楊媛媛，唐語謙,2，楊繼國,2*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室河源分中心，廣東河源 517000）

琥珀是松柏科、云實(shí)科、南洋杉科等植物的樹脂，經(jīng)地質(zhì)作用而形成的有機(jī)混合物[1]，我國琥珀主要分布在遼寧、河南、廣西等地，在世界主要分布在波羅的海沿海國家。琥珀中主要含樹脂和揮發(fā)油[2]，加熱可散發(fā)出芳香的松香氣味。遠(yuǎn)古時(shí)代就有記載，琥珀可用作中藥材，治療偏頭痛、失眠、氣喘、高血壓、腫瘤等疾病，具有鎮(zhèn)驚安神、散瘀止血、利水通淋的作用[1,3,4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，琥珀因其抗氧化功能和美白功能被廣泛添加到藥品化妝品中[5]。但對(duì)琥珀精油的提取及活性研究一直鮮有報(bào)道。

精油是植物代謝過程中產(chǎn)生的次生代謝物，被稱為揮發(fā)油，具有強(qiáng)烈的感官特性和揮發(fā)性[6]。它們是從植物中提煉出的易揮發(fā)的油狀液體，可以來自植物的不同部位，如根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等[7]。植物精油具有濃郁的香氣，并且具有抗氧化[8,9]、消炎、抑菌[10,11]和抗病毒[12]等多種功效，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、美容、調(diào)香等領(lǐng)域，具有一定的研究價(jià)值[9,13]。隨著人們對(duì)健康、安全和天然產(chǎn)物的重視，科研人員也在積極研究更安全健康的天然產(chǎn)物。傳統(tǒng)的植物精油提取方法包括水蒸氣蒸餾、溶劑浸提和壓榨法[14]，常規(guī)方法操作簡單、成本低，但提取時(shí)間長且精油活性低，還容易殘留有機(jī)試劑。此外，它也會(huì)破壞精油中的活性成分，對(duì)精油的開發(fā)利用帶來不好的影響。近年來，超臨界流體萃取[15]和亞臨界流體萃取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物精油的提取，展現(xiàn)出了其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[16]。超臨界流體萃取是利用超臨界狀態(tài)下的流體作為溶劑進(jìn)行物質(zhì)提取，常用的超臨界流體是二氧化碳（CO2），萃取時(shí)需在超高溫和超高壓的條件下進(jìn)行，增加了設(shè)備成本和操作復(fù)雜性。超臨界CO2在一定條件下具有較低的選擇性，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物中特定成分的高效分離，其溶解性受溫度的影響較大，溫度的變化會(huì)對(duì)提取效果產(chǎn)生較大影響[17]。亞臨界流體萃取是一種利用處于亞臨界狀態(tài)的流體進(jìn)行物質(zhì)提取的方法，與超臨界流體萃取法相比，亞臨界流體萃取具有溫和的操作條件、更好的選擇性和提取效率以及低能耗等優(yōu)勢(shì)。亞臨界流體萃取法還可以選擇更廣泛的溶劑，如丁烷、丙烷、二甲醚等，相比于CO2，這些有機(jī)溶劑操作條件溫和，且具有更高的溶解性，能夠更好的分離精油[18]。

本研究采用亞臨界流體萃取法來提取琥珀精油，以琥珀精油得率為指標(biāo)，考察不同萃取條件對(duì)得率的影響，以期獲得亞臨界流體萃取法提取琥珀精油最佳工藝。同時(shí)通過GC-MS 技術(shù)分析琥珀精油的化學(xué)成分，并以 DPPH 自由基和ABTS+自由基的清除試驗(yàn)評(píng)價(jià)琥珀精油的抗氧化活性，以抑制酪氨酸酶活性的試驗(yàn)評(píng)價(jià)琥珀精油的美白功效，為琥珀精油的合理開發(fā)利用提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

