李秀貞,王叢香,王 猛,閆會(huì)霞,楊 越,高娟娟,張 鵬

0 引 言

糖尿病高危足是糖尿病(Type 2 diabetes, T2D)的常見和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,也是糖尿病足截肢的最重要前兆[1]。然而,與糖尿病高危足相關(guān)的主要機(jī)制仍未確定。因此,迫切需要更好地了解導(dǎo)致糖尿病高危足的潛在疾病機(jī)制,以便為糖尿病高危足制定有效的治療策略。近年來研究發(fā)現(xiàn)了一組新的普遍存在的小的非編碼RNAs,稱為microRNAs(miRNAs),它們正在成為各種生物過程和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[2]。此外,miRNAs在葡萄糖平衡和糖尿病發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的miRNAs與胰腺發(fā)育、胰島素分泌和β細(xì)胞功能紊亂有關(guān)[3]。除了高血糖,miRNAs還參與了炎癥反應(yīng),以及血管內(nèi)皮損傷和纖維化過程[4]。因此,miRNAs可能參與常見高危足的發(fā)生和發(fā)展?，F(xiàn)有的一些證據(jù)表明,miRNAs在血液循環(huán)中可以穩(wěn)定檢測,可以作為各種疾病(包括糖尿病)的潛在非侵入性生物標(biāo)志物[5]。然而,目前對糖尿病高危足患者的血清miRNAs進(jìn)行系統(tǒng)分析的研究很少。因此,本研究旨在系統(tǒng)評估糖尿病患者和糖尿病高危足患者以及非糖尿病患者的血清樣本中的miRNA表達(dá)模式。

1 資料與方法

1.1 研究對象和標(biāo)本采集收集2021年6月至2022年6月期間在河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的92例T2D患者。其中46例被診斷為高危足但沒有足部潰瘍(瓦格納分類0級(jí)),納入T2D高危足組;其余患者納入T2D組。納入標(biāo)準(zhǔn):所有受試者沒有嚴(yán)重的心臟病(沒有不穩(wěn)定的心絞痛、急性心肌梗塞和充血性心力衰竭),沒有嚴(yán)重的肝病(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶<1.5倍上限),也沒有嚴(yán)重的腎功能障礙(血清肌酐<132.6 μmol/L,估計(jì)腎小球?yàn)V過率>60 mL/min/1.73 m2或癌癥潰瘍傷口;受試者在過去6個(gè)月內(nèi)沒有使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或外源性細(xì)胞因子。排除標(biāo)準(zhǔn):參與者患有1型糖尿病、其他類型的糖尿病、嚴(yán)重感染、急性腦血管疾病或近期手術(shù)。選擇在同一醫(yī)院健康管理中心接受體檢的46例糖耐量正常的健康人作為對照組。對照組的參與者沒有下肢動(dòng)脈或靜脈病變或皮膚潰瘍。健康檢查包括詳細(xì)的病史、體檢和驗(yàn)血。在參與者最近一次進(jìn)餐后至少12 h,用血清空心管收集血液,并立即在1500×g下離心10 min,分離血清。將血清樣本保存在-80 ℃,直到miRNA分析。

1.2RNA分離、TaqMan低密度陣列和RT-qPCR檢測采用了基于RT-qPCR的TaqMan低密度陣列(TLDA)芯片分析24例T2D患者、24例T2D高危足患者和24例健康對照者的三個(gè)集合血清樣本池的miRNA譜[6]。

1.2.1RNA分離、TaqMan低密度陣列使用Trizol試劑(Invitrogen)從每個(gè)匯集的血清樣本中提取總RNA。得到的RNA顆粒被溶解在20 μL DEPC處理過的水中,并儲(chǔ)存在-80 ℃,直到進(jìn)一步分析。然后在ABI PRISM 7900HT上用低密度陣列(TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0,購自美國Life Technologies公司)檢測754個(gè)不同的人類miRNA譜。miRNA的表達(dá)水平以閾值周期(Cq)值表示,并按照制造商的建議對每個(gè)池中的內(nèi)源U6進(jìn)行歸一化。

1.2.2RT-qPCR檢測對于血清RT-qPCR檢測,采用一步法苯酚/氯仿純化方案從100 μL血清中提取總RNA。使用SYBR Green(美國Applied Biosystems公司)對從血清中提取的RNA進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。為了控制RNA提取和純化過程中的變化,在RNA分離過程中,將外源植物miRNA MIR2911(5'-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3')添加到每個(gè)樣品中,最終濃度為106fmol/L,作為血清miRNA正常化的合成外部參考。靶向miRNA的相對水平隨后被歸一化為MIR2911,并使用比較Cq方法(2-ΔCq)進(jìn)行計(jì)算。ΔCq是通過從目標(biāo)miRNAs的Cq值中減去MIR2911的Cq值來計(jì)算。然后用T2DM患者的平均2-ΔCq值除以對照組的平均2-ΔCq值來確定2-ΔCq。

