吳莉莉,曾今誠

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室,廣東東莞 5238082.東莞市大朗醫(yī)院檢驗科,廣東東莞523770)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是一種嚴重的腎臟相關(guān)并發(fā)癥,約40%的糖尿病患者存在此類并發(fā)癥[1]。據(jù)推測,DN患者的數(shù)量預(yù)計將隨著全球糖尿病患病率的上升而增加。到2046年,全球糖尿病患病率將升高至50%,全球糖尿病患者將從5.37億增加到7.83億[2]。目前,臨床上對DN的治療方式都需要長期隨訪和血糖調(diào)整,并不能從根本上治愈糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥,因此,尋求新的治療方法是非常迫切的。本文圍繞間充質(zhì)干細胞源性外泌體(mesenchymal stem cells-exosome,MSCs-exo)這一新的治療方法在DN中的自噬調(diào)節(jié)和治療潛力進行重點闡述,以期為臨床治療DN提供新的理論依據(jù)。

1 DN與MSCs-exo

糖尿病的臨床表現(xiàn)為持續(xù)高血糖和血脂的代謝紊亂,其會導(dǎo)致營養(yǎng)過剩并伴有明顯的腎細胞自噬抑制[2-4]。自噬是一種細胞內(nèi)溶酶體降解的過程,可降解受損的蛋白質(zhì)和細胞器以保持細胞穩(wěn)態(tài)[5-6]。自噬受損會加速DN的發(fā)生、發(fā)展[5,7-8],導(dǎo)致一系列腎臟病理損害。在早期糖尿病中,高血糖誘導(dǎo)的細胞內(nèi)應(yīng)激可能會激活自噬,這是作為細胞保護的代償反應(yīng)。然而,在晚期糖尿病中,營養(yǎng)感應(yīng)通路的持續(xù)紊亂壓倒性地抑制了腎臟中的自噬,最終導(dǎo)致自噬失調(diào)和DN的進展。因此,恢復(fù)自噬活性已成為保護腎臟免受糖尿病影響的新治療策略[9-11]。已有研究報道了多種藥物可通過調(diào)節(jié)細胞自噬治療DN,包括二甲雙胍、胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1,GLP1)受體激動劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑(renin angiotensin aldosterone system inhibitor,RAASi)、鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑、雷帕霉素、依維莫司和其他雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制劑等[5],它們都是通過降低血糖、炎癥和氧化應(yīng)激來恢復(fù)腎組織中的自噬平衡。但正如TANG等[9]所觀察到的,任何特定藥物的某些作用可能對同一組織中的某些過程有益,而對其他過程有害。最近一項臨床試驗表明,間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能為DN提供了一種新的治療方法[12],與安慰劑相比,接受MSCs治療的患者在18個月內(nèi)估算腎小球濾過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)的下降率明顯降低,而非腎小球最大濾過率(maximal glomerular filtration rate,mGFR)。研究發(fā)現(xiàn),MSCs主要通過細胞外囊泡的旁分泌途徑發(fā)揮作用,尤其是MSCs-exo,其通過涉及自主靶向性、抗凋亡、抗炎、抗氧化、抗纖維化作用和調(diào)節(jié)足細胞自噬的多種途徑保護腎臟免受損害[12-13]。以上可能是因為MSCs-exo具有獨特的生理特性,同時在體內(nèi)給藥過程中,機體免疫排斥低下,因此在臨床應(yīng)用治療中更具優(yōu)勢。

2 MSCs-exo與自噬

MSCs-exo內(nèi)含MSCs特異性蛋白質(zhì)、微RNA(microRNA,miRNA)、信使RNA(messenger RNA,mRNA)及其他小分子物質(zhì)等信號分子,可以通過胞吞或膜融合等方式將所含的特異性蛋白、脂質(zhì)、miRNA和mRNA等生物活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細胞中來調(diào)節(jié)細胞間的通信。MSCs-exo具有體積小、循環(huán)半衰期長、免疫原性低、滲透能力強和生物相容性好等特性,在多種人體疾病治療過程中都顯示出了重要的臨床應(yīng)用價值。

