戚仁潔，寧宇，劉靜，劉之洋，徐海，羅志丹，陳龍正

基于轉錄組測序的苦瓜皂苷合成相關基因的鑒定和分析

1江蘇海洋大學藥學院/江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室/江蘇省海洋藥物化合物篩選重點實驗室，江蘇連云港 222005；2江蘇海洋大學/江蘇海洋生物產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222005；3江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014

【目的】皂苷是苦瓜果實苦味的主要來源，具有降血糖、抗癌等多種藥用價值。鑒定和挖掘參與調控苦瓜皂苷生物合成的代謝通路及基因，為進一步深入解析苦瓜皂苷形成的分子機制提供參考?！痉椒ā恳钥喙细叽越幌礕K24為試驗材料，分別在子房期（T1）、幼果期（T2）、商品果期（T3）和完全成熟期（T4）取果實組織，通過香草醛-冰醋酸法測定不同時期的苦瓜皂苷含量，利用轉錄組測序的方法鑒定差異表達基因?！窘Y果】從T1到T4，苦瓜內源皂苷含量隨著果實發(fā)育而呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。轉錄組測序共鑒定到17 504個基因，在T1-vs-T2、T2-vs-T3和T3-vs-T4三組比較中，下調表達基因數(shù)量均高于上調表達基因數(shù)量。GO富集分析表明含磷復合物代謝過程、驅動蛋白復合體和2-琥珀酰-6-羥基-環(huán)己二烯-1-羧酸合成酶活性分別是生物過程、細胞組分及分子功能模塊最顯著富集的條目。KEGG分析顯示全局與概述圖譜、碳水化合物代謝和氨基酸代謝是3組比較中共同的最顯著富集的代謝通路。根據(jù)表達模式可將基因劃分為20個模塊，其中profile 0中基因的表達量從T1到T4逐漸降低，與苦瓜果實發(fā)育過程中皂苷含量變化規(guī)律一致。從profile 0中鑒定出與苦瓜皂苷生物合成相關的基因14個，包括萜類骨架生物合成通路上的基因、、、、和，倍半萜與三萜生物合成途徑中的基因、和及后修飾酶基因、、及。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）結果與RNA-seq結果一致。【結論】苦瓜果實中皂苷含量隨著果實不斷成熟而逐漸降低?？喙显碥丈锖铣墒紫韧ㄟ^上游的萜類骨架生物合成（ko00900）代謝途徑完成萜類皂苷骨架的積累，隨后通過倍半萜與三萜生物合成（ko00909）代謝途徑以及下游的氧化還原酶、糖基轉移酶的修飾最終生成皂苷，本研究通過轉錄組測序共鑒定到14個與苦瓜皂苷生物合成相關的基因。