1.3血清生化參數(shù)測定使用商業(yè)試劑盒(美國RANDOX公司)在日立7600分析儀(日本日立公司)上測量血清TC、TG、LDL和HDL的濃度。使用商業(yè)試劑盒(日本TOSOH公司)在HLC-723GB自動(dòng)分析儀(日本TOSOH公司)上測量HbA1C的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 人口學(xué)和臨床特征T2D組和T2D高危足組BMI、收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)明顯高于對照組(P<0.05)。與對照組相比,T2D組和T2D高危足組血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度也明顯升高(P<0.05),而血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平則明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 T2D、T2DM高危足和對照組的人口學(xué)和臨床特征

2.2研究對象的血清miRNAs的TLDA分析Pearson相關(guān)分析顯示,T2D組和對照組之間的相關(guān)系數(shù)(r)值為0.825,T2D高危足組和對照組之間的r為0.819。此外,T2D組和T2D高危足組的r為0.872,表明三組之間存在一個(gè)共同但差異表達(dá)的血清miRNA表達(dá)譜。見圖1。

a、b、c:分別為T2D組和對照組、T2D高危足組和對照組、T2D組和T2D高危足組的相關(guān)分析

TLDA分析結(jié)果顯示,在評估的754個(gè)miRNAs中,與對照組相比,兩組T2D患者中有25個(gè)上調(diào),118個(gè)下調(diào)。對于失調(diào)的miRNAs,選擇了11個(gè)(miR-23、miR-195-5p、miR-205-5p、miR-203、miR-1208、miR-664、miR-584、miR-1303、miR-770-5p、miR-892b、miR-886-5p)在兩組T2D患者中明顯增加的miRNAs,且T2D高危足組的折疊變化>10,用單個(gè)血清樣本進(jìn)一步進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示與對照組相比,包括miR-23、miR-195-5p、miR-205-5p、miR-203在內(nèi)的4個(gè)miRNA的水平在T2D組和T2D高危足組患者中均顯著增加(P<0.05)。此外,T2D高危足組患者的上述4個(gè)血清miRNA的水平高于T2D組患者(P<0.05)。見表2。

表2 RT-qPCR檢測T2D、T2DM高危足和對照組血清樣品中miRNA的相對水平

2.3單變量和多變量的邏輯回歸分析以對照組為參考類別,當(dāng)T2D伴有或不伴有高危足疾病組被視為因果兩類變量時(shí),所選的4個(gè)血清miRNAs與單純T2D和T2D高危足獨(dú)立相關(guān)。為了進(jìn)一步評估這些血清miRNAs與高危足類別的關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)當(dāng)T2D組被作為參考類別時(shí),所有這4種miRNAs都與高危足獨(dú)立相關(guān)。然而,在進(jìn)一步多變量分析中,以對照組為參考類別時(shí),僅miR-195-5p(OR=6.9,95%CI:2.0～24.2,P=0.003)和miR-205-5p(OR=7.2,95%CI:1.6～32.0,P=0.009)與單純T2D獨(dú)立相關(guān),和miR-195-5p(OR=6.9,95%CI:2.0～24.2,P<0.001)、miR-205-5p(OR=11.0,95%CI:2.8～43.2,P=0.001)與T2D高危足獨(dú)立相關(guān)。當(dāng)T2D組被作為參考類別時(shí),僅miR-195-5p(OR=3.0,95%CI:1.6～5.7,P=0.001)和miR-205-5p(OR=2.3,95%CI:1.2～4.2,P=0.012)與T2D高危足獨(dú)立相關(guān),見表3、表4。

表3 T2D和T2D高危足的血清miRNAs的單變量邏輯回歸分析

表4 T2D和T2D高危足的血清miRNAs的多變量邏輯回歸分析

2.4ROC曲線分析miR-195-5p和miR-205-5p在區(qū)分T2D組和對照組時(shí)的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.74和0.70,在區(qū)分T2D高危足組和對照組時(shí)的AUC為0.87和0.84,在區(qū)分T2D組和T2D高危足組時(shí)的AUC為0.65和0.62,見表5,圖2。上述結(jié)果表明,這2個(gè)miRNA對T2D高危足具有相對較高的診斷價(jià)值。

圖2 ROC曲線分析血清miR-195-5p和miR-205-5p區(qū)分對照、T2D、T2DM高危足病例的能力

表5 ROC曲線分析血清miR-195-5p和miR-205-5p區(qū)分對照、T2D、T2DM高危足病例的能力

3 討 論

血漿中循環(huán)miRNAs水平的改變與各種疾病和治療效果有關(guān)。近年來,有幾項(xiàng)研究對血清、血漿或血細(xì)胞miRNA譜的特定特征進(jìn)行了描述和定義,以試圖開發(fā)新的方法來預(yù)測和監(jiān)測T2D的發(fā)展和進(jìn)展[7]。上述研究提出了使用循環(huán)miRNA作為T2D疾病的新生物標(biāo)志物的可能性。然而,目前仍缺乏對有和無高危足的T2D患者的血清miRNAs動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)分析。在本研究中,我們利用高通量TLDA技術(shù)確定了T2D患者和無高危足患者的全局血清miRNA表達(dá)譜,然后在單個(gè)樣本中進(jìn)行RT-qPCR確認(rèn),成功確定了4種miRNA的譜系,包括miR-23、miR-195-5p、miR-205-5p和miR-203,它們的表達(dá)在T2D患者血清中顯著增加。此外,這4個(gè)miRNA在T2D高危足組中的水平明顯高于單純T2D患者。統(tǒng)計(jì)分析表明,確定的miRNAs與T2D高危足密切相關(guān)。因此,我們假設(shè)這4個(gè)循環(huán)miRNAs可能參與T2D和高危足并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制。