波羅的海琥珀粉；無水乙醇（AR）、過硫酸鉀（AR）、正己烷（BR）：購自上海麥克林生化科技有限公司；酪氨酸酶（≥500 U/mg）、L-DOPA（≥99%）、熊果苷、DPPH（≥98%）、ABTS（≥98%）：購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

CBE-100L 型亞臨界萃取設(shè)備，河南亞臨界萃取技術(shù)有限公司；GCMS-QP2020 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；SpectraMax ix3 型多功能酶標(biāo)儀，美國 Molecular Devices 公司；BSA124S 型電子天平，塞利多斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亞臨界流體萃取琥珀精油

稱取琥珀粉末樣品置于亞臨界萃取罐中，關(guān)閉進(jìn)料口，打開真空泵使萃取罐內(nèi)壓力低于0.1 MPa，隨后通入亞臨界狀態(tài)下的丁烷進(jìn)行萃取，液料比為2:1（mL:g），在50 ℃、8.5 MPa 下萃取40 min，重復(fù)萃取2 次。萃取完畢后，精油和萃取劑一起進(jìn)入分離罐減壓氣化，氣化后的丁烷被壓縮液化供循環(huán)使用，精油則脫溶排出。

根據(jù)琥珀精油的質(zhì)量和琥珀粉末總質(zhì)量之比，計(jì)算琥珀精油得率。計(jì)算公式如下：

式中：

Y——琥珀精油得率，%；

m精油——琥珀精油的質(zhì)量，g；

m總——琥珀粉末總質(zhì)量，g。

1.3.2 亞臨界萃取琥珀精油工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）液料比對(duì)琥珀精油得率的影響

稱取1 kg 琥珀粉末，通入液化的丁烷作萃取劑，液料比設(shè)定1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1（mL:g）5個(gè)水平，在8.5 MPa、50 ℃條件下萃取40 min，萃取2 次，計(jì)算琥珀精油得率，確定最佳液料比。

（2）萃取溫度對(duì)琥珀精油得率的影響

稱取1 kg 琥珀粉末，通入液化的丁烷作萃取劑，液料比為2:1（mL:g），萃取溫度分別設(shè)定為40、50、60、70、80 ℃，在8.5 MPa 下萃取40 min，萃取2 次，計(jì)算琥珀精油得率，確定最佳萃取溫度。

（3）萃取時(shí)間對(duì)琥珀精油得率的影響

稱取1 kg 琥珀粉末，通入液化的丁烷作萃取劑，液料比為2:1（mL:g），在8.5 MPa、50 ℃條件下分別萃取20、30、40、50、60 min，萃取2 次，計(jì)算琥珀精油得率，確定最佳萃取時(shí)間。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，選取液料比（A）、萃取溫度（B）、萃取時(shí)間（C）作為變量，得率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，具體試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.3 琥珀精油化學(xué)成分分析

（1）樣品制備

參照 Qader 等[19]的方法制備樣品：稱取0.1 g 琥珀精油，用適量正己烷溶解并定容至100 mL，制備成1 mg/mL 的溶液，過膜備用。

（2）GC-MS 分析條件

色譜條件：色譜柱為 SH-Rxi-5Sil-MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱。升溫程序：柱溫 50 ℃，以 5 ℃/min 升溫至 310 ℃，保持10 min。汽化室溫度 250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；載氣流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間 3.0 min。

質(zhì)譜條件：電子能量 70 eV 的 EI 離子源；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度 280 ℃；掃描范圍 40～800m/z。

（3）質(zhì)譜分析

通過氣相色譜-質(zhì)譜分析，結(jié)合 NIST 14s.lib譜庫檢索，利用保留指數(shù)對(duì)琥珀精油中的主要組分進(jìn)行定性分析，并通過色譜峰面積歸一化法對(duì)其中的主要組分進(jìn)行相對(duì)定量。