苦瓜；轉錄組；差異表達基因；皂苷；合成調控

0 引言

【研究意義】苦瓜為葫蘆科苦瓜屬一年生草本植物，藥食兼用，在我國華南地區(qū)廣泛種植[1]?，F(xiàn)代化學成分和藥理學研究表明，苦瓜中主要富含多糖、多肽、皂苷、黃酮、酚類等物質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎和免疫保護等多種藥理作用[2]。其中，皂苷是苦瓜主要活性成分之一，具有降血糖、抗癌等藥用價值[3]。因此，挖掘苦瓜皂苷生物合成的相關基因，揭示苦瓜皂苷合成調控的分子機理，對提高苦瓜藥用價值具有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M展】皂苷是植物中普遍存在的一類化合物，是由皂苷元加上一個或多個糖基構成。根據(jù)皂苷水解后生成皂苷元的結構，可分為三萜類與甾體類皂苷[4]。近年來，從不同種類苦瓜的各類組織中提取到的皂苷種類超過40種，如從種子中分離苦瓜皂苷A、B、C、D和E[5]，其中大部分皂苷為四環(huán)三萜類的葫蘆烷型[6]?？喙系目辔吨饕獊碜云潴w內的多種葫蘆烷型三萜化合物，也稱為葫蘆素類化合物[7]，目前已被證明具有苦味的為苦瓜皂苷元類的MomordicinesⅠ和Ⅱ[8]以及苦瓜皂苷Momordicoside K和L[9]。與其他葫蘆科作物苦味物質相比，苦瓜苦味物質的特點是無毒性和可食性。植物中三萜類化合物的生物合成過程[10]是首先通過甲羥戊酸途徑（mevalonate，MVA）或者2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑（2-C-methl-Derythritol-4- phospate，MEP）生成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），IPP與異構化的二甲烯丙基焦磷酸（iimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）在法尼基焦磷酸合酶（farnyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PS）的催化下形成法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP），隨后通過角鯊烯合酶（squalene synthase，SS）、角鯊烯環(huán)氧化酶（squalene monooxygenase，SM）的催化形成2,3-氧化角鯊烯（2,3- oxidosqualene，OS）。OS在氧鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclases，OSCs）的催化下形成三萜類化合物的基本骨架，隨后進一步在各種氧化還原酶、糖基轉移酶、甲基轉移酶和?；D移酶等的修飾下形成三萜類皂苷[11]。隨著“下一代”測序技術（next-generation sequencing，NGS）的不斷進步，轉錄組測序技術（RNA sequencing，RNA-seq）憑借著高通量的特點在快速鑒定生物體特定狀態(tài)下的全局轉錄本上發(fā)揮著重要作用。目前，RNA-seq技術已經廣泛應用于藥用植物活性成分的代謝通路鑒定和次生代謝關鍵酶基因的挖掘[12]，如海南龍血樹[13]、總序天冬[14]、西藏延齡草[15]等已通過RNA-seq技術解析了活性成分甾體皂苷的生物合成途徑并鑒定到相關的合成基因[16]?！颈狙芯康那腥朦c】苦瓜皂苷合成是由多基因控制的復雜的生物學過程，目前，尚未見相關基因的報道，具體的分子調控機理也不明晰。【擬解決的關鍵問題】以苦瓜高代自交系GK24為試驗材料，對其果實形成過程中4個不同發(fā)育階段（子房期、幼果期、商品果期和完全成熟期）進行皂苷含量測定及高通量轉錄組測序分析；通過比較，挖掘與苦瓜皂苷生物合成相關的通路及基因。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗于2023年在江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所進行，試驗材料為本課題組保存的苦瓜高代自交系GK24。分別在子房期（T1，開花前1 d）、幼果期（T2，授粉后7 d）、商品果期（T3，授粉后15 d）及完全成熟期（T4，授粉后25 d，果皮變黃，種子成熟）取果實作為樣品。每棵苦瓜單株上取3個果實作為一個生物學重復，試驗共設置3次重復。樣品采摘后迅速放入液氮中進行速凍，隨后放入超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)的苦瓜皂苷含量測定及轉錄組分析。

1.2 苦瓜皂苷提取及含量測定

苦瓜樣品首先進行冷凍干燥，粉碎后過80目篩得到干粉。準確稱取苦瓜干粉600 mg，分別置于100 mL三角錐形瓶中，加入30 mL 75%乙醇溶液，用保鮮膜封住瓶口，在60 ℃、頻率40 kHz、功率400 W條件下超聲震蕩1 h，超聲結束后冷卻至室溫，溶液用布氏漏斗抽濾，收集濾液，再次重復上述步驟。將兩次收集到的濾液，在68℃、100 MPa條件下減壓蒸去乙醇后，加甲醇溶解定容至25 mL容量瓶中，即得苦瓜皂苷待測溶液[17]。

苦瓜皂苷含量測定采用香草醛-冰醋酸法[18]。稱取人參皂苷Rg1標準品20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解定容，得標準品溶液（2 mg?mL-1）。將標準品溶液依次稀釋，分別取40、80、120、160和200 μL于試管中，各加0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，混勻，封口，65 ℃水浴加熱20 min，冰浴冷卻15 min，各加冰醋酸溶液5 mL，搖勻，于546 nm處測定吸光度。以樣品質量濃度（mg?mL-1）為橫坐標，以吸光度（Abs）為縱坐標進行分析，繪制標準曲線，求得回歸方程：=28.576+0.0008。準確吸取苦瓜T1、T2、T3、T4的待測樣品溶液200 μL于10 mL試管中，同標準曲線制作方法，在最大吸收波長處測定吸光度。通過標準曲線計算對應的質量濃度。