目前,關(guān)于T2D以及其高危足并發(fā)病的主要機(jī)制仍然不清楚,而且沒有一個(gè)明確的治療方法。用于早期檢測這種疾病的生物標(biāo)志物和識(shí)別有發(fā)生并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體將大大改善病人的護(hù)理。然而,目前沒有一種新型的生物標(biāo)志物可以有效地預(yù)測T2D[8]。既往研究表明,細(xì)胞外的miRNAs穩(wěn)定地出現(xiàn)在循環(huán)中,可以作為有希望的糖尿病診斷生物標(biāo)志物[9]。Jimenez-Lucena等[10]在T2D患者循環(huán)中確定了10個(gè)下調(diào)miRNAs,并證實(shí)了它們是區(qū)分T2D患者和對照組的有用生物標(biāo)志物,血漿miR-126表達(dá)的減少與未來糖尿病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。上述結(jié)果在最近的兩項(xiàng)研究中得到證實(shí),描述了循環(huán)的miR-126可以發(fā)展成為一種非侵入性的有用的診斷工具,用于預(yù)測容易發(fā)展為T2D的個(gè)體[11-12]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),與糖尿病前期個(gè)體和/或糖耐量正常的T2D易感個(gè)體相比,新發(fā)T2D中7個(gè)與糖尿病有關(guān)的miRNAs明顯升高[13]。然而,與上述發(fā)現(xiàn)相比,本研究沒有觀察到改變的miRNAs的重疊情況。我們推測,這種不一致可能不僅是由樣本特性產(chǎn)生的,也可能與以下因素有關(guān):①以前的研究中使用了miRCURY LNATMmicroRNA PCR系統(tǒng)和SYBR Green qPCR SuperMix-UDG方法,而本研究主要基于TaqMan探針的RT-qPCR來檢測單個(gè)血清樣品中的miRNA水平;②這些研究中使用了不同的歸一化方法。在既往研究中,循環(huán)miRNA表達(dá)水平被歸一化為U6、合成細(xì)胞-miR-39或未經(jīng)調(diào)整的Ct值,而在本研究中,血清miRNA表達(dá)水平被歸一化為一種尖銳的外源性RNA(miR2911)。因此,迫切需要進(jìn)行大型的前瞻性和多中心研究,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的樣品制備、RNA提取和miRNA數(shù)據(jù)分析方案來確定診斷T2D的可靠miRNA特征。

既往研究表明,miRNA可以由各種細(xì)胞主動(dòng)或被動(dòng)釋放。此外,循環(huán)中的miRNA通過微囊、Ago蛋白復(fù)合物或HDL運(yùn)輸,并能以活性形式轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞[14]。基于上述結(jié)果,在T2D和T2D高危足的過程中,來自特定細(xì)胞群的改變的miRNA可能提供有關(guān)糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的目標(biāo)組織的生理或病理狀態(tài)的詳細(xì)信息。在我們確定的4個(gè)miRNA中,miR-23參與了胰島素生物生成的調(diào)節(jié)和SNAIL觸發(fā)的上皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變[15]。miR-205-5p是一個(gè)已知的抗血管生成因子,研究發(fā)現(xiàn)miR-205-5p表達(dá)減少抑制導(dǎo)致胃癌等中VEGF信號(hào)的過度激活[16]。此外,氧化應(yīng)激抑制了miR-205-5p在視網(wǎng)膜上皮ARPE-19細(xì)胞中的表達(dá);因此,VEGFA表達(dá)和血管生成增加,這可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的一個(gè)潛在機(jī)制[17]。研究發(fā)現(xiàn),在T2D的背景下,高血糖誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞中miR-195-5p的表達(dá)水平,并與糖尿病心肌病的發(fā)展有關(guān)[18]。miR-203被稱為“皮膚特異性miRNA”,研究發(fā)現(xiàn)miR-203的表達(dá)在糖尿病足部潰瘍傷口的皮膚組織中增加,并與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[19]。本研究多變量分析確定了miR-195-5p和miR-205-5p與單純T2D和T2D高危足獨(dú)立相關(guān),并且兩者在區(qū)分T2D組和T2D高危足組時(shí)具有相對較高的診斷價(jià)值。因此,miR-195-5p、miR-205-5p可能在T2D高危足的病理中發(fā)揮潛在作用。

綜上所述,本研究確定了miR-195-5p、miR-205-5p可能成為T2D及高危足的新型風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo),并可能在T2D及高危足的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。