2.1 提高自噬水平

在正常情況下,細胞會發(fā)生基礎(chǔ)水平的自噬以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。在感染、創(chuàng)傷、缺氧、休克等應(yīng)激條件下,細胞還能通過自噬對細胞內(nèi)功能異常的細胞器進行降解和再循環(huán)以適應(yīng)各種壓力條件。據(jù)報道,持續(xù)的高血糖可通過增強細胞中的mTOR信號進一步抑制自噬,自噬相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1)的表達減低,進而導(dǎo)致細胞凋亡[14]。miR-122a可通過抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/mTOR通路誘導(dǎo)肝細胞自噬介導(dǎo)的細胞凋亡[15],但使用攜帶miR-122a的骨髓MSCs-exo治療糖尿病性心肌病小鼠后,小鼠心肌組織LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達水平升高,說明攜帶miR-122a的骨髓MSCs-exo可以提高糖尿病性心肌病小鼠的心肌細胞自噬能力[16]。研究表明,星形膠質(zhì)細胞源性外泌體通過靶向5′-單磷酸腺苷激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/mTOR信號誘導(dǎo)自噬,減少細胞凋亡[17]。此外,自噬抑制還會導(dǎo)致與衰老相關(guān)的肌肉萎縮,其特征是LC3和p62的積累。有研究表明,自噬標志物L(fēng)C3和p62在糖尿病小鼠的肌肉中積累,證實了自噬通量在糖尿病條件下受到抑制,而人臍帶MSCs-exo可抑制糖尿病相關(guān)的Atrogin1和MuRF1蛋白水平上調(diào),促進AMPK和人自噬啟動蛋白1(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)磷酸化,降低LC3和p62水平,表明外泌體可以增強AMPK/ULK1介導(dǎo)的自噬來減輕糖尿病和肥胖誘導(dǎo)的肌肉萎縮[18]。既往的一項研究發(fā)現(xiàn),單次或連續(xù)鞘內(nèi)輸注人臍帶MSCs-exo對神經(jīng)損傷引起的急性或慢性疼痛有明顯的治療效果[19]。人臍帶MSCs-exo富含miR-146a-5p,可通過負調(diào)控TRAF6,對鎮(zhèn)痛起到重要作用,提示人臍帶MSCs-exo可通過miR-146a-5p/TRAF6減輕炎癥性疼痛,增加自噬水平,抑制細胞凋亡。因此,外泌體可以增加自噬水平,達到治療疾病的效果。

2.2 抑制過度自噬

自噬是一種細胞內(nèi)分解代謝過程,在過量蛋白質(zhì)和衰老細胞器的降解和回收中起著重要作用,以清除受損和功能失調(diào)的細胞成分并維持機體穩(wěn)態(tài)[20]。不受控制的過度自噬會清除必要的蛋白質(zhì)和細胞器,從而導(dǎo)致自噬性細胞死亡并進一步加重器官損傷[21]。自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用,而過度自噬則導(dǎo)致細胞死亡[22]。李云瑩等[23]將骨髓MSCs-exo注射進大腦中動脈閉塞模型大鼠體內(nèi),結(jié)果表明骨髓MSCs-exo能夠改善大腦中動脈閉塞模型大鼠的過度自噬,明顯抑制大鼠體內(nèi)自噬標志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ及炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素(interleukin,IL)-6表達水平。張志強[24]研究發(fā)現(xiàn),人臍帶MSCs-exo可通過激活A(yù)MPK/ULK1信號通路抑制STZ聯(lián)合高脂高糖誘導(dǎo)的大鼠心肌過度自噬,減輕心肌肥厚,改善心功能。有研究證實,高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜色素上皮細胞的自噬被激活,表現(xiàn)為自噬體增加,LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達增加,而p62表達下降,用人臍帶MSCs-exo預(yù)處理后,自噬體減少,細胞LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達下降,自噬底物蛋白p62水平增加[25]。

3 外泌體在DN的自噬調(diào)節(jié)

3.1 外泌體上調(diào)自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene,ATG)