1.3 RNA提取、cDNA文庫構建及轉錄組測序

利用TRIzol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取苦瓜樣品總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的降解和污染程度。使用Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，CA，USA）檢測RNA的濃度、純度和完整性。質量合格的RNA使用NEB Next Ultra RNA Library Prep Kit試劑盒（NEB #7530，MA，USA）構建cDNA文庫。12個cDNA文庫在Illumina Novaseq6000平臺上進行測序，該工作委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.4 差異表達基因鑒定與功能注釋分析

對原始數(shù)據(jù)進行質量控制，過濾掉接頭和低質量的reads，獲得高質量的clean reads。使用HISAT2軟件將獲得的clean reads比對到苦瓜參考基因組上[19]。以每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段（FPKM）值為指標，用RSEM軟件檢測基因和轉錄表達水平。使用DEseq2軟件進行差異表達分析，將FDR＜0.05且|log2(fold change)|＞1的基因作為顯著差異基因（DEGs）。對DEGs進行GO富集和KEGG分析，將-value≤0.05的GO和KEGG通路看作是顯著富集的通路。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

從轉錄組結果中選取顯著差異表達并且在與三萜化合物合成相關的代謝通路上的候選基因，進行qRT-PCR檢測，驗證轉錄組數(shù)據(jù)的可靠性。以為內參基因，利用Primer 3.0軟件設計各基因特異的qRT-PCR引物（表1）。反應體系為20 μL：cDNA模板1 μL，2×ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，加ddH2O補至20 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性120 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。每組樣品設置3次重復。

表 1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 不同成熟期苦瓜皂苷含量變化

T1時期皂苷含量最高，為0.355 mg/100mg，T4時期皂苷含量最低，為0.035 mg/100mg（圖1）。從T1時期至T4時期，苦瓜皂苷含量隨著果實發(fā)育進程呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，不同時期間含量差異顯著（＜0.05）。

2.2 轉錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Illumina Novaseq 6000平臺對4個時期（T1、T2、T3和T4）的苦瓜進行轉錄組測序，共獲得99.71 Gb數(shù)據(jù)。對得到的raw reads進行過濾，去除接頭序列、未知序列及低質量序列，獲得clean reads（表2）。統(tǒng)計結果顯示各樣品Q30均大于91.96，GC%含量介于46.30%—47.30%。將clean reads比對到苦瓜三代參考基因組上，發(fā)現(xiàn)所有樣品的比對率均大于95.88%，其中單一比對序列的比例均大于92.75%，表明測序質量較高，可用于后續(xù)的分析。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

2.3 樣本相關性分析

對4個時期的苦瓜果實樣品轉錄組數(shù)據(jù)進行PCA分析，結果顯示，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）可分別解釋71%和16%的方差，累計貢獻率達到了87%，能夠較好地解釋苦瓜轉錄表達差異。由圖2還可以看出，同時期樣品聚集在一起，而不同時期樣品則明顯分離，表明樣品組內重復性好且組間差異明顯，證明數(shù)據(jù)較為可靠，可以用于進一步比較分析。此外，還發(fā)現(xiàn)T2和T3兩個時期的樣品關系較為接近，而與T1和T4的差異比較明顯。

