趙志強(qiáng)，陳羅君，饒 雨，徐 璐，饒 軍，雷志勇，張 麗,3，高銀祥,3,*

（1.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西九江 332005；2.修水縣茶葉科學(xué)研究所，江西九江 332400；3.九江學(xué)院江西油茶研究中心，江西九江 332005）

茶是三大無酒精飲料之一，因其獨(dú)特的風(fēng)味及保健功效受到全世界人民的喜愛[1-2]。根據(jù)加工工藝不同，茶可分為：綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶和黑茶。綠茶作為一款非發(fā)酵茶，在我國茶葉生產(chǎn)銷售獨(dú)占鰲頭[3-4]。雙井綠茶屬于綠茶，產(chǎn)自江西省修水縣，因其外形卷曲細(xì)緊、翠綠多毫，形如鳳爪，湯色明亮，內(nèi)質(zhì)散發(fā)清香高雅，滋味醇厚甘美而聞名于世。雙井綠茶的加工工藝包括攤青、殺青、揉捻、初烘、做型、定型烘干、提香干燥等步驟，使其獲得獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[5]。

茶葉香氣是評價(jià)茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因子，茶葉中香氣物質(zhì)種類及其含量使茶葉呈現(xiàn)獨(dú)特香型[6]。茶樹品種、茶樹生長環(huán)境、茶葉加工工藝等影響茶葉香氣物質(zhì)，其中采用的鮮葉原料是影響茶葉香氣的關(guān)鍵因素[7-9]。Peng 等[10]對不同等級的九曲紅梅香氣物質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明有5 種揮發(fā)性化合物的相對含量與九曲紅梅茶等級呈正相關(guān)。丁玎等[11]對4 個(gè)等級的白茶中的香氣進(jìn)行分析，共鑒定出51 種香氣組分，其中醇類物質(zhì)和醛類物質(zhì)占比高達(dá)70.54%的比例。綜上所述，不同等級茶之間的香氣物質(zhì)存在明顯差異。

頂空固相微萃?。℉eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）是通過固相萃取頭涂層對茶葉香氣物質(zhì)進(jìn)行吸附，在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）GC/MS進(jìn)樣口用高溫將萃取頭香氣物質(zhì)解吸附、進(jìn)行進(jìn)樣檢測；GC-MS 可以對茶葉中香氣物質(zhì)進(jìn)行快速分離，通過質(zhì)譜信息、對比質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定，具有定性定量分析功能。GC-MS 和HS-SPME 聯(lián)用可快速地分析茶葉中的揮發(fā)性化合物，真實(shí)地反映茶葉香味物質(zhì)特征[12-13]。

關(guān)于雙井綠茶香氣物質(zhì)的組成特征的研究，目前尚未見相關(guān)報(bào)道，特別是不同等級雙井綠茶中的香氣物質(zhì)有何差異還不清楚。本研究以江西省修水縣同一茶葉產(chǎn)地、同一加工工藝條件，不同芽葉制作的不同等級的雙井綠茶為研究對象，利用GC-MS 和HS-SPME 聯(lián)用技術(shù)，對不同等級雙井綠茶的香氣物質(zhì)組成及含量進(jìn)行分析，利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、熱圖分析等手段，研究不同等級雙井綠茶中香氣物質(zhì)的組成及含量變化，分析關(guān)鍵香氣物質(zhì)的分布變化規(guī)律，為雙井綠茶的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙井綠茶葉樣品 來自修水縣大椿茶廠，茶鮮葉來源于大椿茶廠自有茶園，經(jīng)攤青、殺青、抖簸等9 道加工工序制成，每個(gè)雙井綠茶樣品分別取3 份，置于干凈無味的-20 ℃冰箱中；純凈水 華潤怡寶飲料（中國）有限公司；C7～C40 飽和烷烴混標(biāo) 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich）。