1.3.4 抗氧化能力測(cè)定

1.3.4.1 琥珀精油對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照崔歆卬等[20]的方法，并加以改進(jìn)：準(zhǔn)確稱取3.94 mg DPPH 粉末溶于無水乙醇，配置成0.1 mmol/L的DPPH 溶液，避光保存?zhèn)溆?。將琥珀精油配制成質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL 的琥珀精油乙醇溶液，另配制2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg/mL 的Vc 乙醇溶液作陽性對(duì)照，以無水乙醇做陰性對(duì)照。

準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品100 μL 于96 孔板中，迅速加入100 μL DPPH 溶液混合均勻，25 ℃避光反應(yīng)30 min 后，于波長517 nm 處測(cè)量吸光度，平行三次試驗(yàn)取平均值。計(jì)算DPPH 自由基清除率和半數(shù)抑制濃度IC50：

式中，

E——DPPH 自由基清除率，%；

As——樣品反應(yīng)液的吸光度值；

As′——精油樣品與無水乙醇混合后的吸光度值；

Ac——無水乙醇與DPPH 溶液混合后的吸光度值。

1.3.4.2 琥珀精油對(duì)ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參照賈盟盟[21]等的方法，并加以改進(jìn)：配制7 mmol/L ABTS 溶液和4.9 mmol/L K2S2O8溶液，二者等體積混合，置于暗處12～16 h 即配置成ABTS儲(chǔ)備液，然后用無水乙醇稀釋，在734 nm 波長下調(diào)整ABTS 反應(yīng)液的吸光度為0.70±0.02。將琥珀精油配制成濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mg/mL 的琥珀精油乙醇溶液，另配制2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg/mL 的Vc 乙醇溶液作陽性對(duì)照，以無水乙醇做陰性對(duì)照。

準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品100 μL 于96 孔板中，迅速加入200 μL ABTS 溶液混合均勻，25℃避光反應(yīng)6 min 后，于波長734 nm 處測(cè)量吸光度，平行三次試驗(yàn)取平均值。計(jì)算ABTS+自由基清除率和和半數(shù)抑制濃度IC50：

式中，

H——ABTS+自由基清除率，%；

As——樣品反應(yīng)液的吸光度值；

As′——精油樣品與無水乙醇混合后的吸光度值；

Ac——無水乙醇與ABTS 反應(yīng)液混合后的吸光度值。

1.3.5 琥珀精油抑制酪氨酸酶活性的測(cè)定

1.3.5.1 酪氨酸酶的抑制率

參照董雪等[22]的方法，并加以改進(jìn)：用DMSO稀釋琥珀精油，使其質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，備用。準(zhǔn)確稱取酪氨酸酶和L-DOPA，用pH 值6.8 的磷酸緩沖溶液溶解并配置成50 U/mL 的酪氨酸酶溶液和1.5 g/L 的L-DOPA 溶液，以L-DOPA為底物。

在96 孔板中加入50 μL 精油樣品和50 μL 濃度為50 U/mL 的酪氨酸酶溶液，同時(shí)加入100 μL 的磷酸緩沖溶液（pH 值6.8），將 96 孔板置于孔板振蕩器中震蕩均勻，并于37℃下保溫10 min。隨后在每孔中加入質(zhì)量濃度為1.5 g/L 的L-DOPA 溶液，再次置于孔板振蕩器中震蕩均勻，并于37℃下保溫30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔在475 nm 處的吸光度。同時(shí)以磷酸緩沖溶液（pH值6.8）做空白對(duì)照，以熊果苷做陽性對(duì)照。平行三次試驗(yàn)，取平均值。根據(jù)公式計(jì)算琥珀精油樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率：

式中，

R——酪氨酸酶抑制率，%；

A——PBS+酪氨酸酶+精油+L-DOPA 的吸光度值；B——PBS+精油+L-DOPA 的吸光度值；

C——PBS+酪氨酸酶+L-DOPA 的吸光度值；

D——PBS+L-DOPA 的吸光度值。

1.3.5.2 酪氨酸酶的抑制類型

在上述測(cè)定體系中，將酪氨酸酶的活性固定為50 U/mL，改變底物L(fēng)-DOPA 的濃度，依次為 0.5、1、1.5、2 mmol/L。分別測(cè)定酪氨酸酶在質(zhì)量濃度為0、500、1 000、1 500 μg/mL 的琥珀精油下的酶反應(yīng)速率。根據(jù)米氏方程[23]，以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法來獲得酶抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而判斷琥珀精油對(duì)酪氨酸酶的抑制類型。米氏方程公式為：

