吳琳嬌 孫麗芳 朱春華 張紅 董盼盼 陳磊清 吳允昆

摘要：鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus Ⅱ，CyHV-Ⅱ）對任何發(fā)育時期的金魚、鯽魚及其雜交品種均具有感染能力，能夠引起金魚皰疹?。╣oldfish haematopoietic necrosis， GFHN），是一種傳染性強且死亡率極高的疫病，給我國金魚和鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，魚用疫苗的研發(fā)是預(yù)防和治療該疫病最有效的辦法。綜述了CyHV-Ⅱ滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗和納米遞送疫苗的研究進展，并對魚用疫苗納米材料的應(yīng)用前景進行了探討，以期為金魚皰疹病害防治和魚用疫苗研究提供新技術(shù)方法和新思路策略。

關(guān)鍵詞：鯉皰疹病毒二型（CyHV-Ⅱ）；免疫途徑；納米材料；疫苗類型

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0775

中圖分類號：S943 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）02013708

金魚造血器官壞死癥病毒（goldfishhaematopoietic necrosis virus，GFHNV）又名鯉皰疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus Ⅱ， CyHV-Ⅱ），主要侵染鯉科魚類的脾臟、腎臟、肝臟等器官，引起脾臟細胞包涵體、腎臟的造血干細胞和腎小管上皮細胞壞死[1]。感染CyHV-Ⅱ時，受感染的金魚會出現(xiàn)沉底、精神萎靡、呼吸頻率加快、眼球突出、腹部膨大、魚體表面可觀察到出血等癥狀[23]。CyHV-Ⅱ傳染性強、潛伏周期長，并且常在水溫15～25 ℃時爆發(fā)[4-6]，因此，防治難度極大，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。此外，CyHV-Ⅱ?qū)Ω靼l(fā)育時期的金魚[2]、鯽魚及其變種[7]均有感染能力，其中以幼魚的癥狀最顯著，且死亡率可達100%。CyHV-Ⅱ不僅可通過水平傳播，也存在母體向魚卵的垂直傳播途徑，因此，對CyHV-Ⅱ的綜合預(yù)防迫在眉睫。

自1995年在日本發(fā)現(xiàn)CyHV-Ⅱ ST-J1毒株以來[8]，金魚造血器官壞死癥逐漸蔓延到全球水產(chǎn)行業(yè)。近10年，江蘇、廣州、武漢等地陸續(xù)爆發(fā)大規(guī)模CyHV-Ⅱ疫情，淡水魚養(yǎng)殖行業(yè)受到巨大沖擊，相關(guān)從業(yè)者迫切需要有效、高效且經(jīng)濟的方法來防控此病[9]。目前針對CyHV-Ⅱ的特效藥物仍處于探索階段。因此，在生產(chǎn)中較有效的策略依舊是通過控制水溫、改善養(yǎng)殖環(huán)境和投喂抗生素等手段遏制病毒傳播鏈，抑制其蔓延。Guo等[10]運用生物絮凝技術(shù)改善水質(zhì)，雖有效提高了異育銀鯽的免疫力，但不利于魚體生長。上述方法在一定條件下可限制病毒傳播，但由于經(jīng)濟適用性較低，且技術(shù)要求高等，難以大規(guī)模應(yīng)用于疫情防控。

疫苗因其經(jīng)濟、高效、長效、安全性高等特點被認為是對抗外源病毒感染的有效方式。目前，多種類型CyHV-Ⅱ疫苗已被證明有效，如衣殼蛋白亞單位疫苗、DNA疫苗、桿狀病毒載體疫苗等。多數(shù)魚用疫苗均采用注射和浸泡的方式接種，因此，受種魚常因應(yīng)激反應(yīng)過大導(dǎo)致?lián)p傷或死亡[11]。此外，接種方式的限制難以達到大規(guī)模接種的需求。目前，基于納米材料遞送保護性抗原實現(xiàn)免疫的策略已較為成熟，通過納米材料負載保護性抗原并黏附在魚食上，被魚食用后，在魚腸道內(nèi)根據(jù)pH改變釋放抗原刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答[12]，從而實現(xiàn)群體免疫，極大地降低了疫苗接種的難度和工作強度。本文探討了不同類型CyHV-Ⅱ疫苗以及免疫方式，并對納米材料在CyHV-Ⅱ疫苗開發(fā)中的潛在應(yīng)用前景展開討論，以期為CyHV-Ⅱ的綜合防治提供參考。

