馮 嬌, 褚菲菲, 李 璐, 張 勇, 姜 珊, 孫志寧, 吳慧麗

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院, 河南 新鄉(xiāng), 453003; 2. 鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 消化內(nèi)科, 河南 鄭州, 450007)

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移是患者死亡的重要原因。有氧糖酵解代謝重編程是惡性腫瘤的特征之一,指腫瘤細(xì)胞在不利環(huán)境中為了滿足生長需求通常會改變自身代謝方式,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[1]。即使在氧氣充足的情況下,腫瘤細(xì)胞代謝方式也會從氧化磷酸化(OXPHOS)重新編程為有氧糖酵解,這種現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”[2]。糖酵解途徑很大程度上依賴于限速酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,因此腫瘤生長、侵襲和預(yù)后不良與這些基因的失調(diào)有關(guān)[3]。糖異生是一種逆糖酵解途徑,若激活會抑制代謝重編程,導(dǎo)致癌細(xì)胞中能量失衡和代謝應(yīng)激。PCK1是糖異生過程中的關(guān)鍵酶之一,其異常表達(dá)會激活致癌基因相關(guān)通路,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是指長度超過200個(gè)核苷酸單位且無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA轉(zhuǎn)錄本,其轉(zhuǎn)錄失調(diào)可參與癌癥典型特征的形成,進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展及對治療的敏感性[5]。lncRNA是多種腫瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,包括結(jié)直腸癌[6]。GHRLOS為生長素釋放肽的反義轉(zhuǎn)錄物[7], 是一種候選的lncRNA, 其分型GHRLOS2在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制目前尚不明確。本研究分析lncRNA GHRLOS2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及相關(guān)功能,并探討可能的調(diào)控機(jī)制,以期為探尋結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2021年9月—2023年3月鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院收治的30例經(jīng)病理學(xué)檢查確診結(jié)直腸癌患者的癌組織和對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本,患者術(shù)前均未接受任何輔助治療,標(biāo)本采集后儲存于-80 ℃冰箱中待檢。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會審核批準(zhǔn)(倫理批件號202242), 且所有患者知情同意。

1.2 主要材料

正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株(NCM460)、結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT116、SW480、RKO、LOVO、COLO205)、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自普諾賽生命科技有限公司; 胎牛血清購自美國Gibco公司; Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)相關(guān)試劑盒購自日本Takara公司, miRNA熒光定量PCR試劑盒購自天根公司。PCK1、U6、GAPDH引物購自上海華大基因科技有限公司; PCK1抗體購自美國Abcam公司,二抗購自北京博爾西科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng): 將正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株、結(jié)直腸癌細(xì)胞株加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。每隔1～2 d用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞,并更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞充分貼壁且融合度達(dá)到80%以上時(shí),使用胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于6孔板中,待6孔板細(xì)胞充分貼壁后使用PBS換液,每孔加入2 mL培養(yǎng)基,然后依次加入助轉(zhuǎn)染試劑及慢病毒,于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h, 觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 數(shù)據(jù)挖掘: ① 從TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織RNA測序數(shù)據(jù); 應(yīng)用R edgeR軟件包(version 3.30.3)對所有測序數(shù)據(jù)和差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行歸一化分析。② 功能富集分析,從GEO數(shù)據(jù)庫中下載編號為GSE134834的全基因組測序數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)集共有10個(gè)樣本(5例結(jié)直腸癌組織樣本和5例癌旁組織樣本)。利用GEO2R工具進(jìn)行差異性分析,設(shè)置P<0.05, |log2(FC)|>1, 篩選得到DEGs(104個(gè)上調(diào)的DEGs, 82個(gè)下調(diào)的DEGs)。通過MetascaPe在線數(shù)據(jù)庫對186個(gè)DEGs進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。③ 通過生物信息學(xué)軟件(Targetscan)預(yù)測微小RNA-33b-5p(miR-33b-5p)與PCK1的結(jié)合位點(diǎn)。④ 通過人類蛋白質(zhì)圖譜(HPA)數(shù)據(jù)庫分析PCK1蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 qRT-PCR檢測GHRLOS2和miR-33b-5p表達(dá): 收集細(xì)胞,使用Trizol試劑從細(xì)胞或組織中提取總RNA。測定RNA濃度后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。參照SYBR Green qRT-PCR試劑盒和miRNA熒光定量PCR試劑盒的說明書配置反應(yīng)液,然后放入PCR儀器中,設(shè)置反應(yīng)的溫度曲線,完成DNA擴(kuò)增。qRT-PCR引物序列見表1, 采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物及序列

