細胞系及主要試劑儀器

HLEC-SRA01/04，廣州賽庫生物技術有限公司；HSYA，上海麥克林生化科技股份有限公司；重組人表皮生長因子（rhEGF），美國PEPROTECH公司；胎牛血清（FBS），南美洲Lonsera公司；增強型25%胰蛋白酶-EDTA消化液、四甲基偶氮唑藍（MTT）、Transwell細胞培養(yǎng)小室，廣州白鯊生物科技有限公司；兔單克隆抗增殖細胞核抗原（PCNA）抗體，Abcam；兔單克隆抗波形蛋白（Vimentin）抗體，武漢ABclonal公司；山羊抗兔過氧化物酶二抗，中衫金橋；實時熒光定量PCR（qPCR）單鏈合成試劑盒，北京全式金生物技術股份有限公司；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；自動酶標分析儀（AT-858），美國熱電Thermo公司；PCR擴增儀、qRT-PCR儀，德國Eppendorf公司。研究時間為2022年6月至2023年9月。

2.方法

2.1.HLEC-SRA01/04的培養(yǎng) 將HLEC-SRA01/04原代細胞復蘇后接種于4 ml的完全培養(yǎng)基中（含有20% FBS、1%青霉素鏈霉雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基），置于含體積分數(shù)為5% CO2、37 ℃的恒溫孵育箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，根據(jù)細胞生長狀況，在細胞對數(shù)生長期內(nèi)，細胞融合度為80%～90%時，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。取4次傳代后的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2.MTT法確定rhEGF誘導增殖的濃度 取對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化，培養(yǎng)基（含2% FBS）重懸，血球計數(shù)板計數(shù)，T25培養(yǎng)瓶中細胞濃度為90×104個/ml，按每孔100 μl細胞懸液、4×103個細胞接種于96孔板中，待12 h細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入100 μl含0、1、5、10、50 μg/L rhEGF的低血清培養(yǎng)基，每個濃度樣本均設置5個復孔，分別處理24 h后，棄去孔中培養(yǎng)基，每孔加入40 μl濃度為5 mg/L的MTT溶液及160 μl含2% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育4 h后吸除孔內(nèi)液體，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），待結(jié)晶完全溶解后，酶標儀在490 nm處檢測吸光度值（OD值），依據(jù)公式計算增值率（%）=（不同濃度細胞因子組平均OD值-空白對照組平均OD值）×100%/空白對照組的平均OD值。

2.4.細胞劃痕實驗確定rhEGF誘導遷移及EMT的濃度 將對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁且融合度達80%～90%時，替換低血清培養(yǎng)基，饑餓過夜，使用100 μl槍頭做細胞劃痕，磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗細胞碎片2遍，按實驗分組向每孔內(nèi)分別加入含0、1、10、50 μg/L rhEGF的低血清培養(yǎng)基，固定同一劃痕位置，分別在培養(yǎng)箱中孵育24 h，用光學顯微鏡拍照，Image J軟件測定并分析細胞的遷移距離，依據(jù)下列公式計算各組的細胞遷移率（%）=（初始劃痕距離-遷移后劃痕距離）/初始劃痕距離×100%。

2.5.實驗分組 根據(jù)MTT法確定HSYA藥物在HLEC-SRA01/04細胞中24 h的IC50值為（76.520±0.954）μmol/L，48 h的IC50值為（66.094±2.508）μmol/L，故后續(xù)實驗HSYA的藥物濃度分組為0、20、40、70、100 μmol/L；根據(jù)MTT及細胞劃痕實驗結(jié)果，后續(xù)實驗中均使用5 μg/L rhEGF用于誘導增殖，50 μg/L誘導遷移及EMT。以下為后續(xù)實驗分組：空白對照組為僅低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HLEC-SRA01/04；含0 μmol/L HSYA+rhEGF處理組；含20 μmol/L HSYA+ rhEGF處理組；含40 μmol/L HSYA+rhEGF處理組；含70 μmol/L HSYA+rhEGF處理組；含100 μmol/L HSYA+rhEGF處理組。

2.6.細胞劃痕實驗檢測不同濃度HSYA作用不同時間對rhEGF誘導的HLEC-SRA01/04遷移能力的影響 按2.4中實驗方式將細胞接種于6孔板并做細胞劃痕，按上述實驗分組處理細胞，固定同一劃痕位置，分別在培養(yǎng)箱中孵育0、24、48 h時，于顯微鏡下拍照記錄。