圖2 轉錄組數(shù)據(jù)的主成分分析圖

表2 轉錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.4 差異表達基因（DEGs）的鑒定與分析

通過轉錄組測序共鑒定到17 504個基因，其中有12 787個在苦瓜4個生長時期中共同表達，而在T1、T2、T3和T4每一個時期特異表達的基因分別有527、165、191和419個（圖3-A）。以FDR＜0.05且|log2FC|＞1為標準，通過比較相鄰兩個時期分析苦瓜果實在生長發(fā)育過程中的變化和差異（圖3-B）。在T1-vs-T2組中，共鑒定到5 048個DEGs，其中上調表達的2 396個，下調表達的2 652個。在T2-vs-T3組中，共鑒定到3 626個DEGs，其中上調表達的1 649個，下調表達的1 977個。在T3-vs-T4組中，共有7 127個基因差異表達，其中上調表達的2 156個，下調表達的4 971個。此外，發(fā)現(xiàn)在每一組比較中下調的DEGs數(shù)目均高于上調的DEGs數(shù)目。

A：差異表達基因韋恩圖；B：不同時期上調和下調差異表達基因數(shù)目

2.5 差異表達基因的GO富集分析

為深入了解苦瓜果實發(fā)育過程中DEGs的主要生物學功能，本研究對DEGs進行了GO富集分析，主要分為生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）3個功能大類，包含63個功能亞類（圖4）。

圖4 苦瓜果實不同發(fā)育時期的GO功能熱圖

在生物過程中，3組比較的DEGs均主要富集在甘油磷脂代謝、含磷化合物代謝、氧化應激反應、脂質生物合成、二磷酸核苷代謝和細胞壁大分子代謝過程。多糖定位功能、MAP激酶活性的調節(jié)、心皮形態(tài)發(fā)生、發(fā)育細胞生長、DNA生物合成等過程主要在T1-vs-T2時期顯著富集，而苯丙氨酸代謝、糖苷代謝、黃嘌呤代謝和胞嘧啶C-5甲基化等過程則特異地富集在T3-vs-T4時期。在細胞組分中，基驅動蛋白復合體是三組比較中均顯著富集的過程。在分子功能中，三組比較的DEGs均主要富集在酸性硫醇連接酶活性和2-丁?；?6-羥基-2,4-環(huán)己二烯-1-羧酸合酶活性上。此外，微絲運動活性、肌動蛋白結合、離子結合和鎂原卟啉-6-甲基轉移酶活性主要在T1-vs-T2時期顯著富集，而乙酰輔酶A C-酰基轉移酶活性、十二碳烯?；鵆oA-delta異構酶活性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）活性、葡糖醛酸基轉移酶活性和三烷基锍水解酶活性等則特異地富集在T3-vs-T4時期。

2.6 差異表達基因的KEGG通路分析

本研究利用KEGG數(shù)據(jù)庫對苦瓜果實發(fā)育過程中DEGs參與的代謝通路進行了注釋和分析。在代謝類的通路中，DEGs最顯著地富集在全局與概述圖譜中，3組比較分別富集了581、460和910個DEGs，隨后依次是碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、脂質代謝（lipid metabolism）等。萜類化合物和聚酮類化合物的代謝（metabolism of terpenoids and polyketides）在T1-vs-T2、T2-vs-T3和T3-vs-T4三組比較中分別鑒定到61、56和83個差異表達基因（圖5）。此外，在環(huán)境信息處理類的通路中，信號轉導通路也顯著富集，3組比較分別鑒定到122、80和159個差異表達基因。

圖5 苦瓜果實不同發(fā)育時期差異表達基因的KEGG富集

2.7 表達趨勢分析

為區(qū)分基因在苦瓜果實發(fā)育過程中不同的表達趨勢，本研究利用STEM軟件將基因按照表達模式共分為20個不同的模塊（圖6）。Profile 0中共有基因2 548個，均呈連續(xù)下調趨勢，而profile 19則包含1 194個基因，從T1至T4呈連續(xù)上調表達的趨勢。由于profile 0中的基因表達趨勢與苦瓜果實生長過程中皂苷含量變化規(guī)律相吻合，因此，將profile 0中的2 548個基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對。結果顯示（表3），2 548個基因中有597個在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到注釋，主要顯著富集在核糖體、同源重組、DNA復制和氨基酸生物合成等通路上。值得注意的是，Profile 0中與皂苷類化合物生物合成相關的代謝途徑萜類骨架生物合成（ko00900）也顯著富集（=0.0173777），共包含14個基因。