式中，

Km——米氏常數(shù)；

[S]——底物濃度；

Vm——最大反應(yīng)速率。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS Statistics 26 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用 Origin 2023 進(jìn)行處理，每組實(shí)驗(yàn)設(shè) 3 個(gè)平行組。響應(yīng)面試驗(yàn)選用 Design-Expert 10.0.6 軟件中的 Box-Behnken 法進(jìn)行分析。氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)合 NIST 14s.lib 譜庫檢索，結(jié)合保留指數(shù)對(duì)主要組分進(jìn)行定性分析，采用歸一法進(jìn)行相對(duì)定量分析，結(jié)果用 Microsoft Excel 匯總。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）液料比

從圖1 可以看出，隨著丁烷添加量的增大，琥珀精油的得率也逐漸增加。當(dāng)液料比在1:1～2:1（mL:g）范圍內(nèi)增大時(shí)，琥珀精油的得率增速較快；液料比在2:1（mL:g）時(shí)，琥珀精油得率達(dá)到1.28%，此時(shí)繼續(xù)增加丁烷的添加量，琥珀精油得率仍逐漸增加，但增幅卻大大減小。當(dāng)液料比為 2.5:1（mL:g）和 3:1（mL:g），琥珀精油得率分別為 1.31% 和1.32%，與液料比為 2:1（mL:g）的得率無明顯提高。一般來說，溶劑用量越大，提取物質(zhì)的得率越大，但當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定值后，精油已基本提取完全，此時(shí)繼續(xù)增加溶劑量，不會(huì)提高得率，并且浪費(fèi)溶劑和能源[24]。綜合考慮精油得率和萃取劑的回收問題，選擇2:1（mL:g）的液料比最為合適。

圖1 液料比對(duì)琥珀精油得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on amber essential oil yield

（2）萃取溫度

萃取溫度對(duì)琥珀精油得率的影響如圖2 所示，當(dāng)溫度在40～60 ℃內(nèi)升高時(shí)，琥珀精油得率隨之呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；萃取溫度為60 ℃時(shí)，精油得率最高，達(dá)到1.45%。這是因?yàn)樘岣咻腿囟饶艽龠M(jìn)分子的運(yùn)動(dòng)加快，增加溶質(zhì)的揮發(fā)和擴(kuò)散，從而提高萃取的效率。但是溫度從60 ℃增加到80℃時(shí)，精油得率反而隨著溫度的升高而降低，這可能是因?yàn)檫^高的溫度造成一些熱敏成分被分解破壞，使萃取率出現(xiàn)降低的情況[25]。因此綜合考慮生產(chǎn)能耗問題，將琥珀精油的亞臨界流體萃取溫度確定為60 ℃。

圖2 萃取溫度對(duì)琥珀精油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on amber essential oil yield

（3）萃取時(shí)間

由圖3 可知，隨著萃取時(shí)間的增長，萃取率整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)萃取時(shí)間從30 min 增加到50 min 時(shí)，琥珀精油得率隨之顯著提高，從0.78%提高至1.28%；當(dāng)萃取時(shí)間在50 min 后，琥珀精油得率基本保持不變，不再有顯著變化；萃取60 min 后，精油萃取率出現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，聶韡等[26]在研究萃取時(shí)間對(duì)亞臨界萃取紫茉莉籽油的影響也出現(xiàn)相同趨勢(shì)，在60 min 后得率增速減緩，趨于平衡。這是因?yàn)橛椭谳腿┲羞_(dá)到平衡需要一定的時(shí)間[27]，繼續(xù)延長萃取時(shí)間不能明顯提高精油得率，還會(huì)造成能耗增加，延長工序，因此最佳萃取時(shí)間選擇為50 min。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)琥珀精油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on amber essential oil yield

