俞雯雯，康年松，岑迎東，王丹，傅厚道

1. 余姚市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 余姚 315400

2. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018

3. 寧波市第二醫(yī)院，浙江 寧波 315010

慢性淺表性胃炎（CSG）是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，可發(fā)展為慢性萎縮性胃炎（CAG），甚至存在癌變風(fēng)險[1-2]。臨床常通過胃黏膜保護(hù)制劑、質(zhì)子泵抑制劑等藥物治療CSG，但此類藥物長期使用會增加胃腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收、胃腸道黏膜增殖、骨代謝異常和感染等多種風(fēng)險[3]。胃復(fù)春（WFC）具有健脾益氣、活血解毒的功效，對治療CAG、胃十二指腸潰瘍、CSG等消化道疾病療效確切，且安全性良好[4-6]，但關(guān)于WFC 治療CSG 的具體生物學(xué)機(jī)制尚不明確。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討WFC治療CSG的作用機(jī)制，并運用分子對接技術(shù)進(jìn)行驗證，為后續(xù)WFC 治療CSG研究提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及潛在靶點獲取通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）及中藥綜合資源數(shù)據(jù)庫（TCMID）（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）收集WFC（紅參、香茶菜、枳殼）的主要成分，并以類藥性（DL）≥0.18%、口服利用度（OB）≥30%或OB 為HIGH、DL 為YES 為條件篩選出藥性較好的活性成分[7]，并通過Cytoscape 3.7.2繪制中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及SwissTargetPrediction 網(wǎng)站（www.swisstargetprediction.ch）搜索藥物活性成分對應(yīng)的靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行靶點信息比對和基因名校正，限定基因來源為人源性。

1.2 疾病相關(guān)靶點獲取通過檢索GeneCard 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）及OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org），以“Chronic Superficial Gastritis”為檢索詞進(jìn)行篩選。通過合并2個數(shù)據(jù)庫搜索得到的疾病靶點與藥物靶點進(jìn)行映射獲取交集靶點，利用韋恩在線網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）做交集靶點韋恩圖，采用Cytoscape3.7.2 軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化，構(gòu)建藥物-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建PPI，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，借助網(wǎng)絡(luò)分析工具，以選取連接度和結(jié)合分值為可視化參數(shù)，設(shè)置統(tǒng)計信息生成樣式為環(huán)形布局，作靶標(biāo)蛋白互作信息圖。借助Cyto NCA 插件中的Degree、Betweenness、Closeness 等參數(shù)篩選節(jié)點，將連接度大于等于2倍中位數(shù)的節(jié)點確定為核心靶點[8]。將核心靶點與對應(yīng)的化合物一一對應(yīng)，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 作圖，以連接度值為篩選條件，選取排位靠前的有效成分，得到WFC治療CSG的關(guān)鍵成分。

1.4 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO 和KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/）通路富集分析，獲取關(guān)鍵靶點的相關(guān)生物學(xué)信息，并利用R 軟件繪制氣泡圖。

1.5 活性成分和核心靶點分子對接從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲取靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)，篩選物種來源為人源，選擇方法為X射線，分辨率在2.50 ? 以下，下載靶蛋白PDB Format 文件；從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取成分化學(xué)結(jié)構(gòu)，并用Chem3d 軟件轉(zhuǎn)化為mol2 格式；利用SYBYL-X 2.1.1 軟件中的Surflex-Dock 對接程序?qū)械鞍着c成分進(jìn)行對接，以驗證成分-靶點之間的可能性。

2 結(jié)果

2.1 WFC 活性成分和潛在靶點獲取見表1、圖1。在TCMSP 及TCMID 中搜索WFC 活性成分，以DL≥0.18%、OB≥30%或OB 為HIGH、DL 為YES 為篩選條件，刪除重復(fù)項，共得到30 個活性成分，除去未搜索到靶點的化合物，最終得到25 個藥物活性成分（香茶菜主要成分OB 值及DL 值通過SwissADME 網(wǎng)站獲取，網(wǎng)址為www.swissadme.ch）。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及SwissTargetPrediction 網(wǎng)站共獲得519 個藥物潛在靶點，利用Cytoscape 3.7.2 繪制中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖。

表1 WFC主要活性成分

2.2 CSG 靶點獲取見圖2、圖3。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫里共找到896 個與CSG 相關(guān)基因，在OMIM 數(shù)據(jù)庫共找到88個相關(guān)基因。通過合并2個數(shù)據(jù)庫找到的CSG靶點與WFC活性成分潛在靶點進(jìn)行對比，利用韋恩在線網(wǎng)站尋找交集靶點，共得到137 個共同靶點。將WFC 活性成分與CSG 靶點交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2將結(jié)果可視化，并構(gòu)建WFC活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