固相微萃取頭SPME 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 美國Supelco 公司；20 mL 頂空螺紋瓶加磁吸式頂空瓶蓋 安捷倫科技（中國）有限公司；TG-5MS 氣相色譜柱 30 m×0.25 mm×0.25 μm、TSQ 8000Evo 氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、TriPlus RSH 三合一自動(dòng)進(jìn)樣器 美國Thermo Fisher 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙井綠茶樣品分級 根據(jù)雙井綠茶芽葉形態(tài)及其相對含量，芽葉形態(tài)如圖1 所示，分為雙井銀毫（Yinhao Grade，YHG）、雙井綠茶特級（Shuangjing Green Tea Super Grade，SUG）、雙井綠茶一級（Shuangjing Green Tea First Grade，F(xiàn)G）和雙井綠茶二級（Shuangjing Green Tea Second Grade，SG）四個(gè)級別。雙井銀毫（YHG）：單芽和一芽一葉初展為原料，其中單芽相對含量＞85%；雙井綠茶特級（SUG）：一芽一葉初展和一芽一葉開展為原料，其中一芽一葉初展相對含量＞75%；雙井綠茶一級（FG）：一芽一葉開展和一兩葉為原料，其中一芽一葉開展相對含量＞75%；雙井綠茶二級（SG）：一芽二葉開展和一芽三葉為原料，其中一芽二葉開展小＜3 cm，相對含量＞80%。

圖1 茶樹芽葉形態(tài)Fig.1 Bud and leaf morphology of Camellia sinensis

1.2.2 樣品處理 所有樣品磨碎，過40 目篩，精確稱取1.50 g 茶粉末樣品，置入20 mL 樣品瓶，加4.50 mL 水（加入1.50 g 氯化鈉）。

1.2.3 固相微萃取條件 固相微萃取條件參考本實(shí)驗(yàn)室之前的實(shí)驗(yàn)方法[14]。60 ℃平衡30 min，平衡完成，插入已老化（或已解吸附）的纖維萃取頭，于茶樣上方頂空吸附（萃取溫度60 ℃，萃取時(shí)間60 min），后將萃取頭進(jìn)樣解析（解析時(shí)間5 min，250 ℃）。

1.2.4 GC-MS 檢測條件 GC-MS 檢測條件參考本實(shí)驗(yàn)室之前的實(shí)驗(yàn)方法[14]。載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），恒流流速1.0 mL/min，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，不分流進(jìn)樣，質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI）溫度300 ℃。電子能量70 ev；質(zhì)譜掃描范圍：m/z 33～550 amu。程序升溫條件：40 ℃（保持2 min），5 ℃/min，85 ℃（保持2 min），2 ℃/min，110 ℃（保持2 min），4 ℃/min，220 ℃（保持2 min），5 ℃/min，250 ℃（保持10 min）。

1.2.5 保留指數(shù)的測定及計(jì)算方法 C7～C40 混標(biāo)檢測，正構(gòu)烷烴混標(biāo)濃度1000 μg/mL（1000 ppm），用正己烷（色譜級）稀釋至10 μg/mL（10 ppm）。手動(dòng)進(jìn)樣1 μL，濃度為10μg/mL C7～C40 混標(biāo)進(jìn)GC-MS檢測，用以計(jì)算保留指數(shù)。香氣物質(zhì)的定性定量參考本實(shí)驗(yàn)室之前的方法[14]。香氣組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)在NIST2014 庫以及自建庫中進(jìn)行檢索，篩選出RSI 大于800 的化合物，計(jì)算化合物的保留指數(shù)RI，并與文獻(xiàn)中的保留指數(shù)，進(jìn)行對比，通過RSI 和RI 進(jìn)行香氣組分定性；香氣成分的相對含量采用峰面積歸一法計(jì)算。保留指數(shù)根據(jù)下式計(jì)算：

