林佛財(cái) 黃銘發(fā) 林志業(yè) 戴永武

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，本病發(fā)病隱匿，認(rèn)知功能緩慢減退，是老年人群癡呆癥的最常見類型，也是造成老年人群殘疾和死亡的重大疾病之一［1-2］。近年來，隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，AD 的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，目前，60 歲以上老年人群AD 患病率高達(dá)18.7%［3］。AD 主要神經(jīng)病理改變?yōu)榧?xì)胞外β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化tau 蛋白（phosphorylated tau protein，P-tau）聚集，由此組成的神經(jīng)纖維纏結(jié)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞之間的連接喪失，進(jìn)而神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終神經(jīng)元變性、萎縮甚至丟失，認(rèn)知功能減退［4］。AD 具體病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未研制出本病所致神經(jīng)損害的特效藥物，早期診斷、早期干預(yù)有利于延緩疾病的進(jìn)展［5］。研究發(fā)現(xiàn)，AD 的發(fā)生與位于毛細(xì)血管壁的周細(xì)胞密切相關(guān)［6］，作為一種收縮細(xì)胞，周細(xì)胞在維持血腦屏障的完整性、調(diào)節(jié)腦組織血流量方面具有重要作用［7］。另外，周細(xì)胞還可促進(jìn)tau 蛋白的磷酸化，參與Aβ 的聚集和清除，促進(jìn)AD 患者神經(jīng)退化和認(rèn)知障礙的進(jìn)展［8］。血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）是主要來源于間充質(zhì)細(xì)胞的第三類受體酪氨酸激酶，包括PDGFRα 和PDGFRβ 2 種分子亞型［9］，研究發(fā)現(xiàn)，PDGFRβ 在周細(xì)胞中呈明顯高表達(dá)，可作為周細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物［10］。本研究觀察AD 患者腦脊液PDGFRβ 含量變化，并探討腦脊液PDGFRβ 與認(rèn)知損害情況腦脊液生物標(biāo)志物的相關(guān)性，為AD 的早期診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年3月至2022年12月惠州市第三人民醫(yī)院收治的126例AD 患者作為AD 組，參照臨床癡呆評(píng)定量表（Clinical Dementia Rating，CDR）評(píng)分［11］，將126例AD 患者分為輕度組（CDR 1分，41例）、中度組（CDR 2 分，47例）和重度組（CDR 3分，38例）。選擇同期于本院住院認(rèn)知功能正常人員60例作為對(duì)照組。AD 組：男性76例，女性50例；年齡49～79 歲，平均（66.85±7.49）歲；身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18.8～28.1 kg/m2，平均（22.96±2.07）kg/m2；平均受教育年限（7.12±2.83）年；合并高血壓39例，糖尿病28例。對(duì)照組：男性36例，女性24例；年齡47～78 歲，平均（65.19±8.30）歲；BMI 18.5～28.3 kg/m2，平均（22.82±2.11）kg/m2；平均受教育年限（7.38±2.91）年；合并高血壓19例，糖尿病15例。AD組和對(duì)照組年齡、性別、BMI、受教育年限等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開展（審批文號(hào)：2020-HZDSR-106）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) AD 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合AD［12］診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡＜80 歲；③初診為AD，未接受相關(guān)治療；④患者本人及家屬同意參加本研究，并簽署協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦血管疾病、顱腦創(chuàng)傷等其他病因所致的認(rèn)知功能障礙者；②合并血管性癡呆、帕金森病、精神心理疾病等；③心肝腎功能障礙、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等；④身體各臟器嚴(yán)重感染性疾??；⑤不能接受腰穿操作者。對(duì)照組認(rèn)知功能均正常，無腦血管疾病、帕金森病、AD 等影響認(rèn)知功能的疾病。

1.3 方法

1.3.1 認(rèn)知功能評(píng)估 簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表（minimental state examination，MMSE）：評(píng)價(jià)內(nèi)容包括5 個(gè)領(lǐng)域11 個(gè)問題，滿分30 分，其中定向力10 分，記憶力3分，語言能力9 分，回憶能力3 分、注意力和計(jì)算能力5分，評(píng)分越低表示認(rèn)知功能越差。蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（montreal cognitive assessment，MoCA）：包括抽象思維、執(zhí)行功能、語言、記憶等8 個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域，共11 個(gè)項(xiàng)目，滿分30 分，評(píng)分越高表示認(rèn)知功能越好。