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)GHRLOS2對HCT116、SW480細(xì)胞遷移能力的影響: 轉(zhuǎn)染后,將細(xì)胞接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞充分貼壁且貼壁面積達(dá)到80%～90%時(shí),使用無菌的10 μL槍頭以均勻壓力垂直于6孔板底部劃線。用PBS洗去懸浮細(xì)胞,更換無血清的新鮮培養(yǎng)液,隨后將6孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。0、12、24 h時(shí),分別于顯微鏡下拍攝劃痕區(qū)域照片,并應(yīng)用Image J軟件分析劃痕距離。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)GHRLOS2對HCT116、SW480細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響: 在無血清培養(yǎng)基中饑餓處理轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞。待貼壁面積達(dá)到80%以上,收集細(xì)胞,使用離心機(jī)以1 000 r/min離心3 min, 棄上清液。使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL。將細(xì)胞均勻接種于Transwell小室的上室中(避免產(chǎn)生氣泡),向下室中加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL, 靜置15 min后將細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中孵育48 h。孵育結(jié)束后,取出Transwell小室,吸走小室中的培養(yǎng)基,并用PBS小心清洗,用棉簽擦除多余細(xì)胞。使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min, 以PBS洗滌2次后將小室底面浸入0.1%結(jié)晶紫中染色5～10 min。晾干后,使用顯微鏡觀察并拍照,使用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)則需要將60 μL基質(zhì)膠均勻涂布于Transwell上室底部,然后于培養(yǎng)箱中孵育3 h進(jìn)行水化處理,其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.3.7 葡萄糖含量檢測試劑盒檢測過表達(dá)GHRLOS2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖含量: 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的上清液,按一定比例加入蒸餾水,以超聲波破碎細(xì)胞后置于沸水浴中煮沸10 min, 冷卻后取上清液備用。參照說明書依次設(shè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管,渦旋混勻,在恒溫培養(yǎng)箱反應(yīng)15 min, 于505 nm波長處檢測吸光度。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PCK1蛋白表達(dá)水平: 使用含有苯甲磺酰氟的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞,并提取每個(gè)樣品的總蛋白。使用BCA試劑盒定量蛋白濃度。檢測濃度和純度后,將每個(gè)樣品的總蛋白于100 ℃下變性10 min, 然后通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。于5%脫脂奶粉中封閉2 h后,在4 ℃條件下使用抗人PCK1一抗(1∶40 000)和β-actin一抗(1∶1 000)對膜進(jìn)行探針檢測。沖洗后,于室溫下使用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗處理膜2 h。使用ECL試劑(Beyotime)進(jìn)行蛋白條帶顯影,并應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 GHRLOS2在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)

GEO數(shù)據(jù)庫GSE39582數(shù)據(jù)集分析結(jié)果顯示, GHRLOS2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)低于正常結(jié)直腸組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1A; GHRLOS2低表達(dá)與更高的腫瘤分期相關(guān)(P<0.05), 且提示更差的預(yù)后(P<0.05, HR>1), 見圖1B、1C。

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織樣本中的GHRLOS2表達(dá)水平低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖1D; 與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460比較, 5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的GHRLOS2表達(dá)水平均降低(尤其是SW480、HCT116細(xì)胞),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1E。本研究進(jìn)一步分析30例結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征后發(fā)現(xiàn), GHRLOS2表達(dá)與Grade分級、Stage分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)(P<0.05), 見表2。

表2 30例結(jié)直腸癌患者GHRLOS2表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)GHRLOS2的結(jié)直腸癌細(xì)胞系

