紀(jì)楨 李曉洲 王秀艷 劉藍(lán)澤 孟凡榮 琚端

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81901502）；天津市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（?？疲┙ㄔO(shè)項(xiàng)目（TJYXZDXK-031A）

作者單位：1天津市第五中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（郵編300450）；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科遺傳與產(chǎn)前診斷中心；3天津市女性生殖健康與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

作者簡(jiǎn)介：紀(jì)楨（1983），女，住院醫(yī)師，主要從事婦科常見病、婦科內(nèi)分泌疾病相關(guān)研究。E-mail：54623948@qq.com

△通信作者 E-mail：saijd@163.com

摘要：目的 應(yīng)用低深度全基因組拷貝數(shù)變異分析（CNV-seq）技術(shù)研究胚胎染色體異常在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）及偶發(fā)流產(chǎn)（SA）中的差異。方法 采集158例RSA患者（RSA組）和244例SA患者（SA組）的流產(chǎn)組織進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)，對(duì)可疑染色體異常的夫婦進(jìn)行高分辨外周血染色體核型檢測(cè)。結(jié)果 402例樣本中有2例檢測(cè)失敗，檢測(cè)成功率99.5%（400/402）。共檢測(cè)出染色體異常238例（59.5%），包括染色體數(shù)目異常212例（89.1%），致病性拷貝數(shù)變異25例（10.5%），單親二倍體1例（0.4%）。RSA組和SA組總體染色體異常、非整倍體、三倍體發(fā)生率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RSA組致病性拷貝數(shù)變異在染色體異常中的構(gòu)成比顯著高于SA組（P＜0.05）。高分辨外周血核型分析檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)4例平衡易位攜帶者。35～39歲年齡段中SA組胚胎染色體異常率高于RSA組（P＜0.05）。2組早期流產(chǎn)中胚胎染色體異常率均明顯高于中期流產(chǎn)；早期流產(chǎn)中，SA組的流產(chǎn)組織（POC）染色體異常率高于RSA組（P＜0.05）。結(jié)論 CNV-seq可以對(duì)胚胎染色體數(shù)目異常和染色體片段重復(fù)/缺失進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，在RSA和SA的遺傳學(xué)病因診斷中同樣重要，可為再生育指導(dǎo)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：流產(chǎn)，習(xí)慣性；全基因組測(cè)序；DNA拷貝數(shù)變異；遺傳學(xué)；染色體畸變；核型分析

中圖分類號(hào)：R394.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20231247

Application of low depth whole genome sequencing technology in the diagnosis of genetic etiology of recurrent spontaneous abortion

JI Zhen1， LI Xiaozhou2， 3， WANG Xiuyan2， 3， LIU Lanze1， MENG Fanrong2， 3， JU Duan2， 3△

1 Department of Gynecology and Obstetrics， Tianjin Fifth Central Hospital， Tianjin 300450， China; 2 Genetics and Prenatal Diagnosis Center of Obstetrics and Gynecology， Tianjin Medical University General Hospital;

3 Tianjin Key Laboratory of Female Reproductive Health and Eugenics

△Corresponding Author E-mail： saijd@163.com

Abstract： Objective To investigate the application value and significance of low depth genome-wide copy number variation sequencing （CNV-seq） in the diagnosis of genetic etiology of recurrent spontaneous abortion by comparing? differences of chromosome abnormalities and copy number variation in recurrent spontaneous abortion （RSA） and sporadic abortion （SA）. Methods A total of 402 aborted tissue from 158 RSA patients and 244 SA patients were collected for CNV-seq detection. The chromosome karyotypes in peripheral blood of couples with suspected chromosomal abnormality were detected with high resolution. Results In 402 samples， 2 cases were failed， and the detection success rate was 99.5% （400/402）. A total of 238 （59.5%） chromosome abnormalities were detected in 400 samples， including 212 （89.1%） chromosome number abnormalities， 25 （10.5%） pathogenic copy number variation and 1 （0.4%） uniparental disomy. There were no significant differences in the overall incidence rate of chromosome abnormality， aneuploid abnormality and triploid between the two groups. The proportion of pathogenic copy number variation in chromosome abnormalities was significantly higher in the RSA group than that in the SA group （P＜0.05）. A total of 4 balanced translocation carriers were detected by high-resolution peripheral blood karyotype analysis. During the age range of 35-39， the rate of chromosomal abnormality was significantly higher in the SA group than that in the RSA group （P＜0.05）. In both the RSA group and the SA group， the chromosomal abnormality rate in the first trimester abortion was significantly higher than that in the second trimester abortion， while the rate of POCs chromosomal abnormalities was higher in the SA group than that in the RSA group in the first trimester abortion （P＜0.05）. Conclusion CNV-seq can accurately diagnose the numerical chromosomal abnormalities and the duplication/deletion of chromosome fragments in embryos， which is equally important in the genetic etiology diagnosis of RSA and SA， and can provide sufficient evidence for the guidance of reproduction.