2.7.Transwell小室實驗檢測不同濃度HSYA作用24 h對rhEGF誘導的HLEC-SRA01/04遷移能力的影響 將SRA01/04細胞分組處理24 h后，分別消化并使用含雙抗無FBS培養(yǎng)基重懸，按每孔1×104個細胞接種于已水化好的上層小室中，在每個下層小室內(nèi)置含30% FBS的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育24 h，吸除小室內(nèi)液并擦除上層小室內(nèi)細胞，固定染色后，清洗染料，于倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件計數(shù)，細胞遷移率=視野中穿過濾過膜的細胞數(shù)，每組隨機選取3個不同視野取平均數(shù)。

2.8.蛋白印跡法（Western Blot）檢測PCNA及EMT標記物Vimentin的表達情況 按上述實驗分組，分別使用含5 μg/L及50 μg/L rhEGF的不同濃度HSYA溶液處理6孔板內(nèi)貼壁細胞，培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液沖洗2遍后分組提取細胞內(nèi)蛋白，二喹啉甲酸法測定總蛋白濃度，每個樣本總蛋白上樣量為30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜后，將轉(zhuǎn)好的膜置于快速封閉液中室溫封閉15 min，分別使用一抗稀釋液（5 μg/L組-抗PCNA抗體抗；50 μg/L組-Vimentin抗體）4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后，二抗稀釋液室溫孵育1 h，再次洗膜，滴加超敏發(fā)光液曝光、顯影。每個樣本重復3次實驗。Image J軟件分析處理目標條帶的光密度值。

2.9.逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合鏈式反法（RT-qPCR）檢測PCNA及EMT標記物Vimentin的mRNA表達水平 按上述實驗分組處理細胞，給藥后24 h，使用Trizol法分組提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，按qPCR反應體系，進行擴增。PCNA、Vimentin和β-肌動蛋白（β-actin）mRNA引物序列均由蘇州金唯智生物技術有限公司合成，引物序列（每個樣本設3個復孔）：PCNA-F：5’-GCTCCATCCTCAAGAAGGTGT-3’，PCNA-R：5’-GGAGCTAATATCCCAGCAGGC-3’；Vimentin-F：5’-AGGCGAGGAGAGCAGGATTT-3’；Vimentin-R：5’-AGTGGGTATCAACCAGAGGGA-3’；β-actin-F：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’；β-actin-R：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

3.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，采用單因素方差分析法，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1.MTT比色法測定HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（表1）

表1 不同濃度rhEGF對HLECs增殖的影響（±s）

表1 不同濃度rhEGF對HLECs增殖的影響（±s）

注：rhEGF為重組人表皮生長因子，HLECs為人晶狀體上皮細胞，OD為吸光度；與陰性對照組比較，aP＜0.05

組別OD值增殖率（%）0 μg/L rhEGF（陰性對照組）1 μg/L rhEGF 5 μg/L rhEGF 10 μg/L rhEGF 50 μg/L rhEGF 0.492±0.018 0.520±0.011a 0.650±0.019a 0.573±0.008a 0.545±0.011a 1.000 1.058±0.030 1.322±0.068a 1.163±0.043a 1.108±0.019a

HLECs經(jīng)不同濃度rhEGF培養(yǎng)后，1 μg/L rhEGF濃度組、5 μg/L rhEGF濃度組、10 μg/L rhEGF濃度組、50 μg/L rhEGF濃度組OD值及增殖率均高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

當讀者在頭腦中對這首詩進行精細復述時，lover這個詞在譯者的先驗里應該與美好的愛情有關，這就會抑制讀者關于“dream”噩夢、夢魘的相關聯(lián)想，只會激活其夢或者夢想的概念。“drive”可能激活開車、駕駛、驅(qū)趕、發(fā)動等動作，但與后面的“orioles”會為譯者提供物體的背景情景來幫助判斷所要提取的意義，在此處要選取“驅(qū)趕”之意。以此類推，根據(jù)上下文提供背景的模擬運演，本詩構建出的情景模型是一位少女正在夢中與自己的心上人約會，不料被枝頭啼叫的黃鸝鳥驚醒，盡管鳥兒歌聲動聽，但打斷了少女與情人的約會。通過這一心理過程讀者理解的詩的主體是少女思念情人。

2.不同濃度及時間下HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（表2）

表2 不同濃度及時間下HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（±s）

表2 不同濃度及時間下HSYA對rhEGF誘導HLECs增殖的影響（±s）

注：rhEGF均為5 μg/L；HSYA為羥基紅花黃色素A，rhEGF為重組人表皮生長因子，HLECs為人晶狀體上皮細胞，OD為吸光度；與陰性對照組比較，aP＜0.05；與24 h增殖抑制率比較，bP＜0.05