式中：RIX：化合物X 的保留指數(shù)（X 在正構(gòu)烷烴Z 和Z+1 之間餾出）；RTX：化合物X 的保留時(shí)間；RTZ：碳數(shù)為Z 的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；RTZ+1：碳數(shù)為Z+1 的正構(gòu)烷烴保留時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究每個(gè)測定實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM Statistics SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，水平間比較用LSD 法和Duncan 法，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。采用TBtools 繪制熱圖，多元統(tǒng)計(jì)分析采用SIMCA-P 14.1 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同等級雙井綠茶香氣組分GC-MS 分析

不同等級雙井綠茶經(jīng)GC-MS 檢測，得到雙井綠茶總離子流色譜圖，如圖2 所示，本實(shí)驗(yàn)采用的HSSPME 及GC-MS 梯度升溫方法可以有效提取分離檢測雙井綠茶香氣組分。香氣組分總離子流圖結(jié)果顯示，不同等級的雙井綠茶總離子流圖差異明顯，同一等級的雙井綠茶香氣總離子流圖結(jié)果更加相似。

圖2 不同等級雙井綠茶香氣組分總離子流色譜對比圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.2 不同等級的雙井綠茶香氣組分定性分析

利用GC-MS 并通過RSI 和RT 在4 種不同等級雙井綠樣品中共鑒定出了70 種香氣成分（表1），根據(jù)香氣組分主要官能團(tuán)的不同，可分為7 大類，其中醇類17 種，醛類7 種，酮類5 種，酯類8 種，烯烴12 種，烷烴9 種，雜環(huán)類7 種，其它化合物5 種。鄧見田燁等[15]利用HS-SPME-GC-MS 分析檢測不同種類黑茶香氣物質(zhì)，共檢測鑒定出56 個(gè)香氣成分。李沅達(dá)等[16]對不同加工工藝的紫鵑白茶的香氣組分進(jìn)行檢測，共檢測鑒定出82 種香氣物質(zhì)。不同的茶葉類型、不同的檢測儀器及不同的檢測方法會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果差異。

表1 不同等級雙井綠茶香氣成分Table 1 Aroma components of Shuangjing green tea with different grades

2.3 不同等級雙井綠茶總香氣組分變化分析

TBtools 是一款用于高通量數(shù)據(jù)分析的工具[17]，利用TBtools 繪制熱圖，可以直觀地比較香氣組分含量的變化，如圖3 所示，色階顏色從藍(lán)到紅的變化代表了相對含量從低到高，從圖3 可以觀察到，在雙井銀毫、雙井特級（芽占比較高）中反式-β-金合歡烯、2-甲基十五烷、δ-杜松烯、庚醛、雪松烯、順式-香葉醇、2,6-二叔丁基對甲基苯酚、壬醛、2,6,10 -三甲基-十四烷、反式香葉酸、石竹烯、γ-依蘭油烯、2-甲基十三烷等香氣組分相對含量較高；隨著芽葉開展，在雙井一級、雙井二級（一芽二葉、一芽三葉占比較高）中相對含量較高的有苯乙醇、檸檬醛、順式-3-己烯醇、香葉醇、5-甲基-2 庚烯-6-酮、β-檸檬醛、苯甲醛、苯甲醇、順式-芳樟醇氧化物（呋喃類）及水楊酸甲酯等。

圖3 不同等級雙井綠茶香氣組分的熱圖分析Fig.3 Heatmap analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.4 不同等級的雙井綠茶香氣組分主成分分析

由于茶葉中香氣成分復(fù)雜多樣，很難以單一的香氣成分和簡易的數(shù)據(jù)分析獲得有效變量，多元統(tǒng)計(jì)分析是一種綜合分析方法，通過分析雙井綠茶樣品的統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，可以在多個(gè)對象和指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)時(shí)進(jìn)行分析[18]。為了探索具有四種不同等級的雙井綠茶樣品鑒別的潛在化學(xué)標(biāo)記，使用多元統(tǒng)計(jì)分析對所鑒定得出的70 種香氣成分進(jìn)行差異性分析。