1.3.2 腦脊液檢測(cè) 所有受試者均于上午空腹行腰椎穿刺，抽取腦脊液6 mL 置于無菌試管，以2 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，4℃環(huán)境下靜置60 min，取上清低溫（-80℃）保存待測(cè)。酶聯(lián)免疫法測(cè)定腦脊液PDGFRβ、Aβ1-40、Aβ1-42、總tau 蛋白（total tau，Ttau）、P-tau 水平，計(jì)算Aβ1-40/Aβ1-42，PDGFRβ 試劑盒購自上海賽默飛世爾科技公司，Aβ1-40、Aβ1-42、Ttau、P-tau 試劑盒購自日本Fujirebio 公司，操作過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）4 基因型測(cè)定 所有受試者均抽取上午空腹靜脈血3 mL，置于EDTA-K2 抗凝試管，4℃冰箱保存，并于2 h 內(nèi)應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行ApoE 基因型分析，首先按照EasyPure血液基因組DNA 試劑盒（北京全式金生物公司）說明書提取DNA，然后對(duì)基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增（正向引物：5’-GGCACGCTGTCCAAGGA-3’，反向引物：5’-CTCGCGGATGCGCTGAG3’），擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35 個(gè)循環(huán)。將所得產(chǎn)物加入2 U haI 限制性內(nèi)切酶（美國(guó)NEB 公司），37℃環(huán)境下過夜，次日加載到12%聚丙烯酰胺非變性凝膠上，電泳3 h，根據(jù)酶切片段大小判定ApoE4 基因類型。

1.4 觀察指標(biāo) 比較AD 組和對(duì)照組MMSE、MoCA評(píng)分及腦脊液PDGFRβ、Aβ1-40、Aβ1-42、T-tau、P-tau含量，并比較輕、中和重度組上述指標(biāo)的差異；比較AD組是否攜帶載脂蛋白E（ApoE）4 基因患者腦脊液PDGFRβ，分析AD 組腦脊液PDGFRβ 與MMSE、MoCA評(píng)分、Aβ1-42、T-tau、P-tau、Aβ1-40/Aβ1-42 的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，兩組間均數(shù)比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，各指標(biāo)之間相關(guān)性應(yīng)用Pearson 相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD 組和對(duì)照組認(rèn)知功能和腦脊液生物標(biāo)志物含量比較 AD 組MMSE、MoCA 評(píng)分均低于對(duì)照組，腦脊液T-tau、P-tau、PDGFRβ 含量高于對(duì)照組，腦脊液Aβ 1-42 含量Aβ1-40/Aβ1-42 低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 AD組和對(duì)照組認(rèn)知功能和腦脊液生物標(biāo)志物含量比較（±s）

表1 AD組和對(duì)照組認(rèn)知功能和腦脊液生物標(biāo)志物含量比較（±s）

注：MMSE為簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表，MoCA為蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表，Aβ1-40為β淀粉樣蛋白-40，Aβ1-42為β淀粉樣蛋白-42，T-tau為總tau蛋白，P-tau為磷酸化tau蛋白，Aβ1-40/Aβ1-42為β淀粉樣蛋白-40與β淀粉樣蛋白-42比值，PDGFRβ為血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β。

組別對(duì)照組AD組t值P值例數(shù)60 126 MMSE（分）28.31±1.24 14.26±3.65 28.995＜0.001 MoCA（分）27.89±1.73 9.33±2.16 58.230＜0.001 Aβ1-40（ng/mL）7.31±2.18 7.97±2.24 1.895 0.060 Aβ1-42（ng/mL）0.39±0.12 0.27±0.08 8.080＜0.001 T-tau（ng/mL）0.18±0.04 0.57±0.15 19.782＜0.001 P-tau（pg/mL）41.68±7.22 80.70±9.28 28.683＜0.001 Aβ1-40/Aβ 1-42 0.06±0.02 0.04±0.02 7.540＜0.001 PDGFRβ（ng/mL）0.18±0.07 0.22±0.06 4.024＜0.001

2.2 AD 組不同病情患者認(rèn)知功能和腦脊液生物標(biāo)志物含量比較 輕、中、重度組MMSE、MoCA 評(píng)分逐漸減低，腦脊液P-tau、PDGFRβ 含量逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。重度組MMSE、MoCA 評(píng)分低于中度組和輕度組，中度組低于輕度組；重度組腦脊液P-tau、PDGFRβ 含量高于中度組和輕度組，中度組高于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 輕、中和重度組認(rèn)知功能、腦脊液生物標(biāo)志物含量比較（-x±s）

2.3 相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析顯示，AD 患者腦脊液PDGFRβ 含量與MMSE、MoCA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與腦脊液P-tau 含量呈正相關(guān)（P＜0.05），與腦脊液Aβ1-40、Aβ1-42、T-tau 含量、Aβ1-40/Aβ1-42 均無相關(guān)性（P＞0.05）。見表3。

表3 AD組腦脊液PDGFRβ含量與認(rèn)知功能和其他腦脊液生物標(biāo)志物含量的相關(guān)性分析

2.4 AD 組不同ApoE4 基因類型患者腦脊液PDGFRβ含量比較 126例AD 組患者中，ApoE4+患者74例，腦脊液PDGFRβ 含量平均為（0.23±0.08）ng/mL，ApoE4-患者52例，腦脊液PDGFRβ 含量平均為（0.22±0.09）ng/mL，AD 組ApoE4+與ApoE4-患者腦脊液PDGFRβ 含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.656，P=0.513）。