本研究選取GHRLOS2表達(dá)水平低的HCT116、SW480細(xì)胞,利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)GHRLOS2的細(xì)胞系。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)GHRLOS2(oe-GHRLOS2)的HCT116細(xì)胞、SW480細(xì)胞的GHRLOS2相對表達(dá)水平均高于陰性對照(oe-NC)細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

2.3 過表達(dá)GHRLOS2抑制 SW480、HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力

基于上述研究推測, GHRLOS2可能作為一種腫瘤抑制性lncRNA發(fā)揮作用。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與oe-NC細(xì)胞相比, oe-GHRLOS2細(xì)胞的遷移能力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖3。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與oe-NC細(xì)胞相比, oe-GHRLOS2細(xì)胞的遷移能力、侵襲能力均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4。

2.4 過表達(dá)GHRLOS2抑制 SW480、HCT116細(xì)胞的糖酵解水平

應(yīng)用GEO2R工具對GEO數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸癌相關(guān)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異性分析,共發(fā)現(xiàn)186個(gè)DEGs(104個(gè)上調(diào), 82個(gè)下調(diào))。對186個(gè)DEG進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),糖酵解/糖異生信號通路相關(guān)基因顯著富集,見圖5A。葡萄糖含量檢測結(jié)果顯示, oe-GHRLOS2細(xì)胞的葡萄糖含量高于oe-NC細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖5B。

2.5 GHRLOS2在結(jié)直腸癌中充當(dāng)miR-33b-5p的分子海綿

lncRNAs的生物學(xué)功能高度依賴于其在細(xì)胞中的定位,本研究應(yīng)用在線生物信息學(xué)工具(iLoc-LncRNA)分析后發(fā)現(xiàn), GHRLOS2主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖6A),表明GHRLOS2參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)lncRNAs常作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)調(diào)節(jié)靶基因的水平,為了探討GHRLOS2是否通過ceRNA模式調(diào)控CRC的進(jìn)展,本研究基于starBase v3、LncBase v2、miRTarBase數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行miRNA-lncRNA及miRNA-mRNA互作關(guān)系分析,共得到8個(gè)候選的miRNA,見圖6B。由于GHRLOS2可能通過ceRNA機(jī)制發(fā)揮功能,本研究進(jìn)一步篩查GHRLOS2、8個(gè)候選miRNA和61個(gè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)關(guān)系,最終識別出miR-33b-5p。此外,結(jié)直腸癌組織樣本的miR-33b-5p表達(dá)水平高于對應(yīng)的癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖6C。

2.6 PCK1是miR-33b-5p的下游基因

Targetscan軟件預(yù)測結(jié)果顯示,PCK1是miR-33b-5p的靶標(biāo),見圖7A。TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫(GSE21510、GSE39582數(shù)據(jù)集)分析結(jié)果顯示,與正常結(jié)直腸組織相比,PCK1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖7B。結(jié)直腸癌患者30對臨床樣本檢測結(jié)果顯示,PCK1在腫瘤組織中的相對表達(dá)水平低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001), 見圖7C?；贖PA數(shù)據(jù)庫分析正常結(jié)直腸組織和腫瘤組織樣本的PCK1蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)正常結(jié)直腸組織樣本中PCK1蛋白呈中度染色,腫瘤組織樣本中PCK1蛋白呈低度染色,提示結(jié)直腸癌組織中PCK1蛋白表達(dá)減少,見圖7D。

2.7 GHRLOS2通過海綿化miR-33b-5p調(diào)控PCK1的表達(dá)

qRT-PCR、Western blot檢測結(jié)果顯示,與oe-NC細(xì)胞相比, oe-GHRLOS2細(xì)胞的PCK1表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖8A、8B。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與oe-NC細(xì)胞相比, oe-GHRLOS2細(xì)胞的miR-33b-5p表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見圖8C。由此提示, GHRLOS2通過miR-33b-5p調(diào)控PCK1的表達(dá),進(jìn)而影響糖酵解及細(xì)胞的侵襲、遷移能力,見圖9。