（4）萃取次數(shù)

由圖4 可以看出，隨著萃取次數(shù)的增加，琥珀精油提取率呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)萃取次數(shù)在1～3 次時(shí)，琥珀精油提取率隨萃取次數(shù)增加而顯著上升；3 次之后，繼續(xù)增加萃取次數(shù)，提取率增幅大大減小，幾乎保持不變。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本和經(jīng)濟(jì)效益，最終選擇3 次為最佳萃取次數(shù)。

圖4 萃取次數(shù)對(duì)琥珀精油得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on amber essential oil yield

2.2 亞臨界流體萃取琥珀精油響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了三因素三水平試驗(yàn)方案。響應(yīng)變量Y 為得率，響應(yīng)因素A 為液料比，B 為萃取溫度，C 為萃取時(shí)間，結(jié)果見表2。

2.2.2 建立回歸模型及方差分析

根據(jù)表2 的結(jié)果，利用Design-Expert 13 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，所得回歸方程為：Y=1.60+0.039 4A-0.016 5B+0.038 1C-0.038 3AB+0.006 5AC-0.041 7BC-0.166 4A2-0.077 2B2-0.227 9C2。

由表3 中得結(jié)果可知，回歸模型P值＜ 0.000 1，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.732 5，表現(xiàn)為不顯著，說明回歸模型良好。另外得出模型的決定系數(shù)R2=0.993 1，調(diào)整后決定系數(shù)RAdj2=0.984 2，表示回歸模型與預(yù)測(cè)值之間的擬合度好，在試驗(yàn)條件范圍內(nèi)能明確反映琥珀精油得率的變化，因此可以利用上述方程模型對(duì)亞臨界最優(yōu)萃取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)中A、C，交互項(xiàng)中AB、BC 以及二次項(xiàng)中A2、B2、C2均表現(xiàn)出極顯著差異 (P＜ 0.01)，由F值大小可判斷出3 個(gè)單因素對(duì)琥珀精油得率的影響順序?yàn)锳（液料比）＞C（萃取時(shí)間）＞B（萃取溫度）；交互項(xiàng)影響大小為BC＞AB＞AC；二次項(xiàng)影響大小為C2＞A2＞B2。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table 3 The variance analysis for Response surface model

2.2.3 兩因子交互作用

等高線圖和響應(yīng)面圖是兩種用于分析兩個(gè)因素之間交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的方法。在等高線圖中，如果兩個(gè)因素之間的交互作用較弱，則等高線更接近圓形；如果交互作用較強(qiáng)，則等高線更接近橢圓形。在響應(yīng)面圖中，如果曲面較陡峭，則響應(yīng)值的變化幅度較大，表明兩個(gè)因素之間的交互作用較強(qiáng)[28]。對(duì)比圖5 至圖7 可以看出，液料比（A）與萃取時(shí)間（B）交互作用的等高圖接近圓形，而液料比（A）與萃取溫度（C）、萃取時(shí)間（B）與萃取溫度（C）的等高圖呈橢圓形，說明三個(gè)因素之間的交互作用對(duì)亞臨界流體萃取琥珀精油得率的影響程度依次為：BC＞AB＞AC。

圖5 不同質(zhì)量濃度琥珀精油 (a) 和Vc (b) 對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 Concentration effects of antioxidant-DPPH radical reactions for amber essential oil (a) and Vc (b)

圖5 琥珀精油揮發(fā)性化學(xué)成分的總離子流圖Fig 5 Total ion chromatogram of the volatile chemical components of amber essential oil

圖5 液料比與萃取溫度交互作用的響應(yīng)面圖和等高圖Fig.5 Response surface and contour diagrams of the interaction of solid-liquid ratio and extraction temperature