1 CyHV-Ⅱ的結(jié)構(gòu)

線性雙鏈DNA 病毒CyHV-Ⅱ的表面具有囊膜結(jié)構(gòu)，直徑為170～200 nm[13]，含有多種膜糖蛋白（membrane glycoprotein）和基質(zhì)蛋白（matrixprotein）。成熟病毒粒子中的核衣殼呈20 面體狀，直徑為90～120 nm，含主要的核衣殼蛋白（major capsid protein）和衣殼蛋白亞基（putativecapsid triplex submit）[14]（圖1）。它們與鯉痘皰疹?。–yprinid herpesvirus Ⅰ， CyHV-Ⅰ）和錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus， KHV）同屬于異樣皰疹病毒科，對比3種病毒的基因組信息發(fā)現(xiàn)，CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ和KHV基因組分別包含137、154和155個蛋白編碼區(qū)，且約有120個同源基因呈共線排列[15]。

2 魚類疫苗的免疫途徑

魚類疫苗的免疫途徑主要包括注射、浸泡和口服免疫3種。通過不同的接種方式，疫苗的免疫效果不同。

注射免疫是一種有效的接種方式，會引起強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。Zhang等[16]用β-丙內(nèi)酯滅活的CyHV-Ⅱ疫苗，以腹腔注射方式免疫鯽魚，免疫保護率達71.4%。注射免疫操作難度大，且易引起應(yīng)激反應(yīng)，目前，常利用機械注射取代人工注射，雖減弱了應(yīng)激反應(yīng)，但前期投入成本高，難以推廣。

浸泡免疫是一種實用、有效的魚類大規(guī)模疫苗接種方法。通過浸泡抗原被魚皮膚、腮或腸道吸收，引起免疫反應(yīng)，但魚皮膚和鰓吸收抗原的效率有限，且許多大分子蛋白質(zhì)和質(zhì)粒難以透過細胞膜進入細胞，因此缺乏繼發(fā)反應(yīng)[17]。浸泡疫苗與佐劑一起使用常獲得更好的效果[18]，經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活的CyHV-Ⅱ分別與β-葡聚糖、山莨菪堿和東莨菪堿混合后，浸泡免疫異育銀鯽，能明顯抑制CyHV-Ⅱ的復(fù)制，提高免疫效率[19]。

相對于注射和浸泡免疫，口服免疫是一種非侵入性途徑，也是對不同體型的魚類進行疫苗接種的最簡單方法之一，具有大規(guī)?；?、省時省力、操作簡單等優(yōu)點。口服疫苗模擬天然感染的過程，作用于大腸黏膜，引起高效黏膜反應(yīng)，繼而激活體液免疫和細胞免疫，持續(xù)時間長、免疫強度大[20]，但需要大劑量的抗原，且每條魚吸收的劑量無法確定[21]。此外，疫苗的有效性受胃中低pH和腸道中消化酶等影響。疫苗在魚后腸中被吸收時效果更顯著，因為腸道黏膜具有吸收可溶性或顆粒性抗原的能力，在這一區(qū)域具有多種淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞和漿細胞等，是腸道免疫應(yīng)答的重要組成部分[22]。Li等[23]構(gòu)建了重組桿狀病毒載體疫苗BacCarassius-D4ORFs，分別以口服和注射的方式免疫異育銀鯽，使融合基因D4ORFs 在魚體內(nèi)成功復(fù)制表達，有效降低了魚群發(fā)病率和死亡率。由此表明，病毒載體疫苗可通過口服和注射方式免疫鯽魚，但在口服給藥過程中，保護抗原通過胃和腸的前部分在抵達后腸時開始發(fā)揮作用是目前的研究重點。利用納米載體疫苗，結(jié)合口服佐劑，可中和胃酸，運載保護抗原，提高免疫效果[24]。