圖6 苦瓜果實不同發(fā)育時期基因表達趨勢圖

表 3 Profile 0中顯著富集的代謝通路

2.8 苦瓜皂苷合成相關基因的鑒定

根據(jù)現(xiàn)有研究，與三萜皂苷生物合成相關的代謝通路主要包括萜類骨架生物合成（ko00900）和倍半萜與三萜生物合成（ko00909）。本研究中，profile 0中分別有14和4個基因富集在這兩條途徑上（表4）。其中，甲羥戊酸途徑（MVA途徑）中共鑒定到7個基因，分別為乙酰輔酶A乙酰轉移酶基因（，evm.TU.chr4.352）、HMG-CoA合成酶基因（，evm.TU.chr4.378）、甲羥戊酸激酶基因（，evm.TU.chr8.4201）、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因（，evm.TU.chr9.3672）、磷酸甲羥戊酸激酶基因（，evm.TU.chr10.2918、evm.TU.chr6.363）和法尼基焦磷酸合酶1基因（，evm.TU.chr1.608），這些基因的表達量從T1到T4時期均呈現(xiàn)逐漸下調的趨勢。此外，從甲基赤蘚醇磷酸途徑（MEP途徑）中鑒定到1個編碼1-脫氧-D-酮糖5-磷酸還原異構酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase，DXR）基因（evm.TU.chr6.140），其表達量也隨著果實發(fā)育過程而逐漸下調。倍半萜與三萜生物合成通路中的基因位于苦瓜皂苷合成途徑中游，其中的關鍵酶基因如角鯊烯合成酶（，evm.TU.chr2.1021）、角鯊烯環(huán)氧酶（，evm.TU.chr8.588）、葫蘆烷二烯合酶（，evm.TU.chr7.10）的表達量也隨著果實發(fā)育進程而逐漸降低。此外，在下游途徑還鑒定到4個三萜骨架后修飾基因，分別為CYP450（cytochrome P450）家族中的（evm.TU.chr10.601）（evm.TU.chr3.3014）和UDP糖基轉移酶（UDP glycosyltransferases，UGTs）家族中的（evm.TU.chr9.3663）（evm.TU.chr1.2272），從T1到T4時期這4個基因表達量也呈逐漸下調趨勢（圖7）。

表4 Profile 0中ko00900和ko00909通路中的基因

熱圖表示不同發(fā)育時期基因的FPKM值，顏色越紅，數(shù)值越高；從左到右樣本依次為T1、T2、T3和T4

2.9 qRT-PCR驗證RNA-seq數(shù)據(jù)可靠性

為驗證轉錄組結果的準確性，本研究選取了在萜類骨架生物合成（ko00900）和倍半萜與三萜生物合成（ko00909）中9個與苦瓜皂苷合成相關的基因進行qRT-PCR驗證。結果顯示，萜類骨架生物合成（ko00900）通路中的法尼基焦磷酸合酶I（farnesyl pyrophosphate synthase I，）、甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，）和磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase，），倍半萜與三萜生物合成（ko00909）通路中的葫蘆烷二烯合酶（cucurbitadienol synthase，）和角鯊烯環(huán)氧酶（squalene monooxygenase1，）及三萜骨架后修飾基因、及的表達量從T1到T4呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，與RNA-seq結果基本一致（圖8）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)這些皂苷合成相關基因的表達趨勢與苦瓜皂苷含量的變化趨勢相一致，均隨著果實發(fā)育過程而逐漸降低。