Key words： abortion， habitual; whole genome sequencing; DNA copy number variations; genetics; chromosome aberrations; karyotyping

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)發(fā)生的2次及以上的在妊娠28周之前的胎兒丟失，是常見的妊娠并發(fā)癥，也是危害女性生殖健康的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，育齡女性中RSA的發(fā)病率為1%～5%，并呈逐年上升趨勢(shì)［1］。RSA的發(fā)病原因復(fù)雜，包括遺傳、易栓、免疫、解剖、感染、內(nèi)分泌等因素［1］。目前達(dá)成共識(shí)的是胚胎染色體異常是自然流產(chǎn)最主要的原因，占50%～70%［1-2］?；诙鷾y(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）的低深度基因組拷貝數(shù)變異分析（copy number variation sequencing，CNV-seq）技術(shù)自2009年首次報(bào)道［3］以來已廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷及篩查領(lǐng)域，基于該技術(shù)分辨率高、準(zhǔn)確性高、成本效益高以及覆蓋范圍廣等特點(diǎn)，目前已經(jīng)成為流產(chǎn)組織（products of conceptions，POCs）遺傳學(xué)病因篩查的主要方法。既往對(duì)POCs遺傳因素的研究多集中在早期流產(chǎn)患者中［4］，且關(guān)于RSA患者和偶發(fā)性流產(chǎn)（sporadic abortion，SA）患者POCs遺傳病因構(gòu)成的差異尚存在爭(zhēng)議［5］。本研究采用CNV-seq技術(shù)對(duì)158例RSA患者和244例SA患者的POCs進(jìn)行檢測(cè)，比較2組患者POCs中染色體數(shù)目異常以及拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）的特點(diǎn)及差異，探討CNV-seq在RSA患者遺傳學(xué)病因診斷中的應(yīng)用價(jià)值和意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年4月—2022年5月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院及天津市第五中心醫(yī)院就診的158例RSA患者（RSA組）以及同期就診的244例按年齡、流產(chǎn)孕周匹配的SA患者（SA組）為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）就診時(shí)經(jīng)超聲確認(rèn)胚胎或者胎兒停止發(fā)育，自然流產(chǎn)或者通過終止妊娠手術(shù)獲得可檢測(cè)的流產(chǎn)絨毛組織或者胎兒、胎盤組織且自愿進(jìn)行POCs遺傳學(xué)檢測(cè)。（2）參照《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治專家共識(shí)（2022）》［1］，RSA患者須符合RSA診斷標(biāo)準(zhǔn)。SA患者須符合就診時(shí)為首次發(fā)生的28周之前的妊娠丟失。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）因內(nèi)外科重大疾病或者意愿外妊娠而終止妊娠者。（2）無法獲得可辨認(rèn)的流產(chǎn)絨毛組織或者胎兒胎盤組織者。納入研究對(duì)象年齡20～46歲，流產(chǎn)孕周5～28周。本研究經(jīng)過天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)（IRB2023-WZ-128）及天津市第五中心醫(yī)院倫理委員會(huì)（WZX-EC-KY2023025）批準(zhǔn)。