3 魚類疫苗納米遞送載體

口服免疫具有操作簡單、適用范圍廣、成本低等優(yōu)點，成為魚類免疫途徑的首選，但其效力受胃腸環(huán)境的影響。因此，對于魚用口服疫苗，如何將其安全有效地遞送到目標(biāo)靶點，且在機體內(nèi)不會被破壞和降解問題亟待解決。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，將納米材料作為遞送系統(tǒng)有望解決上述問題，同時納米顆粒具有的佐劑效應(yīng)還可以增強機體免疫應(yīng)答。

納米材料的生物相容性好，可提高抗原的生物利用度且減少副作用，但許多納米材料本身對機體免疫刺激不足，因此常加上佐劑以高效刺激免疫系統(tǒng)，特異性地激起多重免疫反應(yīng)，如體液免疫和細胞免疫[25]。目前，用于開發(fā)魚用疫苗的納米材料主要有納米脂質(zhì)體、合成聚合納米材料、無機納米材料和天然來源納米材料等。

3.1 脂質(zhì)納米材料

脂質(zhì)納米材料是由磷脂雙分子層包裹目標(biāo)分子形成類似生物膜的一種微型包囊體結(jié)構(gòu)，其生物相容性和可降解性有利于提高藥效和降低毒性，因此被廣泛用于藥物傳遞[26]。Reyes 等[27]利用一種陽離子脂質(zhì)體DOTAP（1， 2-diolyl-3-trimethylamine-propane）將VP2衣殼蛋白基因包裹后，疫苗更加穩(wěn)定，以口服遞送方式免疫大西洋鮭魚，魚群死亡率降低，受免疫大西洋鮭魚體內(nèi)抗體表達水平較高。脂質(zhì)體通常被制成納米顆粒，模仿病原體的特性，具有誘導(dǎo)體液和細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力[28]。

3.2 合成聚合納米材料

聚乳酸-羥基乙酸（polylactic acid-hydroxyaceticacid，PLGA）是常見的合成聚合有機物，由聚乳酸和聚乙醇組成，具有易降解、釋放時間長的特點，被食品藥品監(jiān)督管理局（Food and DrugAdministration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于藥物輸送、診斷和臨床和基礎(chǔ)科學(xué)研究[29]。Zhang等[30]利用PLGA納米顆粒包埋疫苗PMMMA-PLGA（PTRBL）/Trx-SIP，PMMMA 中羧基電離產(chǎn)生的負電荷具有排斥作用，屏蔽了疫苗納米粒子，使其在魚后腸中釋放，刺激并引發(fā)強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。該疫苗對胃中低pH和腸道的水解酶環(huán)境具有一定耐受性，可緩慢靶向釋放，且在機體內(nèi)易降解；但其部分成分為醫(yī)用級PLGA，價格高昂，因此難以實現(xiàn)大范圍推廣。

3.3 無機納米材料

與有機高分子納米材料相比，無機納米材料具有相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和較低的生產(chǎn)成本，主要包括各種金屬及氧化物、無機鹽、非金屬氧化物等，在應(yīng)用于納米疫苗之前需要進行修飾以改善其生物相容性[31]。介孔二氧化硅納米載體（mesoporous silica nanocarriers，MSN）具有廣泛的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，其生物相容性可以提高藥物的治療效率[32]。Zhang等[33]將溶藻弧菌的二氫脂酰胺脫氫酶（dihydroamide dehydrogenase， DLDH）抗原加載到MSN中，構(gòu)建MSN-DLDH納米疫苗傳遞系統(tǒng)，在其表面加以鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose pHthalate，HP55）包封抗原。該納米疫苗在人工胃液和腸液中相對穩(wěn)定，具有高負載量、pH可控制釋放、價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，但其不能完全抵抗胃酸的降解且在體內(nèi)積累，過多也會產(chǎn)生毒性。Hu 等[34]將CyHV- Ⅲ ORF149 表達載體與單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）偶聯(lián)制備疫苗，并通過腹腔注射魚群，免疫保護率達81.9%；在相同劑量下，SWCNTs載體疫苗的保護率比裸DNA疫苗高33.9%。