圖8 qRT-PCR驗證苦瓜皂苷合成相關基因的表達

3 討論

3.1 苦瓜皂苷含量隨著果實發(fā)育呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢

苦瓜皂苷是苦瓜苦味的主要來源，為了明確苦瓜皂苷在果實發(fā)育過程中的合成規(guī)律，本研究測定了子房期、幼果期、商品成熟期和種子成熟期等4個關鍵時期的皂苷含量，結果表明苦瓜果實中皂苷生物合成作用會隨著發(fā)育過程逐漸減弱，這也為苦瓜皂苷的提取與利用提供了參考依據(jù)，即苦瓜果實采收宜早不宜晚。在其他藥用植物中也存在與本研究類似的結果，如在西洋參花蕾4個發(fā)育時期中（現(xiàn)蕾期、發(fā)展期、成熟期、開花期），現(xiàn)蕾期的總皂苷含量最高，而隨著西洋參花蕾的不斷發(fā)育，總皂苷含量降逐漸低[20]。然而，造成這一現(xiàn)象的原因尚不清楚，推測可能與果實成熟過程中部分次生代謝物會向種子轉運和積累有關。

3.2 苦瓜三萜類皂苷生物合成相關基因的鑒定

本研究發(fā)現(xiàn)每兩個相鄰時期的下調基因數(shù)目均高于上調基因數(shù)目，這也部分說明苦瓜果實成熟過程中某些生物合成作用是逐漸減弱的。而在其他植物中也存在著類似的現(xiàn)象。番茄果實的轉色期與綠熟期相比，上調表達基因為2 057個，下調表達基因為4 480個，而紅熟期與轉色期相比獲得4 587個DEGs，其中2 042個上調，2 545個下調，隨著番茄果實的不斷成熟，下調基因多于上調基因[21]。在辣椒果實成熟過程中，花后35 d辣椒果實和花后16 d辣椒果實相比，17.27%的基因上調表達，而82.73%的基因則下調表達[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)profile 0中的基因從T1到T4表達量呈現(xiàn)逐步降低的趨勢，與皂苷含量變化規(guī)律相一致，推測該模塊中的基因可能與苦瓜皂苷生物合成相關。進一步發(fā)現(xiàn)萜類骨架生物合成和倍半萜與三萜生物合成通路可能與苦瓜皂苷三萜類化合物合成相關，并從中鑒定到9個關鍵酶、10個差異表達基因。植物三萜類化合物主要是通過MVA和MEP途徑合成三萜類化合物骨架，隨后經過不同關鍵修飾酶修飾形成不同結構類型的三萜類化合物。在苦瓜果實發(fā)育過程中，萜類骨架生物合成MVA途徑的、、、、、，倍半萜與三萜生物合成通路中的、等基因的表達豐度呈逐漸下降的趨勢，而MEP途徑中的1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶（1-Deoxyxylulose 5-phosphate Synthase，）、2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉移酶（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cysteine transferase，）、4-(5'-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶（4-(5'-Cytidine pyrophosphate) -2-C-methyl-D-erythritol kinase，）、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)焦磷酸合成酶（2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclic pyrophosphate synthase，）和4-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（4-hydroxy-2- methyl-2-E-buten-4-pyrophosphate reductase，）等基因的表達模式與苦瓜皂苷含量變化規(guī)律不一致（圖7），因此，推測苦瓜三萜類皂苷骨架生物合成以MVA途徑為主。

3.3 苦瓜三萜類皂苷生物合成通路的預測

植物三萜皂苷生物合成過程十分復雜，包含20余步酶促反應[23]。首先通過MVA和MEP途徑生物合成三萜類化合物骨架，隨后經過葫蘆素合成酶（CPQ）、細胞色素P450酶和糖基轉移酶等關鍵修飾酶修飾形成不同結構類型的三萜類皂苷[23]，因此，鑒定關鍵合成酶與修飾酶對解析皂苷生物合成代謝通路十分重要。例如，通過對115份黃瓜核心種質進行全基因組關聯(lián)分析（GWAS）鑒定到1個與葉片苦味緊密連鎖的SNP位點，該位點變異導致編碼的2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶（OSC）第393位的氨基酸從半胱氨酸變?yōu)槔野彼?，葉片從苦變成不苦[24]。研究發(fā)現(xiàn)OSC與西葫蘆中發(fā)現(xiàn)的葫蘆素合成酶（CPQ）的同源性高達80%[25]。羅漢果甜苷是在藥用植物羅漢果果實中發(fā)現(xiàn)的葫蘆烷型四環(huán)三萜皂苷[26]，其生物合成途徑可以分為3個過程，首先通過MVA或MEP途徑生成異戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；其次，在一系列酶的催化下生成2,3-氧化鯊烯，2,3-氧化鯊烯在葫蘆二烯醇合酶的作用下生成葫蘆二烯醇；隨后，葫蘆二烯醇在細胞色素P450酶家族中的CYP87D18[27]和糖基轉移酶家族中的UGT720-269-1和UGT94-289-3的作用下[28]依次形成羅漢果醇和羅漢果苷。五加科植物人參中的人參皂苷主要以達瑪烷型三萜皂苷為主，達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷的共同前體是2,3-環(huán)氧鯊烯，首先通過達瑪烯二醇合酶（dammarenediol-Ⅱ synthase，DS）催化生成達瑪烯二醇（dananediol，DM），隨后在細胞色素P450酶（CYP450）的作用下生成原人參二醇（protopanaxadiol，PPD）和原人參三醇（protopanaxatriol，PPT），最后通過糖基轉移酶（UGT）進行糖基化修飾[29]。