自噬的生物學(xué)涉及ATG和蛋白質(zhì)[8,26]。最新研究表明,ATG5及ATG5蛋白參與DN細胞自噬作用的調(diào)節(jié),高糖環(huán)境下細胞自噬作用的減弱將導(dǎo)致DN的發(fā)生、發(fā)展[27]。研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)與人臍帶MSCs-exo共培養(yǎng)時,人臍帶MSCs-exo可上調(diào)NRK-52E中ATG5和ATG7水平,進而增加LC3B和Beclin1等自噬蛋白的表達。此外,最新的研究指出,外泌體具有改善腺嘌呤誘導(dǎo)的腎病和減輕腎纖維化的潛力,包括上調(diào)長鏈非編碼RNA NBR-2、SNHG-7、AMPK、ULK-1、Beclin1、LC3、miR-29b、miR-181、Let-7b和Smad-7及下調(diào)miR-34a、Akt、mTOR、p62、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)、Smad-3和Coli-1的表達來改善腎臟病變,通過分泌miR-29b、miR-181和Let-7b來抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以減少腎組織中的細胞外基質(zhì)蛋白沉積,減少腺嘌呤誘導(dǎo)的腎損傷,并通過調(diào)節(jié)SNHG-7表達來增強腎臟自噬[28]。

3.2 外泌體對細胞自噬的相關(guān)通路的調(diào)節(jié)

自噬不足和過度都是有害的,因此,真核細胞中的自噬受到嚴格調(diào)節(jié),需要通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路適應(yīng)或抵消細胞應(yīng)激[9]。糖尿病中mTOR活性增加、AMPK和轉(zhuǎn)錄沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,Sirt1)表達減少可以抑制自噬,從而加重細胞功能障礙和DN的發(fā)生、發(fā)展[29],見圖1。

mTORC1:mTOR復(fù)合物1。

mTOR和AMPK是與自噬調(diào)控核心分子機制相關(guān)的兩個關(guān)鍵分子。mTOR整合了生長因子和調(diào)節(jié)細胞生長的營養(yǎng)信號[30],在自噬中起負調(diào)節(jié)作用,在糖尿病神經(jīng)病變中能被過度激活,且在足細胞凋亡和腎小球濾過率降低過程中起到關(guān)鍵作用。

mTOR復(fù)合物(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)有兩種形式,即mTORC1和mTORC2,其中對雷帕霉素敏感的是mTORC1。mTOR激活可抑制自噬體形成,其上游調(diào)節(jié)因子包括生長因子、胰島素水平、營養(yǎng)、代謝狀況和機械變化等。而AMPK則充當(dāng)該過程的上游調(diào)節(jié)因子[9]。在糖尿病條件下,高血糖會激活mTORC1并抑制AMPK和Sirt1。激活的mTOR(mTORC1)通過阻斷AMPK及其下游靶蛋白70核糖體蛋白S6激酶(70 kDa ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)激活ULK1,刺激核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成來抑制自噬。AMPK的抑制可阻斷Beclin1/B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)復(fù)合物的解離和ULK1的磷酸化,同時促進mTOR活性以減少自噬[29,31]。

3.2.1外泌體抑制mTOR活性增強自噬

一系列研究表明,誘導(dǎo)自噬在保護腎小管細胞(尤其是近端腎小管細胞)免受包括缺血在內(nèi)的多種應(yīng)激方面起著重要作用。腎小管細胞在腎組織中顯示出最高水平的mTORC1活性,這是由雷帕霉素敏感的S6磷酸化決定的,這表明在正常生理條件下,基礎(chǔ)自噬活性可能較低。與其他腎小球細胞相比,足細胞顯示出更高的自噬活性[32],也表現(xiàn)出更高的mTORC1活性。當(dāng)足細胞暴露于高血糖時,它們顯示出自噬活性和相關(guān)蛋白質(zhì)水平的降低,包括Beclin1和ATG5～12復(fù)合物[14]。研究發(fā)現(xiàn),骨髓MSCs可以通過外泌體遞送miR-143-3p靶向調(diào)控Beclin1/Bcl-2通路,上調(diào)高糖損傷小鼠足細胞后的自噬水平,減輕足細胞損傷,從而起到延緩DN進一步發(fā)展的作用[33]。JIN等[34]研究發(fā)現(xiàn),脂肪MSCs-exo可逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境導(dǎo)致的腎功能損害,抑制mTOR信號通路,增強自噬相關(guān)蛋白的表達,并進一步發(fā)現(xiàn)miR-486是逆轉(zhuǎn)過程中的關(guān)鍵因子,可降低Smad1的表達,增加細胞自噬作用,減少足細胞凋亡,由此猜測脂肪MSCs-exo是通過靶向調(diào)控miR-486/Smad1/mTOR信號通路以改善足細胞損傷。WANG等[27]研究發(fā)現(xiàn),人臍帶MSCs-exo對腎毒性大鼠模型有治療作用,其下調(diào)了磷酸化mTOR的表達,改變了下游靶標p70S6K、4EBP1和炎癥因子TNF-α的表達水平,促進了IL-1β、核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)-p65的分泌,由此可以推測人臍帶MSCs-exo可通過mTORC1通路介導(dǎo)的自噬來緩解大鼠腎臟損害。EBRAHIM等[35]研究證實,人臍帶MSCs-exo可通過mTOR途徑調(diào)節(jié)細胞自噬水平,上調(diào)LC3和Beclin1等自噬蛋白,并在電鏡下觀察到自噬小泡增加。治療后DN小鼠尿蛋白和血清肌酐下降,腎活檢可見腎小球系膜區(qū)擴張和纖維化等DN的腎臟病理改變減輕。因此,外泌體可以通過抑制mTOR通路進而增加自噬,從而達到緩解腎臟損害。