3.4 天然來源納米材料

天然來源的殼聚糖納米材料具有優(yōu)良的藥物傳遞載體性能，具有生物相容性、無毒、可降解等特性，易從腎臟排出。根據(jù)其抑菌、吸附螯合等性質(zhì)，可在機體內(nèi)緩慢持續(xù)地釋放藥物[35]。Zheng等[36]采用離子凝膠法制備了包裹質(zhì)粒DNA的殼聚糖納米顆粒pDNA-CS-NPs（chitosan nanoparticles， CSNPs），口服免疫多寶魚產(chǎn)生較強的免疫保護作用，相對存活率達68%。海藻酸鹽也是一種天然來源的納米材料，Ballesteros等[37]將凍干海藻酸鹽與傳染性胰腺壞死病病毒（infectious pancreaticnecrosis virus，IPNV）VP2 基因重組質(zhì)粒混合制備pcDNA-VP2疫苗，能有效誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)。天然來源的多功能多糖研究歷史悠長，再結(jié)合現(xiàn)代的新型技術(shù)，借鑒TRBIV疫苗的經(jīng)驗，將其制備成微球，黏附性好，可通過口、鼻、胃腸等黏膜給藥，適用于CyHV-Ⅱ口服疫苗的研發(fā)。

4 CyHV-Ⅱ疫苗類型和研發(fā)進展

目前，已知的魚類疫苗可分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗2種類型。傳統(tǒng)疫苗有滅活疫苗、弱毒疫苗等。CyHV-Ⅱ滅活疫苗免疫原性好，可引起機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，安全性高，制備簡單，但疫苗組分不確定，免疫效果不穩(wěn)定，需要加強接種[38]。

新型疫苗有基因工程疫苗、遺傳重組疫苗、合成肽段疫苗等。其中基因工程疫苗被廣泛研究和應(yīng)用，包括亞單位疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗、納米疫苗等。亞單位疫苗常利用免疫原性較強的膜蛋白和衣殼蛋白作為抗原?；钶d體疫苗在機體內(nèi)具備一定的增殖能力，可對機體產(chǎn)生持久的保護；但由于病毒的隨機變異性，成分相對不穩(wěn)定，有毒力返強的風(fēng)險，生物安全隱患較大。核酸疫苗在機體內(nèi)表達的抗原與天然抗原的構(gòu)象更為接近，免疫原性更強；但機體攝取質(zhì)粒效率較低，大部分易被降解。將納米材料作為遞送載體，可以有效保護抗原免受外界環(huán)境的影響，在改善靶向抗原呈遞、刺激先天性免疫、增強T細胞反應(yīng)等方面具有較好的作用[39]。

4.1 滅活疫苗

滅活疫苗是指將病原微生物及其代謝產(chǎn)物經(jīng)過理化方法處理，使其喪失感染性或毒性而保留免疫原性的一類制劑[40]。Ito等[41]用福爾馬林滅活的CyHV-Ⅱ作為抗原免疫金魚，免疫保護率為57%～63.6%。Dharmaratnam 等[42]研制CyHV-Ⅱ滅活疫苗免疫魚群后，累積死亡率下降，相對成活率達74.03%，免疫效果顯著，并能觸發(fā)魚體免疫基因的表達，但其免疫應(yīng)答反應(yīng)持續(xù)的時間較短，因此需要進行多次接種。

4.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是將抗原性相關(guān)蛋白重組表達制作成的疫苗，即把特定的抗原基因片段構(gòu)建在特定載體中表達產(chǎn)生抗原蛋白，具有批量生產(chǎn)、安全性強的優(yōu)點。