48 h增殖抑制率（%）0 14.3±3.7a 27.4±3.1a 42.6±2.7a 59.2±2.2a 81.0±1.0ab組別0 μmol/L HSYA+rhEGF（陰性對照組）20 μmol/L HSYA+rhEGF 40 μmol/L HSYA+rhEGF 60 μmol/L HSYA+rhEGF 80 μmol/L HSYA+rhEGF 100 μmol/L HSYA+rhEGF 24 h OD值0.562±0.005 0.494±0.008a 0.455±0.026a 0.384±0.016a 0.260±0.003a 0.164±0.003a 24 h增殖抑制率（%）0 12.1±0.6a 19.0±3.8a 31.5±2.2a 53.7±0.4a 70.8±0.3a 48 h OD值0.692±0.022 0.592±0.018a 0.502±0.006a 0.394±0.008a 0.282±0.016a 0.131±0.005a

不同濃度HSYA與5 μg/L rhEGF共同作用于HLECs不同時長后，隨著HSYA濃度升高，孔內(nèi)OD值逐漸減小，HSYA對HLECs增殖抑制率逐漸升高，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性；同一濃度作用下，HSYA對HLECs的48 h增殖抑制率均高于24 h，但僅有100 μmol/L濃度組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余各濃度組24 h與48 h的抑制率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；作用24 h后，HSYA對HLECs的IC50值為（76.520±0.954）μmol/L，48 h的IC50值為（66.094±2.508）μmol/L。

3.細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA對rhEGF誘導的HLECs遷移的影響

不同濃度rhEGF作用24 h后，0、1、10、50 μg/L組的遷移率分別為（45.6±9.7）%、（46.1±3.1）%、（58.3±6.8）%、（83.1±2.7）%，隨著rhEGF濃度增加，細胞遷移率逐漸增加，除0 μg/L與1 μg/L組間外，其余各組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖1、圖2。

圖1 細胞劃痕實驗測定不同濃度rhEGF對HLECs遷移率的影響

圖2 不同濃度組rhEGF作用于HLECs后的劃痕實驗結(jié)果

4.細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA對rhEGF誘導HLECs遷移的影響

不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導的HLECs 24、48 h后，各組細胞劃痕實驗結(jié)果見圖3?？瞻捉M及0、20、40、70、100 μmol/L組的24 h細胞遷移率分別為（46.9±1.8）%、（90.0±1.5）%、（88.4±2.1）%、（43.3±6.6）%、（31.5±16.2）%、（5.82±5.2）%，48 h細胞遷移率分別為（81.1±2.3）%、100%、（95.5±0.1）%、（72.6±3.5）%、（58.5±6.1）%、（37.4±7.1）%，隨HSYA濃度增加，HLECs遷移率逐漸下降，具有濃度依賴性，各組數(shù)據(jù)經(jīng)單因素ANOVA檢驗發(fā)現(xiàn)，0 μmol/L與20 μmol/L組間在24 h和48 h作用時長下，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），證明當HSYA濃度≥40 μmol/L時，HSYA可明顯抑制50 μg/L rhEGF誘導HLECs的遷移（圖4、圖5）。

圖3 不同HSYA濃度組作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs 24 h及48 h后的劃痕實驗

圖4 細胞劃痕實驗測定不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs的24 h遷移率

圖5 細胞劃痕實驗測定不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs的48 h遷移率

5.Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA對rhEGF誘導HLECs遷移的影響

Transwell小室實驗結(jié)果顯示：空白組及0、20、40、70、100 μmol/L組的細胞數(shù)分別為（171.667±20.407）個、（290.222±24.135）個、（198.667±16.826）個、（161.222±5.981）個、（134.111±6.850）個、（67.444±7.351）個，其中40 μmol/L與70 μmol/L濃度組的穿膜細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖6 Transwell小室實驗測定不同濃度HSYA作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組的穿膜細胞數(shù)

圖7 不同HSYA濃度組作用于50 μg/L rhEGF誘導HLECs 24 h后的Transwell小室實驗

6.Western blot法分析各組內(nèi)PCNA及Vimentin含量

空白組與0 μmol/L HSYA組PCNA及Vimentin相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；各組蛋白PCNA及Vimentin表達量隨HSYA濃度升高而降低，其中0 μmol/L與40、70、100 μmol/L組內(nèi)PCNA及Vimentin含量比較（均P＜0.05），當HSYA濃度≥40 μmol/L時，可明顯抑制rhEGF誘導HLECs內(nèi)PCNA與Vimentin的表達（圖8～10）。

圖8 Western Blot法測定各組PCNA及Vimentin蛋白的表達水平

圖9 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞PCNA蛋白的相對表達量

圖10 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞的Vimentin相對表達量

7.RT-qPCR法分析各組內(nèi)PCNA及Vimentin的mRNA表達量

PCNA及Vimentin的mRNA含量均隨HSYA的濃度升高而降低，其中當HSYA濃度≥40 μmol/L時，PCNA與Vimentin的mRNA表達量與0 μmol/L組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖11、圖12。