2.2.4 最優(yōu)組合和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過模型預(yù)測(cè)，得到亞臨界流體萃取琥珀精油的最佳工藝條件為液料比2.07（mL/g）、萃取溫度58.33 ℃、萃取時(shí)間50.97 min，在此工藝條件下琥珀精油的提取率為1.61%。結(jié)合實(shí)際操作情況，將最優(yōu)方案調(diào)整為液料比2.1（mL/g）、萃取溫度58 ℃、萃取時(shí)間51 min，在上述條件組合下平行三次試驗(yàn)，得到琥珀精油的得率為1.62%，與預(yù)測(cè)值相近，表明該模型達(dá)到預(yù)期效果，具有可行性。

2.3 琥珀精油化學(xué)成分分析

從圖5 中可以看出，亞臨界流體萃取得的琥珀精油揮發(fā)性成分GC-MS 分析總離子流色譜圖共檢測(cè)出40 個(gè)峰，經(jīng)譜庫對(duì)比分析后，共有30 種有效成分被確認(rèn)。為了更準(zhǔn)確地分析琥珀精油揮發(fā)性成分，采用面積歸一法進(jìn)行定量處理，所得各成分的結(jié)果詳見表4。

表4 琥珀精油成分分析表Table 4 Component analysis of amber essential oil

從亞臨界萃取的琥珀精油中共鑒定出30 種化學(xué)物質(zhì)，大多數(shù)為萜類化合物，包括倍單萜類12種、半萜類9 種、二萜類3 種，其相對(duì)百分含量分別為74.45%、7.38%、4.93%。單萜類物質(zhì)主要包括對(duì)傘花烴（29.39%）、左旋龍腦（18.02%）、葑醇（8.46%）、左旋樟腦（7.12%）、桉葉油醇（6.40%）；倍半萜類化合物主要包括反-菖蒲烯（1.11%）、喇叭茶醇（2.38%）；二萜類化合物主要為脫氫松香醇（2.52%）、西松烯（1.95%）。其他萜類化合物相對(duì)百分含量均小于1%。除了萜類化合物，亞臨界流體萃取的琥珀精油中還有一小部分芳香類、醛類和酮類物質(zhì)，主要有1,1,-(1,10-癸烷二基)二(十氫萘)（2.76%）、α-紫羅蘭酮（2.02%）、13-異丙基羅漢松-8,11,13-三烯-19-醛（1.56%），其余化合物的相對(duì)百分含量均小于1%。程松等[29]研究結(jié)果表明，采用水蒸氣蒸餾法制取的琥珀揮發(fā)油中主要化學(xué)成分是倍半萜類化合物及其衍生物，包括斯巴醇（16.635%）、氧化石竹烯（12.927%）、咕巴烯（7.858%）、馬兜鈴烯環(huán)氧化物（5.819%）、欖香烯（5.710%）和石柱烯（4.203%）等，經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，亞臨界流體萃取所得琥珀精油的高沸點(diǎn)組分及其含量明顯高于水蒸氣蒸餾法制取的琥珀精油，如左旋龍腦、葑醇、桉葉油醇等物質(zhì)。導(dǎo)致琥珀精油化學(xué)成分產(chǎn)生差異可能是因?yàn)樘崛》椒ú煌部赡芤驗(yàn)槭晴戤a(chǎn)地不同。總之，琥珀精油成分的復(fù)雜性為琥珀資源的進(jìn)一步合理開發(fā)利用帶來了一定的優(yōu)勢(shì)。還有研究表明[30]，植物樹脂的化學(xué)成分以單萜、倍半萜、二萜、三萜等多種萜類化合物為特征。單萜和倍半萜類化合物大部分為揮發(fā)性和芳香性化合物，從而形成精油組分。從成分分析結(jié)果來看，亞臨界萃取琥珀精油中單萜類物質(zhì)的相對(duì)百分含量最高，說明琥珀精油的香氣成分主要來源于單萜類化合物。