植物三萜類化合物和三萜皂苷的合成有著共同的前體合成途徑，但具有高度特異性和多樣性的后修飾作用，從而使不同植物中最后的三萜皂苷產物形成都有各自的規(guī)律[30]。參考植物三萜皂苷合成通路[31-33]，本研究對苦瓜三萜皂苷可能的生物合成途徑進行了推測：苦瓜三萜類皂苷合成主要通過甲羥戊酸途徑，以乙酰輔酶A（acetyl-CoA）為起始底物，經過HMG-CoA合成酶HMG1（evm.TU.chr4.378）、甲羥戊酸激酶MVK（evm.TU.chr8.4201）、磷酸甲羥戊酸激酶PMK（evm.TU.chr10.2918，evm.TU.chr6.3631）、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶MVD2（evm.TU.chr9.3672）等一系列關鍵酶的催化作用反應生成異戊烯焦磷酸（IPP），IPP在香葉基焦磷酸合成酶（GPS）的作用下經過縮合生成香葉基焦磷酸（GPP），GPP在法尼基焦磷酸合酶1（FPS1）的催化下再加入第2個IPP單元生成法尼基焦磷酸（FPP），2個FPP經角鯊烯合成酶SS12（evm.TU.chr2.1021）縮合形成鯊烯，隨后在角鯊烯環(huán)氧酶SQE1（evm.TU.chr8.588）的作用下環(huán)氧化生成2,3-氧化鯊烯，通過船式構象形成同分異構體，在葫蘆烷二烯醇合酶CPQ（evm.TU.chr7.10）的調控下生成葫蘆烷二烯醇。

葫蘆烷二烯醇是葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的骨架，經過氧化還原酶、甲基轉移酶、?；D移酶和糖基轉移酶等多種修飾酶的調控，最終形成苦瓜四環(huán)三萜類皂苷。其中最常見的氧化還原酶為CYP450（cytochrome P450）家族，對骨架結構進行氧化還原作用，引入羥基、醛基、羧基及環(huán)氧基團等，為進一步的其他修飾奠定基礎，因此，CYP450的氧化作用往往發(fā)生在其他修飾作用之前。本研究也鑒定到了2個CYP基因，分別為和，其表達隨著果實發(fā)育進程呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，推測其參與了苦瓜葫蘆烷二烯醇的后修飾過程。苦瓜皂苷的形成需要經過糖基化修飾，因此，UDP糖基轉移酶（UDP glycosyltransferases，）在這一過程中發(fā)揮著重要作用。Kim等[34]通過轉錄組測序技術對MeJA誘導人參毛狀根培養(yǎng)物的轉錄組進行了分析，篩選出與人參皂苷生物合成相關的差異表達UGTs基因和等。本研究中也鑒定到2個UGT基因（和），其表達量從T1到T4呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，與苦瓜皂苷含量變化規(guī)律一致，推測其可能參與了苦瓜三萜類皂苷的合成。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)苦瓜皂苷含量隨著果實發(fā)育成熟而呈現(xiàn)下降的趨勢。通過轉錄組分析共鑒定到17 504個基因，按照表達模式將這些基因分成20個模塊，其中profile 0中基因的表達趨勢與苦瓜皂苷含量變化規(guī)律相一致，進一步從中鑒定到14個與萜類化合物合成相關的基因，分別為萜類骨架合成通路中的、、、、和，倍半萜與三萜生物合成通路中的、和以及后修飾基因、、及。基于上述鑒定到的基因，初步預測了苦瓜皂苷合成可能的調控通路。