圖11 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞PCNA 的mRNA相對表達量

圖12 不同濃度HSYA作用于rhEGF誘導HLECs 24 h后，各組細胞的Vimentin mRNA相對表達量

討論

白內(nèi)障術后殘留的HLECs異常增殖、遷移及分化是導致后囊膜出現(xiàn)白色纖維化混濁的主要原因，臨床上PCO的病理改變主要分為再生型和纖維化型，前者為殘余晶狀體細胞在手術機械刺激后出現(xiàn)的異常增殖與分化，后者可見紡錘形細胞的出現(xiàn)、基質(zhì)沉積和后囊膜皺縮［8］，患者自身基礎疾?。ㄈ缣悄虿。?、年齡、術式、人工晶狀體材質(zhì)都與PCO的發(fā)病率有關系［9］。在對發(fā)病機制的進一步研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障術后眼內(nèi)炎癥因子的表達明顯增加，可刺激表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子、纖維生長因子等細胞因子進入激活狀態(tài)，它們在PCO的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用［10-11］。

EGF最早發(fā)現(xiàn)于小鼠頜下腺，在人體內(nèi)由十二指腸及頜下腺分泌，存在于人所有的體液中，且人晶狀體中可檢測到相應受體的表達［12-13］。Majima［14］在確保低血清中無rhEGF的前提下，提出EGF可有效促進晶狀體上皮細胞（LECs）的增殖潛力，其中，1 μg/L的EGF作用較好，而10 μg/L的EGF還可以促進LECs的纖維化。Kampmeier等［13］提出5 μg/L EGF可誘導HLEC-SRA01/04增殖。胡艷紅等［15］添加不同濃度rhEGF培養(yǎng)牛晶狀體上皮細胞，發(fā)現(xiàn)當rhEGF濃度為50 μg/L時，促生長作用明顯。進一步研究發(fā)現(xiàn)，使用EGF可抑制人晶狀體上皮細胞系HLE-B3 Ad12/SV40增殖、遷移及細胞內(nèi)基質(zhì)收縮［16］。Jang等［17］提出EGF可通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路介導基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，促進HLECs發(fā)生遷移。本研究選取rhEGF構建體外PCO模型發(fā)現(xiàn)，rhEGF可有效促進HLEC-SRA01/04增殖，而HLEC-SRA01/04的遷移表現(xiàn)出對rhEGF明顯的濃度依賴性。

紅花也稱草紅花或刺紅花，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛功效，而HSYA是紅花黃色素的主要活性成分［18-19］，具有抗炎、調(diào)控細胞凋亡、抑制新生血管生成、抗凝等多種藥理作用［6］，不僅可抑制肺癌［2］、結(jié)直腸癌［20］及食道癌［21］等腫瘤細胞增殖與分化，還可抑制3T3-L1前脂肪細胞［22］、臍靜脈內(nèi)皮細胞［23］、成纖維細胞［24-25］、血小板衍生生長因子［26］或脂多糖［27］誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移，逆轉(zhuǎn)心、肝、肺等臟器纖維化［3-5，28］。近年來，也有眼科學者發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素可改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的血流灌注，拮抗小鼠視網(wǎng)膜光損傷［29-30］。HSYA可降低高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細胞的VEGF表達，并抑制其增殖［31］；紅花黃色素可上調(diào)抗氧化蛋白表達水平，使晶狀體免受氧化損傷［7］。

本研究在采用體外rhEGF誘導HLEC-SRA01/04模擬PCO的發(fā)生發(fā)展過程，觀察HSYA對其增殖、遷移及EMT的影響。MTT、細胞劃痕及Transwell小室實驗結(jié)果顯示，HSYA可以抑制rhEGF誘導的HLEC-SRA01/04增殖與遷移，具有較好濃度依賴性。HSYA可抑制間質(zhì)細胞標記物Vimentin mRNA與蛋白的表達，具有較好濃度依賴性，使HLECs的遷移能力下調(diào)。近年來與PCO發(fā)病機制相關的細胞因子及基因［32-34］研究不斷深入，對于HSYA對HLECs生物學特性影響的具體作用靶點，仍需進一步實驗探究。

綜上所述，HSYA可抑制rhEGF誘導的HLECs增殖、遷移及EMT，并下調(diào)PCNA與Vimentin基因及蛋白表達，提示HSYA有希望成為PCO防治中的新型藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明李詩怡：醞釀和設計試驗，實施研究，采集、分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計分析；王康：醞釀和設計試驗，統(tǒng)計分析；黃菊：醞釀和設計試驗，分析/解釋數(shù)據(jù)；張澳、張培培：醞釀和設計試驗，采集數(shù)據(jù)；謝迎賓：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，指導，支持性貢獻