為了研究不同等級茶葉樣品中揮發(fā)性化合物組成的相似性和差異性，以這些檢測到的香氣物質(zhì)相對含量為變量，進(jìn)行了主成分分析（PCA），PCA 通過降維將多個(gè)變量轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合變量，從而直觀地反映樣本的某些特征多變量、無監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)分析方法，被廣泛應(yīng)用于茶葉揮發(fā)性成分研究[19]。如圖4 所示，根據(jù)不同等級的雙井綠茶香氣組分的相對含量構(gòu)建的PCA 模型吻合程度（R2）和模型預(yù)測能力（Q2）分別為0.897 和0.751，這表明PCA 對數(shù)據(jù)具有較好的適應(yīng)度，不同等級的雙井綠茶樣品區(qū)分明顯。

圖4 不同等級雙井綠茶香氣組分的PCA 分析圖Fig.4 PCA analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

層次聚類分析（Hierarchical Clustering Analysis，HCA）是將對象根據(jù)其在多維空間中的接近程度分組成簇，將最大相似性的樣本為優(yōu)先聚類[20]。如圖5 所示，四種不同等級雙井綠茶可以在聚類距離70 處被清晰地分成4 個(gè)聚類，其中第一組為雙井綠二級聚類，第二組為雙井銀毫，第三為雙井綠特級，第四組為雙井綠一級。隨著聚類距離增加，雙井特級和雙井一級距離更近，而雙井二級與其他3 組距離最遠(yuǎn)，說明在四種不同等級的茶樣香氣組分，雙井特級與雙井一級的香氣物質(zhì)更相似，而雙井二級香氣組分與其他3 組差異更大，說明芽葉生長直至完全展開，香氣組分變化很大，而芽中的香氣組分變化較小。

圖5 不同等級雙井綠茶HCA 聚類分析圖Fig.5 HCA clustering analysis of Shuangjing green tea with different grades

偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）是一種監(jiān)督聚類的分類方法，可以彌補(bǔ)PCA 的不足，加強(qiáng)樣本之間的差異，并提供負(fù)責(zé)分離的關(guān)鍵香氣成分的指示[21]。采用PLS-DA 法比較了四種綠茶的香氣物質(zhì)特征。在模型中不同等級雙井綠茶香氣組分之間存在顯著差異。參數(shù)（R2Y=0.991）具有很高的解釋能力，Q2=0.969 具有較強(qiáng)的預(yù)測能力。如圖6 所示，銀毫一級位于得分圖的右上方，雙井特級和雙井一級集中在右下方，雙井二級單獨(dú)位于得分圖的左下方。4 個(gè)不同等級雙井綠茶的樣品得到了很好的區(qū)分。

圖6 不同等級雙井綠茶PLS-DA 分析圖Fig.6 PLS-DA analysis of aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

VIP 值可以量化PLS-DA 模型中香氣組分對樣本分類的貢獻(xiàn)大小，在判別過程中一般認(rèn)為VIP＞1，影響樣本相似性的關(guān)鍵因素，P＜0.05 表示該組分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[22]。如圖7 所示：在本研究中VIP＞1共有19 種香氣物質(zhì)：反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯甲醇、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物、1-辛醇、己酸乙酯、2,6,10-三甲基十三烷、芳樟醇、α-椰油烯、壬醛、（Z,E）-α-法呢烯、咖啡因、順式-3-己烯醇。其中VIP＞1，同時(shí)P＜0.05，如表2 所示，反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯、順式-3-己烯醇，這14 種香氣組分是不同等級雙井綠茶在香氣上產(chǎn)生差異的關(guān)鍵物質(zhì)。這些變化的關(guān)鍵性香氣組分主要表現(xiàn)為花香、果香、木香、焦糖香及青香等[23-26]。

表2 不同等級雙井綠茶香氣組分差異關(guān)鍵物質(zhì)Table 2 Key substances for different aroma components of Shuangjing green tea with different grades

圖7 不同等級雙井綠茶香氣組分PLS-DA 模型的VIP 得分圖Fig.7 VIP score diagram of PLS-DA model for aroma compounds of Shuangjing green tea with different grades