3.2.2外泌體上調(diào)AMPK表達增強自噬

與mTORC1相比,AMPK是響應(yīng)營養(yǎng)/能量消耗的自噬正向調(diào)節(jié)因子[36]。在1型和2型糖尿病的實驗?zāi)Ｐ椭?AMPK在腎臟中的活性都受到抑制,重要的是,這種抑制可以被幾種AMPK激活劑逆轉(zhuǎn),從而改善DN[37]。AMPK主要通過mTOR和ULK1的磷酸化來正向調(diào)節(jié)自噬過程[38]。激活后,AMPK抑制mTOR并激活ULK1,進而激活自噬[39]。AMPK對mTOR的抑制作用是通過直接磷酸化或通過結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物2(tubrous sclerosis complex 2,TSC2)蛋白的磷酸化,從而降低mTOR活性[40]。此外,在足細胞中觀察到的高基礎(chǔ)水平自噬主要受AMPK/ULK1軸而非mTOR通路的調(diào)節(jié),這表明AMPK激活自噬可能在腎臟中具有細胞類型依賴性[32]。此外,AMPK使Raptor磷酸化,導(dǎo)致mTORC1活性降低[41]。最后,AMPK活性導(dǎo)致細胞內(nèi)NAD水平增加,從而增加Sirt1活性。還有研究指出,AMPK的激活獨立于mTORC1活性刺激自噬[32]。在糖尿病條件下,芒果苷通過AMPK/mTOR/ULK1通路增強自噬,從而延緩了DN的發(fā)生、發(fā)展,并保護了足細胞[42]。最新的一項研究發(fā)現(xiàn),骨髓MSCs-exo改善了脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腎損傷,降低了炎性細胞因子的產(chǎn)生和細胞凋亡水平,增強了LC3Ⅱ/Ⅰ和p-AMPK的表達,同時降低了p62和p-mTOR的表達水平[43]。母乳MSCs-exo還可通過分泌抗纖維化miRNA來減少腺嘌呤誘導(dǎo)的腎損傷,并上調(diào)AMPK、Beclin1、LC3和下調(diào)miR-34a、Akt、mTOR等在腎臟中的表達,還通過調(diào)節(jié)SNHG-7的表達來增強腎自噬[28]。

3.2.3外泌體激活Sirt1信號通路增強自噬

Sirt是依賴NAD+的Ⅲ類組蛋白去乙?；?可在幫助細胞應(yīng)對氧化還原并在代謝應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。Sirt1已被證明可通過增強自噬來抑制高糖處理的腎小球系膜細胞中的細胞外基質(zhì)積累[44],且阻斷mTOR抑制的自噬也被證明可有效減輕DN腎小球系膜細胞中的炎癥、增殖和纖維化[45-46]。與AMPK類似,在DN患者和DN動物模型中,Sirt1的表達和活性在腎細胞中有所下降,同時Sirt1的激活可以保護腎臟免受糖尿病損傷[47]。有研究表明,在DN小鼠和高糖處理永生化的足細胞中,Sirt1下調(diào),其與預(yù)后不良相關(guān)。而Sirt1表達的下降,還會減弱Sirt1介導(dǎo)的下游自噬水平并加重足細胞損傷[10]。此外,最近的一項研究指出,人脂肪MSCs-exo可通過激活Sirt1信號通路改善腎小管間質(zhì)纖維化中周圍毛細血管丟失的情況[48]。在膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠中,脂肪MSCs-exo可能通過Sirt1信號通路起到腎臟保護作用[49]。