1.2 CNV-seq檢測(cè) 患者進(jìn)行終止妊娠手術(shù)或者自然流產(chǎn)獲得POCs后，取新鮮絨毛組織10～15 mg、胎兒皮膚組織或者胎盤組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，4 ℃保存，48 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，德國）進(jìn)行POCs基因組DNA提取，應(yīng)用CNV文庫構(gòu)建試劑盒（北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建，使用Nextseq CN500（Illumina，美國）進(jìn)行全基因組測(cè)序分析（單端測(cè)序，讀長45 bp）。測(cè)序結(jié)果與人類基因組參考序列（GRCH37/hg19）進(jìn)行對(duì)比分析。參考OMIM、DECIPHER、DGV、ClinGen等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南［6］對(duì)結(jié)果進(jìn)行致病性評(píng)估。采用熒光定量PCR對(duì)15個(gè)高度多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，以判斷母體細(xì)胞污染以及檢測(cè)三倍體。

1.3 染色體核型分析 對(duì)POCs結(jié)果提示染色體末端重復(fù)和缺失，可疑染色體異常的夫婦進(jìn)行高分辨外周血染色體核型檢測(cè)。外周血染色體制備，G顯帶均依據(jù)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。使用全自動(dòng)染色體顯微圖像掃描分析系統(tǒng)（蔡司，德國）進(jìn)行掃描與分析，核型描述根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制》（ISCN2016）完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般情況 402例POCs中2例因母體細(xì)胞污染導(dǎo)致檢測(cè)失敗（均發(fā)生在RSA組），檢測(cè)成功率99.5%，最終納入400例，其中RSA組156例，年齡33（30，36）歲，流產(chǎn)孕周8（7，9）周，流產(chǎn)次數(shù)2～5次，流產(chǎn)2次106例（68%），流產(chǎn)3次35例（22.4%），流產(chǎn)≥4次15例（9.6%）；SA組244例，年齡32（30，36）歲，流產(chǎn)孕周8（7，10）周。2組年齡和流產(chǎn)孕周差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z分別為1.611和0.777，P＞0.05）。

2.2 胚胎染色體總體異常分布情況 400例樣本共檢測(cè)出染色體異常238例（59.5%，238/400），包括染色體數(shù)目異常212例（89.1%，212/238）、致病性拷貝數(shù)變異（pathogenic copy number variation，pCNV）25例（10.5%，25/238）、單親二倍體（uniparental disomy，UPD）1例（0.4%，1/238）。染色體數(shù)目異常中包括非整倍體189例（89.2%，189/212），三倍體23例（10.8%，23/212）。189例非整倍體異常中包括單體23例（12.2%，23/189），其中22例為X0；單一三體132例（69.8%，132/189），其中16-三體最常見，共25例（18.9%，25/132）；多重三體15例（7.9%，15/189），包括2例涉及到3條染色體的多重三體以及13例涉及2條染色體的雙三體；嵌合體19例（10.1%，19/189），其中9例X0嵌合體。RSA組和SA組POCs染色體異常情況分布見表1。非整倍體是最常見的染色體異常類型，在RSA組和SA組中POCs非整倍體在染色體異常中構(gòu)成比分別為75.6%（65/86）和81.6%（124/152）。2組間總體染色體異常、非整倍體、三倍體以及pCNV發(fā)生率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RSA組未發(fā)現(xiàn)涉及1、6、11以及19號(hào)染色體的非整倍體異常，SA組除1號(hào)染色體未發(fā)現(xiàn)非整倍體異常以外，其余染色體都檢測(cè)出非整倍體異常。2組間染色非整倍體在1—22號(hào)染色體以及性染色體中的分布情況見圖1。將嵌合體以及多重三體涉及到的染色體編號(hào)依次計(jì)算，RSA組非整倍體異常以16-三體構(gòu)成比最高，SA組非整倍體異常中最常見的是X-單體，其次是22-三體。

2.3 pCNV在2組胚胎染色體異常中的分布 RSA組的14例pCNV含單個(gè)位點(diǎn)拷貝數(shù)重復(fù)2例，單個(gè)位點(diǎn)拷貝數(shù)缺失7例，多個(gè)位點(diǎn)拷貝數(shù)重復(fù)+缺失5例，片段大小0.26～79.72 Mb，包括6例致病性微缺失/微重復(fù)（＜10 Mb）和8例致病性大片段缺失/重復(fù)（≥10 Mb）。SA組的11例pCNV含單個(gè)位點(diǎn)拷貝數(shù)重復(fù)2例，單個(gè)位點(diǎn)拷貝數(shù)缺失4例，多個(gè)位點(diǎn)拷貝數(shù)重復(fù)+缺失5例，片段大小位于0.86～99.42 Mb，包括1例致病性微缺失（＜10 Mb）和10例致病性大片段缺失/重復(fù)（≥10 Mb）。RSA組pCNV在染色體異常中的構(gòu)成比為16.3%（14/86），高于SA組的7.2%（11/152），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.777，P＜0.05）。高分辨外周血核型分析檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)4例平衡易位攜帶者，見表2。

