李玲玲，梁偉騰，后珉紅

天津市第四中心醫(yī)院口腔科，天津300140

口腔扁平苔蘚（OLP）是口腔黏膜常見的一種慢性炎癥性疾病，全球患病率約為1.01%，好發(fā)于30～60歲女性［1］。OLP大多數(shù)為良性病變，但仍有0.8%～1.5%患者可惡變?yōu)榭谇话?，從而?yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至威脅生命安全［2］。目前，OLP 的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。普遍認(rèn)為，CD4＋T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)可參與OLP的發(fā)生、發(fā)展，而輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）失衡在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［3］。微小核糖核酸（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，能夠在翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)。miR-155-5p 是一種高度保守的miRNA，具有調(diào)控T 淋巴細(xì)胞增殖、分化及功能的作用［4］。有研究報(bào)道，在OLP 組織中miR-155-5p高表達(dá)［5］。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1（SOCS1）是細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，亦可參與調(diào)控T 淋巴細(xì)胞增殖、分化等。HU 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在OLP 組織中SOCS1 低表達(dá)。但OLP 患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平與病損程度及Th17/Treg失衡的關(guān)系仍不清楚。鑒于此，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021 年1 月—2023 年7 月天津市第四中心醫(yī)院口腔科收治的OLP 患者76例（觀察組）。OLP 診斷依據(jù)《口腔扁平苔蘚診療指南（修訂版）》［2］，其中非糜爛型 28例、糜爛型 48例（輕中度糜爛29例、重度糜爛19例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合OLP診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診；③年齡≥18 歲；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴其他口腔疾病者；②伴類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病等其他免疫炎癥性疾病者；③合并急慢性感染或惡性腫瘤者；④合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；⑤近3個(gè)月內(nèi)使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素或抗生素者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。其中，男17例、女59例，年齡22～58（48.19 ±6.20）歲。同期隨機(jī)另選在天津市第四中心醫(yī)院體檢健康的志愿者50例（對(duì)照組），男11例、女39例，年齡18～55（48.02 ± 6.07）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)天津市第四中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件編號(hào)：IRM-DWLL-2019139），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 觀察組入組次日、對(duì)照組體檢當(dāng)日，采集空腹外周靜脈血4 mL，待血液自然凝固后，取上清液，3 000 r/min離心10 min、離心半徑8 cm，留取上層血清。采用TRIzol 法提取血清總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按PrimeScript RT Master Mix 說(shuō)明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。以cDNA 為模板，按SYBR?Premix EX Taq? Ⅱ說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-155-5p 上游引物5'-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'、下游引物 5'-TTGGGTACCTTAAGTCAAGAG-3'，內(nèi)參U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；SOCS1 上游引物5'-GCCCTTAGCGTGAAGATGG-3'、下游引物5'-TGTGCGGAAGTGGTGTGTGT-3'，內(nèi)參GAPDH 上游引物5'-CTTTGGTATCGTGGAAAGACTC-3'、下游引物5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2 × SYBR Green Master PCR Mix 12.5 μL，cDNA模板5 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、64 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s共40 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6 或GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 外周血Th17、Treg 比例檢測(cè) 觀察組入組次日、對(duì)照組體檢當(dāng)日，采集空腹外周靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝并等體積稀釋后，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的小鼠抗人CD4抗體培養(yǎng)30 min。然后分別加入代表Th17 的抗IL-17A 抗體和代表Treg 的抗叉頭盒蛋白P3 抗體，避光孵育20 min。采用MACSQuant流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg 細(xì)胞占CD4 細(xì)胞比例（即Th17、Treg 比例），計(jì)算Th17/Treg。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 或Spearman 相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較 見表1。

表1 兩組血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較

2.2 不同類型OLP患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較 見表2。

表2 不同類型OLP患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA水平及外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg比較

2.3 OLP 患者血清miR-155-5p 水平與SOCS1 mRNA 水平的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，OLP 患者血清miR-155-5p 水平與血清SOCS1 mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝-0.809，P＜0.01）。

2.4 OLP 患者血清miR-155-5p、SOCS1 mRNA 水平與外周血Th17、Treg比例和Th17/Treg 的關(guān)系 OLP患者血清miR-155-5p 水平與外周血Th17 比例、Th17/Treg 均呈正相關(guān)關(guān)系（r/rs分別為0.819、0.820，P均＜0.05），與Treg 比例呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.735，P＜0.05）；血清SOCS1 mRNA 水平與外周血Th17 比例、Th17/Treg 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r/rs分別為-0.770、-0.790，P均＜0.05），與Treg 比例呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.733，P＜0.05）。

3 討論

OLP 是發(fā)生于口腔黏膜的自身免疫性、非感染性、慢性炎癥性疾病，其發(fā)病與口腔局部刺激、感染、免疫等因素有關(guān)［2］。OLP 不僅會(huì)損害口腔黏膜，口腔局部炎癥反應(yīng)還能通過(guò)血液循環(huán)引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病等，同時(shí)因口腔黏膜損傷遷延難愈還會(huì)增加口腔癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［7］。目前，對(duì)于OLP 臨床尚無(wú)根治辦法或特效治療藥物。因此，深入探索OLP 的發(fā)生機(jī)制對(duì)提高其診治水平具有重要意義。