3.2.4外泌體增強PI3K/Akt通路誘導(dǎo)自噬

MSCs-exo抑制TGF-β1的分泌,從而減少上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,阻斷MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)的系膜細胞增殖,從而緩解腎纖維化[35]。CAI等[50]研究發(fā)現(xiàn),MSCs-exo富含的miR-125b可通過Akt信號通路誘導(dǎo)細胞自噬,從而抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的人胚胎腎上皮細胞凋亡。LI等[51]研究結(jié)果證實,臍帶MSCs-exo能抑制TGF-β1觸發(fā)的成纖維細胞轉(zhuǎn)分化和PI3K/Akt/MAPK信號通路介導(dǎo)的系膜細胞增殖,促進基質(zhì)金屬蛋白酶的表達,減少纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原的沉積,從而在DN中起到抗纖維化作用。因此,外泌體可以通過抑制或促進相關(guān)通路進而增加自噬從而緩解腎臟損害,見圖2。

圖2 外泌體改善DN的途徑

4 MSCs-exo對DN的治療

近年來MSCs-exo在DN中的自噬調(diào)節(jié)和治療潛力已取得某些進展(表1)。在體外細胞研究中,MSCs可通過外泌體途徑轉(zhuǎn)移到高糖處理的人足細胞,進而減輕足細胞的損傷[34,52-54]。還有研究發(fā)現(xiàn),MSCs-exo可抑制系膜細胞纖維化并減少細胞凋亡,同時還能干預(yù)線粒體功能障礙[55-56]。此外,在動物模型研究中,發(fā)現(xiàn)對糖尿病動物模型重復(fù)施用MSCs-exo可以減輕腎小球肥大,基底膜增厚和纖維化,以抑制DN的發(fā)生、發(fā)展[51,57]。靜脈注射MSCs-exo可以改善糖尿病動物的腎功能和組織學(xué)損傷。JIANG等[58]將尿源性干細胞外泌體(urine derived stem cells-exosome,USCs-exo)靜脈注射到鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的SD大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)USCs-exo可潛在地減少糖尿病大鼠的尿量和尿微量白蛋白的排泄,防止足細胞和腎小管上皮細胞凋亡,抑制半胱天冬酶-3過表達,促進腎小球內(nèi)皮細胞增殖。此外,USCs-exo在體外可以減少高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡。EBRAHIM等[35]發(fā)現(xiàn)在DN大鼠中注射外泌體可減少組織學(xué)損傷。外泌體緩解了腎小球基底膜彌漫性增厚和足突的廣泛融合和消失。GRANGE等[59]將骨髓MSCs-exo注射入DN小鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DN小鼠的尿白蛋白/肌酐明顯減少,血肌酐和血尿素氮水平明顯降低。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),MSCs-exo中富含的miRNA能夠作用于TGF-β、胰島素樣生長因子1、表皮生長因子受體和血小板衍生生長因子受體等纖維化相關(guān)的信號通路,下調(diào)促纖維化基因的表達,從而抑制DN模型的腎臟纖維化進程。JIN等[34]的體內(nèi)研究顯示,脂肪MSCs-exo可以通過對DN小鼠足細胞凋亡的保護作用明顯改善腎小球濾過屏障功能。這種作用伴隨著血肌酐、尿蛋白和尿素水平的降低,以及腎組織病理的緩解,包括腎小球系膜細胞過度增殖、系膜基質(zhì)積累和腎小球基底膜厚度。

表1 MSCs-exo作用于不同細胞、動物模型DN的治療效果

5 展 望

近年來,外泌體開始進入應(yīng)用領(lǐng)域,作為一種潛在的治療工具,MSCs-exo在DN的早期診斷和治療中表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。本文深入探討了MSCs-exo在DN中的自噬調(diào)節(jié)作用及治療潛力,這將有助于發(fā)現(xiàn)預(yù)防和治療DN的新靶點。然而,MSCs-exo使用劑量和動物模型尚無統(tǒng)一的標準,其療效需要在動物模型中進一步探索,并通過大型的臨床試驗加以論證。隨著進一步的研究,相信這些問題將逐步得到解決。