目前，CyHV-Ⅱ亞單位疫苗的研究多集中于衣殼蛋白制備的傳統(tǒng)亞單位疫苗[4344]、激酶蛋白重組疫苗[45]和表面囊膜蛋白重組疫苗[46]。Gao等[47]鑒定出CyHV-Ⅱ有74個蛋白，包含3種衣殼蛋白、18種膜蛋白、53種其他蛋白；其中有8種主要的免疫原性蛋白，包括4 種囊膜蛋白和3 種衣殼蛋白。Zhou 等[48] 研究表明，pORF25 是防治異育銀鯽GFHN感染的潛在候選疫苗。Dong等[49]利用酵母細胞表面展示技術(shù)研制了CyHV-Ⅱ口服疫苗，該疫苗增強了對異育銀鯽的保護作用，提高了異育銀鯽的存活率。亞單位疫苗由于成分清楚、副作用弱、免疫應(yīng)答反應(yīng)強等優(yōu)點在魚類中廣泛應(yīng)用；但其在制備過程中，必須純化以消除抗原中的內(nèi)毒素，且易產(chǎn)生不溶性、包涵體和非功能性蛋白。

4.3 核酸疫苗

核酸疫苗是將外源病原體的抗原相關(guān)基因插入表達載體中，并通過質(zhì)粒在體內(nèi)轉(zhuǎn)染宿主細胞并表達，可誘導(dǎo)免疫保護應(yīng)答，對魚體起到長時間的免疫保護作用[50]。Yuan等[51]基于CyHV-Ⅱ ORF25基因構(gòu)建的pEGFP-N1-ORF25 DNA 疫苗可誘導(dǎo)鯉魚產(chǎn)生特異性抗體，組織相容性基因在魚腎臟中的表達較高，免疫保護率達70%，表明以抗原基因ORF25 構(gòu)建的DNA疫苗具有較強的免疫保護作用。但質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞可引起宿主基因突變，導(dǎo)致機體表型改變甚至癌變死亡。此外，核酸疫苗在體內(nèi)持續(xù)表達產(chǎn)生抗原蛋白，易打破機體自身的免疫平衡，引發(fā)免疫耐受的相關(guān)病癥。

目前，對核酸疫苗中的表達載體進行基因構(gòu)建和改造，包括強啟動子、密碼子優(yōu)化、聯(lián)合多基因串連表達等，可制成多聯(lián)多價疫苗。通過以上方式優(yōu)化的核酸疫苗在免疫效應(yīng)方面有一定程度的增強，但其具體應(yīng)用及安全性等方面還待進一步研究。

4.4 活載體疫苗

活載體疫苗是指將致病病毒的抗原表位基因或者非致病基因進行整合后構(gòu)建的重組活載體疫苗，主要包括細菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗。Cao等[52]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建CyHV-Ⅱ的截短膜蛋白基因疫苗浸泡免疫健康異育銀鯽，實驗組的IL-11、IFNα 和補體組成基因C3 均顯著上調(diào)表達。Zhang等[53]構(gòu)建了重組桿狀病毒載體疫苗BacCarassius-D4ORFs六面體，分別通過口服和注射途徑接種異育銀鯽，相對存活率分別達59.3%和80.01%。

活載體疫苗可以穩(wěn)定分泌抗原蛋白，免疫后提高鯽魚的存活率，具有潛在的醫(yī)療價值，可用于CyHV-Ⅱ引起的鯉皰疹病毒感染的預(yù)防和治療。活載體疫苗保留的病毒活性成分常較難保存，需要冷藏或者冷凍保存，在常溫下易失去活性，且易被其他抗原和抗體影響免疫效果。同時，一些活載體病毒宿主范圍廣，對細胞趨向性和致病性不同，存在基因結(jié)構(gòu)改變致使毒力返強的問題，機體易出現(xiàn)不良反應(yīng)，安全性較低[54]。