2.4 年齡和胚胎染色體異常的相關(guān)性 將患者年齡按照≤29歲、30～34歲、35～39歲、≥40歲分為4段，SA組分別為56、109、60和19例；RSA組分別為29、69、45和13例。35～39歲年齡段中SA組胚胎染色體異常率高于RSA組（P＜0.05），見表3。

2.5 流產(chǎn)孕周和胚胎染色體異常的相關(guān)性 將流產(chǎn)孕周以12周為分界，分成早期流產(chǎn)（流產(chǎn)孕周≤12周）和中期流產(chǎn)（流產(chǎn)孕周≥13周）。SA組早期流產(chǎn)和中期流產(chǎn)分別為208例和36例；RSA組為140例和16例。2組早期流產(chǎn)中胚胎染色體異常率均高于中期流產(chǎn)（P＜0.05）。早期流產(chǎn)中，SA組的胚胎染色體異常率高于RSA組（P＜0.05），見表4。

3 討論

自然流產(chǎn)，尤其是RSA不僅是生育率下降的一個(gè)重要因素，也會(huì)對(duì)女性生育能力以及身心健康產(chǎn)生長期的危害，是生殖健康領(lǐng)域的重點(diǎn)問題。臨床上可識(shí)別妊娠中有10%～15%以流產(chǎn)告終，其中RSA發(fā)病率為1%～5%［1，7］。RSA的病因和機(jī)制復(fù)雜，胚胎染色體異常是最常見的原因，對(duì)POCs進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)對(duì)明確RSA病因有重要意義［8-9］。POCs遺傳學(xué)檢測(cè)方法經(jīng)歷了從染色體核型分析到熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA）到染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）以及基于NGS的CNV-seq技術(shù)［5］。CNV-seq技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率、全基因組覆蓋等特點(diǎn)，目前在臨床上可用于復(fù)雜POCs樣本的遺傳學(xué)檢測(cè)。本研究采用CNV-seq技術(shù)對(duì)POCs進(jìn)行檢測(cè)，總體染色體異常檢出率為59.5%，其中染色體數(shù)目異常占89.1%，pCNV占10.5%，UPD占0.4%，與以往報(bào)道基本相符［4，10］。

RSA和SA POCs遺傳病因構(gòu)成的差異仍存在爭(zhēng)議。Sheng等［10］對(duì)1 556例POCs進(jìn)行CMA和CNV-seq檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RSA組和SA組POCs染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但RSA組POCs有更高的CNV發(fā)生率并且涉及16q24.3和16p13.3的重復(fù)。2020年的一項(xiàng)薈萃研究發(fā)現(xiàn)，采用不同檢測(cè)技術(shù)結(jié)合的情況下RSA和SA組染色體異常率相近，均為46%［11］。而2018年的一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)SA POCs染色體異常率（49.7%，95% CI：34.9%～64.6%）高于RSA（40.4%，95% CI：25.2%～55.7%）［12］。2022年的一項(xiàng)薈萃分析共納入8 320例POCs，發(fā)現(xiàn)SA POCs染色體異常率高于RSA（OR=1.20，95% CI：1.01～1.44，P=0.04）［13］。本研究中RSA組和SA組POCs染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但當(dāng)納入年齡和流產(chǎn)孕周協(xié)變量分組研究后筆者發(fā)現(xiàn)，35～39歲SA組胚胎染色體異常率高于RSA組，而在母親年齡小于35歲以及≥40歲時(shí)，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在早期流產(chǎn)中，SA組的POCs染色體異常率高于RSA組，而中期流產(chǎn)中，胚胎染色體總體異常率下降，但2組間胚胎染色體異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明母親年齡的增加是胚胎非整倍體發(fā)生的危險(xiǎn)因素。胎兒時(shí)期卵母細(xì)胞會(huì)停滯在減數(shù)分裂Ⅰ期前期并持續(xù)相當(dāng)長的時(shí)間，減數(shù)分裂長期停滯期間同源染色體間內(nèi)聚力的退化是人類母親年齡效應(yīng)的基礎(chǔ)［14-15］。本研究同樣證實(shí)了隨著年齡的增長，胚胎染色體異常率呈上升趨勢(shì)，在35～39歲，SA總體POCs染色體異常率大于RSA，間接說明RSA中，雖然遺傳因素占有一定權(quán)重，但尚有其他病因影響。對(duì)于40歲以上的RSA人群，胚胎染色體異常率急劇升高，這種趨勢(shì)說明了超高齡帶來的母親年齡效應(yīng)引起的胚胎染色體異常在RSA患者流產(chǎn)病因構(gòu)成中的權(quán)重迅速增加。當(dāng)然也不能除外納入的≥40歲組的病例較少所導(dǎo)致。