2.4 琥珀精油抗氧化能力分析

2.4.1 琥珀精油對(duì)DPPH自由基的清除能力

1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基極其穩(wěn)定，在波長515 nm 處有強(qiáng)吸收峰，可用來評(píng)估抗氧化物的供氫能力[31]。當(dāng)抗氧化劑與穩(wěn)定的DPPH自由基發(fā)生反應(yīng)，其顏色從深紫色變?yōu)闇\黃色，褪色的強(qiáng)度表明了游離抗氧化劑的自由基清除活性。因此可以通過定量測(cè)定反應(yīng)前后溶液在515 nm 處的吸光度大小，進(jìn)而評(píng)價(jià)其抗氧化活性。由圖5 可見，琥珀精油和Vc 都具有清除DPPH 自由基的能力。在精油質(zhì)量濃度為2～20 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著琥珀精油濃度的增大，DPPH 自由基的清除率逐漸上升，呈現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系；在Vc 質(zhì)量濃度為2～20 μg/mL 內(nèi)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率則呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)。根據(jù)IC50計(jì)算，琥珀精油和Vc 清除 DPPH 自由基的 IC50值分別為12.66 mg/mL和 2.51 μg/mL。結(jié)果表明，在一定濃度下，琥珀精油具有較強(qiáng)的 DPPH 自由基清除能力，但是與陽性對(duì)照Vc 對(duì)比仍有一定差距。

Chi 等[32]指出抗氧化活性化合物單萜（莰酮γ-松油烯）、芳樟醇和石竹烯被證明是精油具有抗氧化能力的主要原因。也有研究報(bào)道[33]了在DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)中，三種萜類化合物由強(qiáng)至弱的順序?yàn)闄幟氏ⅵ?松油醇、γ-萜品烯。結(jié)合琥珀精油化學(xué)成分分析，琥珀精油中的萜類化合物是其清除DPPH 自由基能力的主要原因，萜類、芳香類、醛類等化合物的共同作用也對(duì)其抗氧化活性做出貢獻(xiàn)。

2.4.2 琥珀精油對(duì)ABTS+自由基的清除能力

ABTS+自由基，即2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，如果與過二硫酸鉀反應(yīng)，可以生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS+.，該自由基在734 nm有最大吸收峰[34]。若反應(yīng)體系的吸光度降低，則說明該物質(zhì)具有自由基清除活性，因此可以通過測(cè)定反應(yīng)體系的紫外吸光度大小變化，來反映物質(zhì)的抗氧化能力。

由圖6 可以看出，在精油質(zhì)量濃度為2～10 mg/mL范圍內(nèi)，隨著琥珀精油質(zhì)量濃度的增大，ABTS+自由基清除率逐漸增大；精油質(zhì)量濃度大于10 mg/mL 時(shí)，ABTS+自由基清除率達(dá)到94.7%以上，隨后變化則趨于平緩；Vc 對(duì)ABTS+自由基的清除率也是隨著質(zhì)量濃度增大呈現(xiàn)先上升后平緩的趨勢(shì)，在其質(zhì)量濃度為8 μg/mL 是，清除率達(dá)到97.36%。根據(jù)IC50計(jì)算，琥珀精油和 Vc 清除 ABTS+自由基的 IC50值分別為2.91 mg/mL 和 2.06 μg/mL。上述結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)琥珀精油對(duì)ABTS+自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且但仍弱于Vc 的清除能力。

圖6 不同質(zhì)量濃度琥珀精油 (a) 和Vc (b) 對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Concentration effects of antioxidant-ABTS+ radical reactions for amber essential oil (a) and Vc (b)

圖6 液料比與萃取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高圖Fig.6 Response surface and contour diagrams of the interaction of solid-liquid ratio and extraction time

