王寶群，趙曉琳，林莎莎，鄒圣燦，劉桂亭

(青島琛藍(lán)海洋生物工程有限公司，山東 青島 266100)

羅望子多糖膠是一種從豆科羅望子屬植物羅望子(又稱酸角)的種子胚乳中提取分離出來(lái)的中性聚多糖，主要由葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖組成[1-3]。作為一種植物來(lái)源的多糖，其具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛使用。目前，羅望子多糖膠已被廣泛使用于食品行業(yè)，主要用作冰淇淋增稠劑、飲料懸浮劑、淀粉品質(zhì)改良劑、果凍和糕點(diǎn)膠凝劑等。此外，其在醫(yī)藥、保健、紡織等行業(yè)的應(yīng)用也被廣泛關(guān)注[4-7]。

高效液相色譜法(HPLC)作為一種高效準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，已被廣泛應(yīng)用于分析多糖中單糖組成和含量[8-12]。但是由于單糖組分的光學(xué)性質(zhì)普遍較差，所以常常需要用具有強(qiáng)紫外吸收的PMP試劑對(duì)單糖物質(zhì)進(jìn)行衍生后再進(jìn)行檢測(cè)，從而提高HPLC法的靈敏度[13]。PMP柱前衍生化高效液相色譜法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、設(shè)備操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[14-15]，因此采用該方法分析羅望子多糖膠中葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖組分的比例。此外，多糖水解采用的酸化試劑通常為三氟乙酸，但是三氟乙酸屬于弱酸，水解能力較弱，有時(shí)會(huì)造成水解不徹底的現(xiàn)象，所以采用強(qiáng)酸硫酸作為酸化試劑，以確保多糖能夠充分水解。綜上，采用硫酸水解-PMP柱前衍生化高效液相色譜法檢測(cè)羅望子多糖膠的單糖組分含量，為其準(zhǔn)確檢測(cè)提供方法和依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

LC-20AT型液相色譜儀、SPD-M20A 230V型光電二極管陣列紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，安捷倫有限公司；色譜柱(Diamonsil-plus C18-A*)，北京迪馬科技有限公司；101-1A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海滬越明科技儀器有限公司；AR224CN型電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；Master-E plus UF型實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A型旋渦振蕩器，上海滬西分析儀器廠有限公司；PHS-3E型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

羅望子多糖膠，安徽舒俊生物科技有限公司；D-葡萄糖、D-木糖和D-半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；PMP，麥克林生物科技有限公司；硫酸、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉、甲醇、二氯甲烷、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，賽孚瑞科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷酸鹽緩沖液配制

配制50 mmol/L磷酸二氫鉀和50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液，將兩者按體積比1∶1混合，然后用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8。

1.2.2 羅望子多糖膠樣品水解

稱取10 mg羅望子多糖膠樣品于頂空瓶中，加入1 mol/L H2SO4溶液2 mL，密封后放置于100 ℃烘箱酸解6 h。取出后冷卻，開(kāi)封。向溶液加入2 mol/L NaOH溶液2 mL，渦旋振蕩器混勻。將溶液過(guò)0.22 μm濾膜。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

分別稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品27 mg、木糖標(biāo)準(zhǔn)品29 mg和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品33 mg，放置于同一250 mL容量瓶中，用水定容后將溶液混勻。

1.2.4 衍生

取0.3 mL待測(cè)溶液于10 mL離心管中，加入0.3 mL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，加入0.3 mol/L NaOH溶液0.5 mL。將溶液用渦旋振蕩器混勻后，在70 ℃水浴衍生30 min。冷卻，加入0.3 mol/L鹽酸0.3 mL進(jìn)行中和。然后用二氯甲烷萃取多余衍生劑，每次1 mL，重復(fù)3次，直至二氯甲烷層無(wú)色。上清液過(guò)0.22 μm濾膜后置于色譜瓶中。

1.2.5 色譜條件

色譜柱為Diamonsil-plus C18-A*型(4.6 mm×50 mm，5 μm)，流動(dòng)相為50 mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)∶乙腈=82∶18的混合溶液，進(jìn)行等度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，采集時(shí)間為45 min。

1.2.6 進(jìn)樣檢測(cè)

將樣品溶液進(jìn)樣體積設(shè)置為5.0 μL，標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積依次設(shè)置為0.3、0.5、1.0、3.0和5.0 μL，進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相比例的確定

選定50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)-乙腈流動(dòng)相體系，調(diào)節(jié)流動(dòng)相中乙腈比例分別為16%、17%、18%、19%和20%。結(jié)果如圖1所示，隨著流動(dòng)相中乙腈比例的降低，各色譜峰間的分離度有所提高，但是當(dāng)乙腈比例過(guò)低時(shí)，各色譜峰的保留時(shí)間較長(zhǎng)。從色譜峰的分離度及保留時(shí)間兩個(gè)方面綜合考慮，確定流動(dòng)相條件為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)∶乙腈的比例為82∶18。