有研究表明，CD4＋T 細(xì)胞功能異常能夠引起細(xì)胞免疫功能紊亂，通過(guò)攻擊口腔黏膜細(xì)胞導(dǎo)致口腔黏膜慢性炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)OLP 的發(fā)生、發(fā)展［3］。Th 細(xì)胞是CD4＋T 細(xì)胞被激活分化而來(lái)，能夠分泌多種細(xì)胞因子，在維持機(jī)體正常免疫功能方面發(fā)揮重要作用。其中，Th17可通過(guò)分泌IL-17A～I(xiàn)L-17F、IL-21、IL-22、IL-26、TNF-α、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；Treg通過(guò)分泌IL-10、IL-35、叉頭盒蛋白P3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 等抗炎細(xì)胞因子，抑制炎癥反應(yīng)，具有很強(qiáng)的免疫抑制活性。正常免疫狀態(tài)下，Th17/Treg 處于動(dòng)態(tài)平衡，Th17/Treg 失衡則會(huì)引起CD4＋T 細(xì)胞功能異常，從而導(dǎo)致OLP的發(fā)生、發(fā)展［8-9］。本研究結(jié)果顯示，OLP患者外周血Th17 比例和Th17/Treg 明顯升高，二者隨著病損程度增加而逐漸升高；而外周血Treg 比例明顯降低，并且隨著病損程度增加而逐漸降低。結(jié)果表明，OLP 患者外周血Th17/Treg 明顯失衡，并且Th17/Treg失衡與OLP病損程度增加有關(guān)，與既往研究［8-9］報(bào)道一致。

miRNA 是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，可通過(guò)與靶mRNA 的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合而抑制mRNA 翻譯或促進(jìn)其降解［10］。miR-155-5p 屬于miRNA 家族成員之一，定位于人染色體21q21.3。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p 在激活的免疫細(xì)胞中高表達(dá)，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，而敲除miR-155-5p 則會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能破壞，提示miR-155-5p 對(duì)維持機(jī)體免疫功能十分重要［11］。ZHENG 等［12］研究報(bào)道，上調(diào)miR-155-5p表達(dá)能夠促進(jìn)CD4＋T 細(xì)胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，導(dǎo)致慢性牙周炎患者外周血Th17/Treg 失衡。ZHU等［13］研究發(fā)現(xiàn)，沉默miR-155-5p 表達(dá)能夠抑制CD4＋T 細(xì)胞向Th17 分化，并促進(jìn)其向Treg 分化，進(jìn)而減輕炎癥性腸病患者外周血Th17/Treg 失衡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清miR-155-5p 水平明顯高于對(duì)照組，與其在OLP 組織中的表達(dá)變化一致［5］。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，非糜爛型OLP 及糜爛型OLP 輕中度糜爛、重度糜爛患者血清miR-155-5p 水平逐漸升高，提示血清miR-155-5p 水平升高與OLP 病損程度增加有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OLP 患者血清miR-155-5p水平與外周血Th17 比例和Th17/Treg 呈正相關(guān)關(guān)系，與Treg 比例呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示血清miR-155-5p 水平升高可能通過(guò)誘導(dǎo)外周血Th17/Treg 失衡參與OLP 的發(fā)生、發(fā)展。究其原因，血清miR-155-5p 水平升高能夠誘導(dǎo)初始CD4＋T 細(xì)胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，從而導(dǎo)致外周血Th17/Treg失衡。

SOCS 家族是一類能夠反饋性阻斷細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，包括SOCS1～SOCS7及CIS等成員。SOCS1 在T 細(xì)胞分化、發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，SOCS1 缺失可導(dǎo)致T 細(xì)胞分化和發(fā)育異常［14］。既往研究報(bào)道，SOCS1 能夠抑制CD4＋T 細(xì)胞向Th17分化并促進(jìn)其向Treg分化，而SOCS1缺陷或缺失則會(huì)導(dǎo)致Th17/Treg 失衡［15］。因此，SOCS1 對(duì)CD4＋T 細(xì)胞分化發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清SOCS1 mRNA 水平明顯低于對(duì)照組，與其在OLP 組織中表達(dá)變化一致［6］。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，非糜爛型OLP 及糜爛型OLP 輕中度糜爛、重度糜爛患者血清SOCS1 mRNA 水平逐漸降低，提示血清SOCS1 mRNA 水平降低與OLP 病損程度增加有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OLP 患者血清SOCS1 mRNA 水平與外周血Th17 比例和Th17/Treg呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與Treg 比例呈正相關(guān)關(guān)系，提示血清SOCS1 mRNA 水平降低可能通過(guò)誘導(dǎo)外周血Th17/Treg 失衡而參與OLP 的發(fā)生、發(fā)展。究其原因，血清SOCS1 mRNA 水平降低能夠誘導(dǎo)初始CD4＋T 細(xì)胞向Th17 分化，并抑制其向Treg 分化，從而導(dǎo)致外周血Th17/Treg失衡。本研究還發(fā)現(xiàn)，OLP患者血清miR-155-5p 水平與血清SOCS1 mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-155-5p 和SOCS1 可能通過(guò)調(diào)節(jié)外周血Th17/Treg 平衡而參與OLP 的發(fā)生、發(fā)展。近年研究表明，miR-155-5p 與SOCS1 具有靶向調(diào)控關(guān)系，如在系統(tǒng)性硬化癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，miR-155-5p高表達(dá)能夠靶向下調(diào)SOCS1表達(dá)而導(dǎo)致Th17/Treg 失衡［16-17］。最近CHENG 等［18］研究亦指出，miR-155-5p 能夠通過(guò)靶向抑制SOCS1 表達(dá)而誘導(dǎo)口腔黏膜上皮細(xì)胞分泌炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)OLP的發(fā)生、發(fā)展。但二者在OLP 發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制及靶向調(diào)控關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，OLP患者血清miR-155-5p水平升高、血清SOCS1 mRNA 水平降低，二者水平變化與病損程度加重和Th17/Treg失衡密切相關(guān)。