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Identification and Analysis of Genes Related to Bitter Gourd Saponin Synthesis Based on Transcriptome Sequencing

1College of Pharmacy/Jiangsu Key Laboratory of Marine Biological Resources and Environment/Jiangsu Key Laboratory of Marine Pharmaceutical Compound Screening, Jiangsu Ocean University, Lianyungang222005, Jiangsu;2Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology/Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, Jiangsu;3Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences /Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014

【Objective】As the main source of bitterness in bitter gourd fruit, saponin possesses various medicinal values including hypoglycemic and anticancer properties. This paper aimed at identifying the metabolic pathways and genes involved in the regulation of bitter gourd saponin biosynthesis, so as to provide the theoretical basis for further analysis of the molecular mechanism of bitter gourd saponin formation.【Method】Using the bitter gourd high-generation inbred line GK24 as the test material, fruit tissues were sampled at the ovary stage (T1), young fruit stage (T2), commodity fruit stage (T3), and maturity fruit stage (T4). The saponin content of bitter gourd at different periods were determined by the vanillin-glacial acetic acid method, and the differentially expressed genes (DEGs) were identified using the method of transcriptome sequencing. 【Result】From T1 to T4, the endogenous saponin content of bitter gourd showed significant decrease with fruit development. A total of 17 504 genes were identified by transcriptome sequencing, and the number of down-regulated genes was higher than that of up-regulated genes in the comparison of the three groups of T1-vs-T2, T2-vs-T3, and T3-vs-T4. GO enrichment analysis showed that phosphorus-containing complex metabolic process, kinesin complex and 2-succinyl-6-hydroxy-cyclohexadiene-1-carboxylic acid synthetase activity were the most significantly enriched terms in biological process, cellular component and molecular function, respectively. KEGG analysis showed that global and overview mapping, carbohydrate metabolism, and amino acid metabolism were the most significantly enriched pathways in all three comparative groups. The genes could be categorized into 20 profiles based on their expression patterns. Genes in profile 0 gradually decreased from T1 to T4, showing similar pattern of saponin content changes with bitter gourd fruit development. 14 genes related to bitter gourd saponin biosynthesis were identified from profile 0, including,,,,, and,, andin the sesquiterpene and triterpene biosynthesis pathway, and the postmodifying enzyme genes,,and. The results of RNA-seq were validated by qRT-PCR method.【Conclusion】The saponin content of bitter gourd decreased with the fruit development. Bitter gourd saponin was synthesized through the terpenoid bone biosynthesis (ko00900) metabolic pathway to accumulate terpenoid saponin skeleton in the first, and then produce saponins through the sesquiterpene and triterpene biosynthesis (ko00909) metabolic pathway and the modification of oxidoreductase and glycosyltransferase successively. A total of 14 genes related to the saponin biosynthesis of bitter gourd have been identified in the present study.

bitter gourd; transcriptome; differentially expressed genes; saponin; regulation of synthesis

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.012

2023-09-29；

2023-12-18

國家自然科學基金（32102392）、江蘇省重點研發(fā)計劃（Be2022339）、江蘇省自然科學基金（BK20200279）、江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX(21)3027）

戚仁潔，E-mail：13956705571@163.com。寧宇，E-mail：20190022@jaas.ac.cn。戚仁潔和寧宇為同等貢獻作者。通信作者羅志丹，E-mail：lzd@jou.edu.cn。通信作者陳龍正，E-mail：longzhengchen@qq.com

（責任編輯 趙伶俐）