圖1 流動(dòng)相中乙腈比例對(duì)各單糖分離效果的影響Fig.1 Effect of acetonitrile ratio of mobile phaseon the separation of monosaccharides

2.1.2 流動(dòng)相pH的確定

選定50 mmol/L磷酸鹽緩沖液：乙腈比例為82∶18的流動(dòng)相體系，調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液的pH分別為6.4、6.6、6.8、7.0和7.2。結(jié)果如圖2所示，隨著磷酸鹽緩沖液pH的降低，各色譜峰間的分離度逐漸提高，各色譜峰的保留時(shí)間延長(zhǎng)。綜合分析色譜峰的分離度及保留時(shí)間，確定50 mmol/L磷酸鹽緩沖液的pH為6.8。

圖2 流動(dòng)相pH值對(duì)各單糖分離效果的影響Fig.2 Effect of pH value of mobile phase on the separation of monosaccharides

2.1.3 柱溫的確定

調(diào)節(jié)柱溫分別為25、30、35、40和45 ℃。結(jié)果如圖3所示，隨著柱溫升高，色譜峰的保留時(shí)間逐漸縮短。但當(dāng)柱溫過(guò)高時(shí)，色譜峰的分離度呈下降趨勢(shì)。結(jié)合色譜峰的分離度及保留時(shí)間兩因素考慮，確定柱溫為35 ℃。

圖3 柱溫對(duì)各單糖分離效果的影響Fig.3 Effect of column temperature on separation of monosaccharides

2.2 樣品檢測(cè)

選取三批相同來(lái)源的羅望子多糖膠樣品進(jìn)行檢測(cè)，色譜譜圖如圖4所示。對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行計(jì)算計(jì)算，確定各檢測(cè)樣品中三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的組成，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，羅望子多糖膠樣品中含有葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖，葡萄糖含量最高，木糖次之，半乳糖含量最低，三者的所占比例分別為52.05%、20.03%和12.17%。

表1 羅望子多糖膠中三種單糖的含量Table 1 Contents of three monosaccharides in tamarind polysaccharide gum

圖4 羅望子多糖膠的色譜圖Fig.4 Chromatogram of tamarind polysaccharide gum

2.3 色譜方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系和檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生化，進(jìn)樣體積分別設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、5、10和15 μL，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，記錄各色譜峰的峰面積。在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)，以各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制線性回歸曲線。采用信噪比S/N=3的公式計(jì)算檢測(cè)限，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，三種單糖的相關(guān)系數(shù)在0.999 2～0.999 9之間，檢出限在0.004 3～0.005 6 mg/L之間，說(shuō)明三種單糖在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，并且儀器具有較高的靈敏度。

表2 三種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 Standard curve equations，correlation coefficients，linear rangesand detection limits of the three monosaccharides

2.3.2 精密度

取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算各單糖色譜峰RSD值。數(shù)據(jù)表明，三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的峰面積RSD值分別為0.64%、0.85%和0.62%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性

取同一樣品待測(cè)液，分別在制備后0、3、6、9、12、24 h上機(jī)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各單糖色譜峰RSD值。數(shù)據(jù)表明，三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的峰面積RSD值分別為1.22%、1.06%和0.96%，說(shuō)明樣品待測(cè)液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.4 加樣回收率

取已知含量的羅望子多糖膠樣品水解液于具塞試管中，準(zhǔn)確加入一定量葡萄糖、木糖和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行衍生，平行制備6份，制得的待測(cè)液上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)公式回收率=(加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)/ 加標(biāo)量×100%，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的加樣回收率在100.33%～101.34%之間，RSD 值小于2.0%，說(shuō)明該分析方法準(zhǔn)確度良好。

表3 三種單糖的加樣回收率Table 3 Recovery rates of three monosaccharides

3 結(jié) 論

本研究建立 PMP柱前衍生化高效液相色譜法，同時(shí)檢測(cè)羅望子多糖膠中三種單糖葡萄糖、木糖和半乳糖的組成比例。以羅望子多糖膠為原料，經(jīng)硫酸水解、PMP衍生化后進(jìn)行單糖組成測(cè)定。結(jié)果表明樣品中同時(shí)含有葡萄糖、木糖和半乳糖三種單糖，組成分別為52.05%、20.03%和12.17%。實(shí)驗(yàn)表明，該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可滿足羅望子多糖膠中單糖組成分析和含量測(cè)定的要求，可為羅望子多糖膠的質(zhì)量控制提供分析方法和科學(xué)依據(jù)。