2.5 不同等級的雙井綠茶關(guān)鍵差異物質(zhì)變化分析

根據(jù)PLS-DA 模型，利用VIP＞1 且P＜0.05，共篩選出14 種關(guān)鍵差異物質(zhì)，具體見表2，分別為反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物（吡喃類）、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯以及順式-3-己烯醇。為了呈現(xiàn)上述香氣化合物在不同等級雙井綠茶品質(zhì)中的含量差異，以及探索它們之間的關(guān)系，將14 種關(guān)鍵差異物質(zhì)香氣含量制成熱圖，如圖8 所示，結(jié)果表明以單芽為主的銀毫一級與雙井綠茶特級中呈現(xiàn)果香、木香為主的反式-β-金合歡烯、α-椰油烯、石竹烯、己酸乙酯相對含量較高；隨著芽葉開展，在雙井綠茶一級與雙井綠茶二級中呈現(xiàn)花香、青香為主的水楊酸甲酯、香葉醇、順式-3-己烯醇相對含量迅速增加；而芳樟醇、茉莉酮、反式-橙花叔醇含量從低到高，隨后含量又迅速下降。

圖8 不同等級的雙井綠茶關(guān)鍵差異物質(zhì)熱圖Fig.8 Heatmap analysis of key aroma compounds of Shuangjing Green Tea with different grades

綠茶的特征香氣在很大程度上取決于關(guān)鍵香氣物質(zhì)，并且茶葉中芳樟醇和香葉醇的含量對茶葉的香氣品質(zhì)有一定影響[27-28]。茉莉酮具有典型的果香、花香和木香，水楊酸甲酯的杏仁香及焦香，橙花醇具有草木香、氧化芳樟醇（吡喃類）具有花香、苯乙醇具有花香，順式-3-己烯醇具有青草香[29-31]，這些香氣組分呈現(xiàn)了花香、果香、木香和青香等香型，這些香氣組分的種類和含量導(dǎo)致了雙井綠茶的整體的呈現(xiàn)的獨(dú)特的茶香。

3 結(jié)論

本研究基于HS-SPME-GC/MS 聯(lián)用技術(shù)對四種不同等級的雙井綠茶的香氣組分進(jìn)行檢測分析，共鑒定出70 種香氣物質(zhì)。結(jié)果表明，四組不同等級雙井綠茶樣品的香氣組分差異明顯。其中反式-β-金合歡烯、2-甲基十五烷、δ-杜松烯、庚醛、雪松烯、順式-香葉醇、2,6-二叔丁基對甲基苯酚、壬醛、2,6,10 -三甲基-十四烷、反式香葉酸、石竹烯、γ-依蘭油烯、2-甲基十三烷等在芽中的相對含量較高。苯乙醇、檸檬醛、順式-3-己烯醇、香葉醇、5-甲基-2 庚烯-6-酮、β-檸檬醛、苯甲醛、苯甲醇、順式-芳樟醇氧化物（呋喃類）及水楊酸甲酯等隨著芽葉開展，在一芽二葉、一芽三葉中相對含量較高。

其中反式-β-金合歡烯、香葉醇、水楊酸甲酯、（Z）-茉莉酮、苯乙醇、十四烷、反式-橙花醇、石竹烯、反式-芳樟醇氧化物（吡喃類）、1-辛醇、己酸乙酯、芳樟醇、α-椰油烯以及順式-3-己烯醇是不同等級雙井綠茶的關(guān)鍵差異性物質(zhì)，這14 種香氣組分是不同等級雙井綠茶在香氣上產(chǎn)生差異的關(guān)鍵物質(zhì)。

綜上，本研究揭示了不同等級雙井綠茶中香氣物質(zhì)的組成，加深了關(guān)鍵香氣物質(zhì)在芽葉中的分布規(guī)律的認(rèn)識(shí)，為雙井綠茶的生產(chǎn)提供理論參考。

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