3 討論

AD 是常見的中樞神經(jīng)退行性改變，患者認(rèn)知損傷、記憶力逐漸下降，社會(huì)和生活功能逐漸降低，成為影響老年人群生命和健康的嚴(yán)重疾病之一。PDGFRβ是周細(xì)胞損傷的標(biāo)志物［10］，主要表達(dá)于周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，尤其在周細(xì)胞呈明顯高表達(dá)［13］。而周細(xì)胞損傷所致的血腦屏障功能障礙和腦組織血供減少與AD 的早期發(fā)生密切相關(guān)［14］。觀察腦脊液PDGFRβ 含量變化，分析其與認(rèn)知損害和腦脊液生物標(biāo)志物的關(guān)系，可為AD 早期診斷和針對(duì)性干預(yù)提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，AD 組腦脊液PDGFRβ 含量高于對(duì)照組，且輕、中、重度組腦脊液PDGFRβ 含量逐漸升高，進(jìn)一步表明周細(xì)胞功能障礙促進(jìn)AD 的發(fā)生和病情進(jìn)展，腦脊液PDGFRβ 含量可在一定程度上反映AD 病情程度。Aβ 沉積是AD 的核心病理改變之一，Aβ 2 個(gè)常見的亞型Aβ1-40、Aβ1-42 也是AD 患者腦組織內(nèi)Aβ 斑塊的主要成分，Aβ1-40、Aβ1-42 及Aβ1-40/Aβ1-42 是AD 識(shí)別和診斷的重要指標(biāo)［15］。Tau 為存在于腦組織中的微管相關(guān)蛋白，主要功能為維持微管蛋白的穩(wěn)定性，其磷酸化后形成的P-tau 是AD 形成重要病理環(huán)節(jié)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，AD 組腦脊液T-tau、P-tau、Aβ1-42 含量和Aβ1-40/Aβ1-42 與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明腦脊液中上述生物蛋白均參與AD 的發(fā)生，與既往研究［17］一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著AD 病情的加重，MMSE、MoCA 評(píng)分和腦脊液Aβ1-42 含量逐呈減低趨勢(shì)，P-tau 含量呈升高趨勢(shì)，進(jìn)一步Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)AD 患者腦脊液PDGFRβ 含量與MMSE、MoCA 評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，與腦脊液P-tau 含量呈正相關(guān)。周細(xì)胞損傷或功能障礙會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的功能障礙和腦血流量的減少，腦組織血漿源性神經(jīng)毒素大量累積，誘導(dǎo)tau 過度磷酸化，P-tau 大量合成［18］。同時(shí)血腦屏障功能障礙還可導(dǎo)致Aβ 清除減少，腦組織內(nèi)Aβ 大量蓄積，Aβ 的蓄積和P-tau 組成的神經(jīng)纖維纏結(jié)使神經(jīng)細(xì)胞之間失去連接，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織內(nèi)大量神經(jīng)細(xì)胞丟失，加速神經(jīng)退行性變，導(dǎo)致或進(jìn)一步加重認(rèn)知功能減退［19-20］，因此，周細(xì)胞損傷時(shí)腦脊液PDGFRβ 含量增加，導(dǎo)致并加重認(rèn)知功能退，與MMSE、MoCA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。

ApoE 是在人類腦組織中呈高表達(dá)的一種載脂蛋白，具有抗氧化、抗動(dòng)脈硬化的作用，攜帶ApoE4 基因患者Aβ 清除減少，AD 患病風(fēng)險(xiǎn)增加，并可增強(qiáng)周細(xì)胞對(duì)Aβ 沉積等損傷性刺激的敏感性，加速周細(xì)胞損傷［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，ApoE4+和ApoE4-患者腦脊液PDGFRβ 含量差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與本研究納入樣本量較小有關(guān)，另一方面，雖然攜帶ApoE4 基因是促進(jìn)周細(xì)胞損傷重要因素，但在AD 臨床期氧化應(yīng)激、Aβ 沉積等多種因素也會(huì)促進(jìn)周細(xì)胞功能障礙，加重AD 病情，進(jìn)一步研究中尚需擴(kuò)大樣本量深入觀察。

綜上所述，AD 患者腦脊液PDGFRβ 含量增加，且與患者的認(rèn)知功能呈負(fù)相關(guān)，與腦脊液P-tau 含量呈正相關(guān)，在AD 的臨床診治中應(yīng)重視腦脊液PDGFRβ 檢測(cè)，但本研究尚未對(duì)周細(xì)胞損傷影響AD 發(fā)生和進(jìn)展的具體機(jī)制深入探討，可作為進(jìn)一步研究的方向。