2.5 琥珀精油抑制酪氨酸酶活性的測(cè)定

2.5.1 酪氨酸酶的抑制率

黑色素是由多種酶共同作用形成的，其中酪氨酸酶占主導(dǎo)作用[35]。酪氨酸酶可以將L-酪氨酸羥基化為3,4-二羥基苯基-L-丙氨酸（L-DOPA），并進(jìn)一步將L-DOPA 氧化為多巴醌，多巴醌容易聚合并與胞內(nèi)蛋白作用，從而生成黑色素物質(zhì)[36]。因此，可以通過測(cè)定樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率來判斷其美白活性[37,38]。

琥珀精油對(duì)酪氨酸酶的抑制率如圖7 所示。隨著質(zhì)量濃度在0.5～2.5 mg/mL 內(nèi)逐漸增大，琥珀精油和熊果苷對(duì)酪氨酸酶的抑制率也逐漸增大，呈現(xiàn)較好的劑量關(guān)系。在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，琥珀精油和熊果苷對(duì)酪氨酸酶的抑制率分別達(dá)到了68.6%和79.8%，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力。從圖中可以看出，同等質(zhì)量濃度下，琥珀精油對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力強(qiáng)于熊果苷。因此，琥珀精油作為天然美白成分值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

圖7 琥珀精油對(duì)酪氨酸酶的抑制率Fig.7 Inhibition rate of amber essential oils on tyrosinase

圖7 萃取溫度與萃取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖和等高圖Fig.7 Response surface and contour diagrams of the interaction of extraction temperature and extraction time

2.5.2 酪氨酸酶的抑制類型

琥珀精油對(duì)酪氨酸酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)分析如圖8 所示，不同濃度琥珀精油的曲線相交于第二象限x 軸上的一點(diǎn)，隨著精油濃度的逐漸增大，橫截距不變，縱截距隨之增大，符合非競爭性抑制的特征。因此判斷琥珀精油對(duì)酪氨酸酶的抑制類型為非競爭性抑制，即在酶反應(yīng)過程中，琥珀精油可能與酪氨酸酶的非活性部位結(jié)合來抑制其活性，或是與底物結(jié)合成絡(luò)合物進(jìn)行作用，精油和底物之間并不存在競爭作用。根據(jù)米氏方程式可以算出，在不同濃度的琥珀精油下，Km的值保持不變?yōu)?0.281。

圖8 琥珀精油對(duì)酪氨酸酶的抑制類型Fig.8 Types of inhibition of tyrosinase by amber essential oil

3 結(jié)論

本文探究了亞臨界萃取琥珀精油的工藝條件、成分分析以及抗氧化活性。以琥珀精油得率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出最佳的提取條件為：液料比為2.1（mL/g）、萃取溫度為58 ℃、萃取時(shí)間為51 min、萃取次數(shù)為3 次，在此條件下，琥珀精油的得率為1.62%。通過GC-MS分析，亞臨界萃取的琥珀精油共鑒定出30 種化合物成分，可以分為單萜類、倍半萜類、二萜類、芳香類、酮類和醛類化合物，其中傘花烴（29.39%）和左旋龍腦（18.02%）的含量最高，這兩種化合物可能是琥珀精油香氣成分的主要來源。琥珀精油對(duì)DPPH 自由基和ABTS+自由基有較強(qiáng)的清除作用，IC50值分別為12.66 mg/mL 和2.91 mg/mL。酪氨酸酶活性抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，琥珀精油對(duì)酪氨酸酶的抑制屬于非競爭性抑制，IC50值為1.13 mg/mL，其美白活性高于同等濃度的熊果苷。相關(guān)研究表明[39]，植物精油的化學(xué)組成被認(rèn)為是其抗氧化能力的重要組成部分。因此琥珀精油的功能活性可能主要與其含量較高的萜類化合物有關(guān)，也是萜類、酯類、醇類等多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果。

本試驗(yàn)首次采用亞臨界流體萃取技術(shù)提取琥珀精油，并采用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了分析，并研究了其抗氧化活性和美白活性，為琥珀資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，可以用作抗氧化劑和天然美白劑應(yīng)用于食品、日化和醫(yī)藥領(lǐng)域。