4.5 納米遞送疫苗

納米疫苗是直徑1～100 nm范圍的小分子顆粒，其內(nèi)部或表面孔徑可附著引起免疫應(yīng)答的成分，傳遞至機體后引起免疫應(yīng)答反應(yīng)[24]。運用納米材料遞送抗原，其免疫原性增強，且穩(wěn)定性更好，便于貯存和運輸。貢成良等[55]公開了基于桿狀病毒表達系統(tǒng)制備包裹CyHV-Ⅱ抗原多角體的方法，用該病毒接種家蠶培養(yǎng)細胞，重組病毒表達的CyHV-Ⅱ的抗原蛋白被包裹進家蠶質(zhì)型多角體內(nèi)。翟秋明等[56]在其基礎(chǔ)上將微米級別疫苗設(shè)計成納米晶體包裹的亞單位疫苗，對抗原有防降解作用和緩控釋放作用。納米材料能夠增加抗原釋放和循環(huán)時間，有利于抗原靶向APCs，但其所載藥物的包封率較低，對機體細胞因子的表達分泌刺激有限[5758]，且與機體的相互作用機制尚未明晰，因此需要對納米疫苗的組成、包載及釋藥能力等進一步優(yōu)化，還需對其免疫作用機制進行深入研究。

免疫佐劑是納米遞送疫苗不可或缺的部分，在增強免疫系統(tǒng)對抗原的反應(yīng)方面起輔助作用，一些佐劑具有刺激細胞因子分泌和激活免疫信號通路的特性[59]。Huo等[60]構(gòu)建CyHV-Ⅱ的重組質(zhì)粒pcORF25 和pcCCL35.2，它們作為CyHV-Ⅱ的DNA疫苗和分子佐劑，在體內(nèi)和體外均得到有效的表達。Liu等[61]利用包含CyHV-Ⅲ包膜蛋白基因ORF25 和鯉魚IL-1β 基因的質(zhì)粒構(gòu)建DNA疫苗，用其免疫鯉魚，可在魚體中檢測到ORF25特異性抗體，而IL-1β的表達增強了亞單位疫苗的免疫效力。DNA 疫苗與分子佐劑結(jié)合是防治CyHV-Ⅱ感染的有效方法，可以保護金魚免受病毒侵襲，且應(yīng)激反應(yīng)弱、成本低，可在養(yǎng)殖場水平大規(guī)模口服接種，是一種有前景的魚類疫苗策略。

5 結(jié)語

近年來，金魚皰疹病持續(xù)大規(guī)模爆發(fā)，其發(fā)病急、致死率高，造成嚴重經(jīng)濟損失，因此該病的預(yù)防和治療對我國漁業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。對抗傳染病的方法，預(yù)防大于治療，研究出安全有效的疫苗迫在眉睫。CyHV-Ⅱ疫苗還處于實驗室研究階段，尚未有商品化疫苗上市（表1）。綜上傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗通過不同的途徑免疫魚群，大部分可誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)抗體，但與直接作用于靶點誘導(dǎo)黏膜免疫的CyHV-Ⅱ納米疫苗相比，其免疫原性不高，且利用效率較低。

目前，CyHV-Ⅱ疫苗在抗原選擇、傳遞機制、佐劑影響等方面尚缺乏深入研究，因此，在疫苗的設(shè)計、應(yīng)用和增強作用效果存在巨大的創(chuàng)新空間?；蚬こ桃呙缗c納米運載系統(tǒng)融合可迅速提高負載率，以應(yīng)對不斷變異的病毒。雖然現(xiàn)階段只有少數(shù)納米疫苗處于早期臨床階段，但在預(yù)防CyHV-Ⅱ方面已表現(xiàn)出巨大潛力。納米載體有利于提高疫苗的穩(wěn)定性、活性、安全性，可為CyHV-Ⅱ的預(yù)防提供更優(yōu)質(zhì)的策略。

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（責(zé)任編輯：張冬玲）