3 討 論

lncRNAs是重要的調(diào)控分子,與癌癥的發(fā)生進(jìn)展相關(guān),可作為癌癥診斷和預(yù)后評估的重要生物標(biāo)志物[8-9]。lncRNA GHRLOS(生長素釋放肽基因GHRL的反義鏈上發(fā)現(xiàn)的基因)編碼的生長素釋放肽具有抗炎作用,有助于預(yù)防腫瘤發(fā)生[7]。GHRLOS通過激活A(yù)MPK信號通路拮抗“Warburg效應(yīng)”,進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[10]。GHRLOS是miR-346的分子海綿,通過協(xié)同調(diào)節(jié)APC表達(dá)而抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[11]。此外, GHRLOS還被證實(shí)為腫瘤轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物及大腸癌的預(yù)后指標(biāo)[12]。本研究發(fā)現(xiàn), GHRLOS2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁非腫瘤組織,且GHRLOS2表達(dá)與Grade分級、Stage分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)GHRLOS2可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移及葡萄糖代謝,提示GHRLOS2在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。

ceRNA假說認(rèn)為, mRNA、lncRNA和環(huán)狀RNA(circRNA)等RNA分子可通過共享的miRNA應(yīng)答元件(MREs)靶向miRNA, 從而調(diào)控miRNA下游靶基因的表達(dá)[13-14]。在骨肉瘤中, KCNQ1OT1通過海綿化miR-34c-5p發(fā)揮ceRNA的作用,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和能量代謝重編程[15]。LINC00958通過海綿化miR-490-3p上調(diào)AURKA表達(dá),從而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展[16]。lncRNA的作用模式很大程度上與其亞細(xì)胞定位有關(guān),其中細(xì)胞質(zhì)lncRNAs通過充當(dāng)miRNAs的分子海綿發(fā)揮作用。本研究基于在線生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn), GHRLOS2主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。此外, qRT-PCR檢測結(jié)果顯示, miR-33b-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平較高,與GHRLOS2表達(dá)呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步支持了兩者存在反向調(diào)控關(guān)系的推測。

研究[17]發(fā)現(xiàn),在無線粒體缺陷的低氧條件下,乳酸發(fā)酵速率顯著增加,這一現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”?！癢arburg效應(yīng)”可使細(xì)胞產(chǎn)生更多的乳酸,造成細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境酸中毒,為腫瘤細(xì)胞提供生長條件,并保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊,其被認(rèn)為是癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[18]。腫瘤從無氧糖酵解中獲得能量,因此,作為糖酵解逆反應(yīng)的糖異生或可成為有效的治療靶點(diǎn)。PCK1是糖酵解逆反應(yīng)糖異生的關(guān)鍵酶,不僅發(fā)揮代謝功能,如調(diào)節(jié)糖異生、甘油生成、絲氨酸生物合成及氨基酸代謝,還在糖尿病、肥胖癥、癌癥、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[19]。PCK1在結(jié)直腸癌中低表達(dá),并通過抑制UBAP2L蛋白絲氨酸454位點(diǎn)的磷酸化和增強(qiáng)自噬,抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[20]。本研究借助TargetScan軟件成功預(yù)測了miR-33b-5p與PCK1之間的靶向作用,隨后通過臨床組織樣本及相關(guān)細(xì)胞系驗(yàn)證發(fā)現(xiàn), PCK1在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果顯示, GHRLOS2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平與miR-33b-5p呈負(fù)相關(guān),推測miR-33b-5p靶基因PCK1的表達(dá)可能受到GHRLOS2的間接調(diào)節(jié)。本研究基于過表達(dá)GHRLOS2實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), miR-33b-5p表達(dá)顯著下調(diào), PCK1表達(dá)顯著上調(diào),進(jìn)一步提示GHRLOS2可能作為miR-33b-5p的分子海綿,介導(dǎo)對PCK1表達(dá)的調(diào)控作用。

綜上所述, GHRLOS2作為一種新型的抑癌lncRNA,在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),其可通過發(fā)揮miR-33b-5p的分子海綿作用,上調(diào)PCK1表達(dá)水平,從而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。GHRLOS2有望作為結(jié)直腸癌的新型生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn),為該疾病的臨床篩查及靶向治療提供新思路。