圖2 韋恩圖

圖3 活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 核心靶點互作圖見圖4、圖5。將上述137 個交集靶點導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，構(gòu)建PPI。137 個目標(biāo)靶點存在復(fù)雜的相互作用，共有137 個結(jié)點，2 461 條邊，結(jié)點平均度值為35.9，結(jié)點度值的中位數(shù)為31，最大值為107，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，共得到WFC 治療CSG 的137 個靶點互作信息圖，設(shè)置度的篩選值為2 倍平均數(shù)值72 至最大值107，從交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點17 個，分別為白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、抑癌基因53（TP53）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、表皮生長因子受體（EGFR）、原癌基因（JUN）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、連環(huán)蛋白β 1（CTNNβ1）、雞肉瘤病毒基因（SRC）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、熱休克蛋白90α 型1（HSP90AA1）、缺氧誘導(dǎo)因子-1A（HIF1A）、環(huán)加氧酶2（PTGS2）等。根據(jù)度值大小，從核心靶點中篩選出10 個關(guān)鍵靶點，分別為IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1B、CASP3。根據(jù)蛋白與蛋白的Degree 值繪制17 個核心靶點節(jié)點的條形圖，將17 個核心靶點對應(yīng)化合物進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。結(jié)果顯示，以度值為篩選條件，前8 味成分為人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2）、柚皮素（Naringenin）、14-乙酰基-耐陰午茶菜素b（14-acetylumbrosin b）、β-谷甾醇（β-sitosterol），川陳皮素（Nobiletin）、胡麻黃素（Pedalitin）、亞甲基苯甲酸（Amethystoicacid）、橙皮素（Hesperetin）。

圖4 WFC靶標(biāo)蛋白互作信息圖

圖5 WFC有效成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 分析將137 個交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，并限定物種來源為人源，選擇標(biāo)記欄為 official gene symbol 進(jìn)行檢索，設(shè)定閾值以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01 為前提，確定了338 個GO 條目。見圖6。其中生物過程（BP）相關(guān)條目258 個，主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控等；分子功能（MF）相關(guān)條目49 個，主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、同類蛋白結(jié)合、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）結(jié)合等；細(xì)胞組分（CC）相關(guān)條目31 個，主要包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞核等，分別取前10 條進(jìn)行可視化分析。

圖6 GO分析

2.5 KEGG 通路富集分析見圖7。利用DAVID 平臺的KEGG通路富集分析功能對WFC與CSG的137個交集靶點在信號通路中的作用進(jìn)行分析，共得到166 條信號通路。根據(jù)FDR＜0.01篩選出141條信號通路。利用R-4.0.5 進(jìn)行KEGG 通路富集可視化分析，通過相應(yīng)通路基因數(shù)量、相應(yīng)通路基因占總體基因的比率和FDR 來衡量KEGG 富集程度，篩選并確定其中20 條最具統(tǒng)計意義的通路，發(fā)現(xiàn)WFC 作用于CSG的靶點常見通路有癌癥信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路等。

圖7 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果見圖8、圖9。利用Surflex-Dock 對接程序?qū)PI 網(wǎng)絡(luò)中排名前8 的關(guān)鍵成分（人參皂苷Rh2、柚皮素、14-乙?；?耐陰午茶菜素b、β-谷甾醇、川陳皮素、胡麻黃素、亞甲基苯甲酸、橙皮素）與排名前10的關(guān)鍵靶點（IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1β、CASP3）進(jìn)行分子對接。當(dāng)?shù)玫椒种翟酱?，表示配體與靶蛋白受體結(jié)合越穩(wěn)定，當(dāng)分值大于5 時說明分子與靶點有較好的結(jié)合活性，分值大于7 則說明分子與靶點的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的活性[9-10]。結(jié)果顯示，80 組分子對接平均分值為5.2，最高分值為11.8，表明篩選出的關(guān)鍵靶點與關(guān)鍵成分間具有較好的匹配度。

圖8 分子對接熱圖

圖9 部分活性成分-靶點分子對接模式圖

3 討論

CSG 是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，由細(xì)菌、病毒、幽門螺桿菌（Hp）感染等原因引起，癥狀表現(xiàn)為不同程度的食欲減退、消化不良、反胃、惡心嘔吐以及腹部不適等，嚴(yán)重影響患者日常生活。WFC 收載于《中華人民共和國藥典》[11]，由紅參、香茶菜、麩炒枳殼3味中藥組成，對治療CAG、胃十二指腸潰瘍等消化道疾病療效確切，且安全性良好[4]。本研究發(fā)現(xiàn)WFC 治療CSG 的主要有效成分有人參皂苷Rh2、柚皮素、14-乙酰基-耐陰午茶菜素b、β-谷甾醇、川陳皮素、胡麻黃素、亞甲基苯甲酸、橙皮素等。人參皂苷Rh2是一種四環(huán)三萜類皂苷單體，為紅參的主要有效成分之一，研究表明人參皂苷Rh2可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能及多種細(xì)胞因子分泌，又能抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。β-谷甾醇為紅參與枳殼的主要有效成分，其可降低Hp 感染的胃炎小鼠胃黏膜中Toll 樣受體2（TLR2）、磷酸化核因子κB 抑制蛋白α（p-IKBα）、磷酸化細(xì)胞核因子（NF-κB p65）、磷酸化κB抑制蛋白激酶α（IKK-α）蛋白表達(dá)水平，改善Hp 感染性胃炎小鼠炎癥和黏膜損傷，發(fā)揮胃保護(hù)作用[13]。川陳皮素為枳殼的有效成分之一，研究證實川陳皮素可以通過提高抗氧化活性及減少促炎細(xì)胞因子表達(dá)來發(fā)揮對乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性胃損傷的保護(hù)作用[14]。柚皮素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于枳殼等多種中藥中，具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化及抗癌功能，研究顯示，柚皮素對胃癌治療具有一定療效[15]。枳殼中的橙皮素與柚皮素同屬于黃酮類化合物，具有抗氧化和抗炎等多種生物學(xué)活性[16]。以上報道與本研究結(jié)果相互印證，表明運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究WFC 治療CSG 的分子機(jī)制具有一定科學(xué)性。

由PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知，WFC治療CSG的關(guān)鍵靶點有IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1β、CASP3 等，這些靶點主要與炎癥和免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)。AKT1 屬于蛋白激酶超家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長、凋亡和生存方面具有重要意義，且具有致癌作用[17]。IL-6 的表達(dá)與炎癥反應(yīng)、Hp 相關(guān)胃腸疾病發(fā)展息息相關(guān)，它不僅能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的募集，還能刺激產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[18]。TNF 是促進(jìn)Hp 感染、抑制胃酸分泌的關(guān)鍵性炎癥因子，也是介導(dǎo)CSG 發(fā)病的重要因子[19]。覃樂等[20]研究發(fā)現(xiàn)香茶菜能減少IL-1β、IL-18、IL-6、TNF 等炎癥因子的釋放。人參皂苷Rh2 可明顯降低IL-6、TNFα、IL-1β、一氧化氮合成酶（iNOS）和環(huán)氧化酶-抑制劑（COX2）表達(dá)，且對于引起炎癥的MAPK 和NF-κB 的磷酸化起到阻斷作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)CSG患者多伴有Hp感染，磷酸化AKT表達(dá)水平在Hp模型組中顯著升高[22]。VEGFA 也被稱為血管通透性因子，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)血管滲漏的能力，其誘導(dǎo)的血管通透性增強(qiáng)是其在炎癥和其他病理環(huán)境中發(fā)揮重要作用的基礎(chǔ)。綜上所述，WFC 可能通過多途徑、多靶點抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療CSG作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，WFC治療CSG的交集靶點主要富集在癌癥信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路等。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，癌癥信號通路涵蓋范圍較廣，與磷脂酰肌醇-3-激酶-蘇氨酸激酶（PI3K-Akt）、MAPK、核因子κB/STAT3（NF-κB/STAT3）信號通路等聯(lián)系密切，可引起基因組損傷，化療抵抗等反應(yīng)[23]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，CSG 與WFC 的交集靶點有42%存在于癌癥信號通路上，表明WFC 對CSG 的干預(yù)作用可能與癌癥信號通路息息相關(guān)。臨床發(fā)現(xiàn)CSG患者大多檢測出Hp陽性，Hp感染是非萎縮性胃炎向萎縮性胃炎發(fā)展，發(fā)生癌前病變和癌癥的重要因素[24-25]。臨床上Hp 感染慢性胃炎患者血清中TNF-α和IL-6水平升高，且血清中TNF-α和IL-6 表達(dá)水平與慢性胃炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn)隨著慢性胃炎病程的延長，Ⅱb 型早期胃癌的檢出率有上升趨勢[27]；刁卓等[28]研究表明TNF-α 在胃癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，并證明了胃癌中受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）/TNF-α 通路上調(diào)介導(dǎo)了程序性細(xì)胞壞死。TP53又被稱為p53，屬于抑癌基因，與抗炎活動有關(guān)，p53 可以顯著抑制小鼠原發(fā)性巨噬細(xì)胞 TNF-α 基因表達(dá)，降低血清TNF-α水平，發(fā)揮抗炎作用[29-30]。高尤亮[31]等研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)p53 的表達(dá)能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞凋亡，抑制TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，減輕胃黏膜癥狀。藥理研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2能通過抑制PI3K/AKT通路，激活p53 信號通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[32]。此外，Hp 感染不僅可以加劇脂質(zhì)代謝紊亂，促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊的形成，還可能加劇炎癥反應(yīng)和增加動脈粥樣硬化的發(fā)生率[33]。分子對接結(jié)果初步驗證了WFC 治療CSG 的可靠性，分子對接結(jié)果顯示，80 組分子對接平均分值為5.2，表明關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點具有一定的結(jié)合活性，其中，14-乙?；?耐陰午茶菜素b與STAT3的結(jié)合得分最高，具有重要的參考價值，可為后續(xù)進(jìn)一步開展相關(guān)中藥及成分研究提供數(shù)據(jù)支撐。

綜上所述，WFC 中人參皂苷Rh2、柚皮素、14-乙?；?耐陰午茶菜素b 等活性成分能夠作用于IL-6、TNF、AKT1、VEGFA 等靶點，調(diào)控癌癥信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號等治療CSG。