本研究比較了RSA組和SA組間POCs染色體異常的構(gòu)成。RSA組胚胎染色體異常病例中，非整倍體構(gòu)成比高達(dá)75.6%，以16-三體最常見。SA組非整倍體在胚胎染色體異常中的構(gòu)成比為81.6%，以X-單體最常見，其次是22-三體。2組均未涉及1號(hào)染色體的非整倍體。其原因可能為1號(hào)染色體基因組較大，1號(hào)染色體三體對(duì)胚胎發(fā)育是致死性的，往往著床前后就停止發(fā)育，很難獲得可檢測(cè)的POCs［16］。本研究發(fā)現(xiàn)RSA組pCNV在染色體異常中的構(gòu)成比為16.3%，高于SA組的7.2%，與以往研究一致［10，17］。pCNV的變化涉及一段或者多段連續(xù)的基因，通過基因劑量改變、染色體斷裂等方式影響基因表達(dá)，從而引起妊娠丟失，但到目前其與妊娠丟失關(guān)系尚不明確［18-19］。另外，親本的結(jié)構(gòu)異常，尤其是染色體平衡性結(jié)構(gòu)重排是RSA的重要原因［20］。CNV-seq無法檢測(cè)染色體交互易位、倒位等平衡性結(jié)構(gòu)重排，但是當(dāng)POCs CNV-seq結(jié)果提示同時(shí)具有缺失和重復(fù)異常，并且位于染色體末端位置時(shí)，要高度可疑親本可能是平衡易位攜帶者。此時(shí)要應(yīng)用核型分析的方法對(duì)夫婦雙方的外周血染色體核型進(jìn)行分析。本研究通過分析pCNV的大小和位置對(duì)可疑染色體結(jié)構(gòu)異常的夫婦進(jìn)行了進(jìn)一步遺傳學(xué)檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)4例平衡易位攜帶者，并且易位片段均較小，常規(guī)的核型分析容易漏診。因此，當(dāng)POCs CNV-seq結(jié)果提示缺失或者重復(fù)位于染色體末端高度可疑親本是平衡性結(jié)構(gòu)重排攜帶者的情況下，建議完善夫婦雙方核型分析，CNV-seq檢測(cè)結(jié)果對(duì)于親本染色體平衡易位斷點(diǎn)的定位有很好的提示作用，可以增加核型分析的準(zhǔn)確性，對(duì)于CNV片段較小、可疑隱匿性平衡易位的情況下，建議結(jié)合FISH、全基因組光學(xué)圖譜等技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)分析。

綜上，POCs染色體異常在RSA和SA人群中發(fā)生率相似，是妊娠丟失最主要的原因。高齡和孕早期流產(chǎn)是胚胎染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)因素。相比SA患者，pCNV在RSA患者中具有更高的發(fā)生率，但其與RSA的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。pCNV的檢測(cè)為提示親本可能存在平衡性染色體結(jié)構(gòu)重排提供了重要證據(jù)。CNV-seq可以對(duì)胚胎染色體數(shù)目異常和染色體片段重復(fù)/缺失進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，不僅能明確流產(chǎn)的病因，還可以提示親本可能存在的染色體結(jié)構(gòu)重排，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和偶發(fā)流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因診斷中同樣重要，為再生育指導(dǎo)提供依據(jù)。

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（2023-08-16收稿 2023-10-13修回）

（本文編輯 李志蕓）